捕食線蟲性真菌生物凍干制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，提出一種捕食線蟲性真菌生物凍干制劑的制備方法，即首先將實(shí)驗(yàn)室分離保存的捕食線蟲性真菌Duddingtonia?flagrans?CIM1菌株在大麥粒培養(yǎng)基上進(jìn)行厚壁孢子批量培養(yǎng)，然后用凍干保護(hù)劑洗脫并保護(hù)厚壁孢子，再進(jìn)行分裝滅菌、預(yù)凍、真空冷凍干燥后獲得。本發(fā)明成功制備了具有捕食線蟲功能的捕食線蟲性真菌—Duddingtonia?flagrans生物凍干制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該凍干制劑既可以保持菌株活性，又可以在常溫下運(yùn)輸和保存，且使用方便，具有很好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
【專利說(shuō)明】捕食線蟲性真菌生物凍干制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種捕食線蟲的真菌、由該真菌獲得的制劑?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]動(dòng)物寄生蟲病是家畜的一大類嚴(yán)重疾病，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重危害。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)家畜寄生性線蟲的防治主要依靠化學(xué)藥物，并發(fā)揮了巨大的作用。但是隨著化學(xué)驅(qū)蟲藥產(chǎn)生的抗藥性、藥物殘留及環(huán)境污染等問(wèn)題日益嚴(yán)重，已經(jīng)引起人們的廣泛認(rèn)識(shí)，因此利用捕食線蟲性真菌對(duì)線蟲的生物拮抗作用來(lái)防治動(dòng)物寄生線蟲已備受關(guān)注。
[0003]捕食線蟲性真菌是由孢子萌發(fā)生長(zhǎng)出營(yíng)養(yǎng)菌絲，然后形成捕食器官進(jìn)而捕食線蟲，并通過(guò)內(nèi)寄生方式消解線蟲和產(chǎn)生毒素毒殺線蟲等方式獲得生存的一類微生物。正是因?yàn)榇祟愓婢倪@個(gè)特點(diǎn)，所以在寄生性線蟲防治方面，捕食線蟲性真菌是一個(gè)國(guó)家極其重要的寶貴生物資源。因?yàn)椴妒尘€蟲性真菌在培養(yǎng)基中，菌種仍繼續(xù)發(fā)育生長(zhǎng)，這樣就會(huì)不斷消耗其自身營(yíng)養(yǎng)，使得其捕食性能下降，而且在此過(guò)程中極易發(fā)生污染。所以目前在捕食線蟲性真菌臨床應(yīng)用中所面臨的重要問(wèn)題是如何制備一種能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的捕食線蟲性真菌生物制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)本領(lǐng)域存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提出一種捕食線蟲性真菌凍干制劑的制備方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提出含有捕食線蟲性真菌菌株厚壁孢子的真菌生物凍干制劑。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為:
[0007]一種捕食線蟲性真菌生物凍干制劑的制備方法，其特征在于，是將捕食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans CIMl菌株在大麥粒培養(yǎng)基上進(jìn)行厚壁孢子的批量培養(yǎng)，然后用凍干保護(hù)劑洗脫并保護(hù)厚壁孢子，再分裝滅菌、預(yù)凍、真空冷凍干燥后獲得。
[0008]本發(fā)明提出的制備方法,可以制備含有任一種捕食線蟲性真菌(Duddingtoniaflagrans)菌株的凍干制劑。優(yōu)選的，使用如下菌株:
[0009]一種捕食線蟲性真菌(Duddingtoniaflagrans)菌株,該菌株(菌株名稱為CIM1)的保藏號(hào)為=CGMCC N0.9201，保藏日期:2014年5月5日。
[0010]所述菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，電話:
(010)64807355。
[0011]所述捕食線蟲性真菌(Duddingtoniaflagrans)系發(fā)明人從內(nèi)蒙古土壤中分離篩選后經(jīng)純化得到的。該菌株(菌株名稱為CIM1)具有如下特性:Duddingtonia flagrans菌株生長(zhǎng)溫度范圍為在15~35°C間均能生長(zhǎng)，其中以35°C環(huán)境下生長(zhǎng)率最高。Duddingtoniaflagrans菌絲呈放射狀地向周圍生長(zhǎng)，縱橫交錯(cuò)，清晰可見(jiàn)，主干較粗，分支較細(xì)；菌絲無(wú)色分隔。外觀白色至灰粉紅色，生長(zhǎng)后期有纏繞圈的形成，并可發(fā)現(xiàn)少數(shù)厚壁孢子著生于菌絲細(xì)胞之間。參見(jiàn)圖1。
[0012]其中，所述大麥粒培養(yǎng)基的制備方法為:將大麥粒清洗干凈，置干燥箱中烘干，按照大麥粒質(zhì)量和蒸餾水體積1:1的比例加入蒸餾水，并將裝有蒸餾水和大麥粒的容器于120~125°C滅菌20min后即得。所述的大麥粒是完整的大麥粒，或破碎的、部分破碎的大麥粒均可。
