用于狗肝銅積累的遺傳檢測和低銅寵物飲食的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于狗肝銅積累的遺傳檢測和低銅寵物飲食。本發(fā)明提供了檢測狗以測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