[0013]所述的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子批量培養(yǎng)可采用本領(lǐng)域公知的手段進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選的，Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子批量培養(yǎng)的條件為20~30°C,每天搖動(dòng)1-3次，培養(yǎng)20~25天。
[0014]批量培養(yǎng)過(guò)程中，用手搖動(dòng)即可，以防培養(yǎng)基板結(jié)。
[0015]其中，所述凍干保護(hù)劑由體積份的蒸餾水1000份和吐溫-802份組成。
[0016]其中，所述預(yù)凍是在_80°C下預(yù)凍2小時(shí)。
[0017]所述真空冷凍干燥可采用常規(guī)的冷凍干燥方法進(jìn)行。優(yōu)選的，所述真空冷凍干燥的條件為:壓強(qiáng) 130X KT3Hibar ~135X l(T3mbar，在 _48°C至 _55°C下，凍干 18_25h。優(yōu)選凍干20h。
[0018]本發(fā)明所述的制備方法制備得到的捕食線蟲性真菌生物凍干制劑。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:
[0020]本發(fā)明提出的捕食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans菌株的菌絲受線蟲幼蟲螺動(dòng)刺激后，形成捕食器，對(duì)幼蟲進(jìn)行捕捉，隨后菌絲侵入蟲體內(nèi)部，開(kāi)始對(duì)線蟲進(jìn)行消解和吸收，最后導(dǎo)致線蟲死亡。
[0021]本發(fā)明成功制備了具有捕食線蟲功能的真菌生物凍干制劑一捕食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans生物凍干制劑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該凍干制劑既可以保持菌株活性,又可以在常溫下運(yùn)輸和保存，且使用方便，具有很好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明Duddingtonia flagrans菌株生長(zhǎng)情況顯微照片。
[0023]圖2為本發(fā)明真菌生物凍干制劑的產(chǎn)品照片。
【具體實(shí)施方式】
[0024]現(xiàn)以以下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中使用的手段，如無(wú)特別說(shuō)明，均使用本領(lǐng)域常規(guī)的手段。
[0025]凍干機(jī),美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。
[0026]凍干保護(hù)劑:蒸餾水1000mL和吐溫_802mL。
[0027]實(shí)施例1:Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子的批量培養(yǎng)
[0028](I)大麥粒培養(yǎng)基的制備:將完整大麥粒清洗干凈，置干燥箱中烘干，分裝于250mL三角瓶中，每瓶70g，各加蒸餾水70mL。將裝有蒸餾水和大麥粒的三角瓶于121°C滅菌 20min。
[0029] (2)接種培養(yǎng)基:在無(wú)菌條件下，將實(shí)驗(yàn)室分離保存的捕食線蟲性真菌-Duddingtonia flagrans CIMl菌株,制備成混懸液,接種于上述制備好的培養(yǎng)基中，并用滅菌玻璃棒攪拌，使混懸液均勻分布于培養(yǎng)基中，置25°C恒溫箱中培養(yǎng),每天搖晃培養(yǎng)基三次以防板結(jié)。
[0030](3)用凍干保護(hù)劑洗脫并保護(hù)厚壁孢子:在厚壁孢子培養(yǎng)至第3周時(shí)，在無(wú)菌條件下取3g培養(yǎng)基，用凍干保護(hù)劑(蒸餾水1000份和吐溫-802份配成)進(jìn)行厚壁孢子的洗脫，收集孢子洗脫液混勻后，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，得出培養(yǎng)基所含厚壁孢子數(shù)量為3.2X105個(gè)/g。
[0031]實(shí)施例2.Dudding tonia flagrans菌株凍干制劑的制備
[0032]用實(shí)施例1獲得的厚壁孢子進(jìn)行制備。
[0033](I)準(zhǔn)備凍干安瓿瓶:選用7mL凍干安瓿瓶20個(gè)，用10% HCl浸泡8~10h，再用自來(lái)水沖洗數(shù)次，最后用蒸餾水浸泡至PH中性，干燥后貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間，和凍干安瓿瓶蓋一起于121°C高壓滅菌20min后備用。
[0034](2)對(duì)實(shí)施例1獲得的含有厚壁孢子的洗脫液進(jìn)行離心濃縮，轉(zhuǎn)速4000r/min，離心 20min。
[0035](3)分裝滅菌:用移液器直接將離心好的厚壁孢子混懸液滴入凍干安瓿瓶底部，注意不要濺污上部瓶壁，每瓶分裝量為2mL，分裝時(shí)間盡量要短。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。
[0036](4)預(yù)凍:將凍干安瓿瓶置于_80°C冰箱中預(yù)凍2h。
[0037](5)真空冷凍干燥:完成預(yù)凍后，開(kāi)動(dòng)凍干機(jī)，打開(kāi)“FRIGE”開(kāi)關(guān)，此時(shí)溫度顯示屏為紅燈，等待紅燈逐漸上升變?yōu)榫G色，此時(shí)溫度為_(kāi)50°C左右。將凍干玻璃瓶蓋拔開(kāi)一些，放入凍干箱內(nèi)并確保凍干箱的密閉性。打開(kāi)“PUMP”開(kāi)關(guān)以及真空泵的閥門，等待氣壓顯示屏指示燈變?yōu)榫G色，此時(shí)壓強(qiáng)為133X10_3mbar。凍干20h，待樣品變?yōu)楦稍锓勰顣r(shí)，關(guān)閉真空泵閥門，“FRIGE”，“PUMP”開(kāi)關(guān)即可取出。將凍干玻璃瓶蓋立即蓋緊，置_20°C冰箱保存。
[0038]產(chǎn)品照片見(jiàn)圖2。成品Duddingtonia flagrans生物凍干制劑保存在凍干安瓿瓶?jī)?nèi)，為黃色疏松多孔的海綿狀物質(zhì)，瓶?jī)?nèi)為真空狀態(tài)，平均每瓶的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子數(shù)量為1.5 X IO6個(gè)。
[0039]實(shí)施例3:Duddingtonia flagrans菌株凍干制劑的復(fù)蘇效果觀察
[0040]實(shí)驗(yàn)組:實(shí)施例1制備的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子凍干制劑。
[0041]對(duì)照組:自然狀態(tài)下未經(jīng)凍干的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子。
[0042]空白對(duì)照組:等量無(wú)菌注射用水。
[0043](I)萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)
[0044]0.4g/L玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)制備:取新鮮玉米粉40g，加蒸餾水1000mL,微火煮沸l(wèi)h，補(bǔ)足水分至1000mL，450目紗網(wǎng)過(guò)濾。取濾液10mL，加蒸餾水990mL，調(diào)節(jié)PH值為6.0~6.2，再加20g瓊脂粉，經(jīng)121 °C高壓滅菌20min后，傾注于滅菌的培養(yǎng)皿中，4°C放置備用。
[0045]實(shí)驗(yàn)方法:在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌注射用水稀釋凍干后的Duddingtonia flagrans菌株厚壁孢子，吸取20個(gè)厚壁孢子接種到直徑為60mm的CMA固體培養(yǎng)基平皿中，共接種3個(gè)，作為實(shí)驗(yàn)組；將同一批培養(yǎng)洗脫的未凍干的厚壁孢子，以同樣的方法接種另外3個(gè)培養(yǎng)基，作為對(duì)照組；同時(shí)設(shè)只加無(wú)菌注射用水的空白對(duì)照組。然后放于25°C恒溫培養(yǎng)箱中，每天定時(shí)觀察并記錄各組孢子的平均萌發(fā)個(gè)數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率。結(jié)果見(jiàn)表1。[0046]表1Duddingtonia flagrans菌株凍干制劑萌發(fā)率的觀察結(jié)果
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種捕食線蟲性真菌生物凍干制劑的制備方法，其特征在于，將捕食線蟲性真菌Duddingtonia f Iagrans菌株進(jìn)行厚壁孢子(厚垣孢子)批量培養(yǎng)，然后用凍干保護(hù)劑洗脫并保護(hù)厚壁孢子，再分裝滅菌、預(yù)凍、真空冷凍干燥后獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于所述DuddingtoniafIagrans菌株的保藏號(hào)為:CGMCCN0.9201。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述大麥粒培養(yǎng)基的制備方法為:將大麥粒清洗干凈，置干燥箱中烘干，按照大麥粒質(zhì)量和蒸餾水體積1:1的比例加入蒸餾水，將裝有蒸餾水和大麥粒的容器于120~125°C滅菌20min后即可獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，DuddingtoniafIagrans菌株厚壁孢子批量培養(yǎng)的條件為:20~30°C溫度下，每天搖動(dòng)1-3次，培養(yǎng)20~25天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述凍干保護(hù)劑由體積份的蒸餾水1000份和吐溫-802份組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述預(yù)凍是在_80°C下預(yù)凍2小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的制備方法，其特征在于，所述真空冷凍干燥的條件為:壓強(qiáng) 130 X KT3Hibar ~135 X l(T3mbar，在 _48°C至 _55°C下，凍干 18_25h。
8.權(quán)利要求1-7 任一所述的制備方法制備得到的捕食線蟲性真菌生物凍干制劑。
【文檔編號(hào)】A01P5/00GK104004663SQ201410227501
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】楊曉野, 王瑞, 楊蓮茹, 張偉 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)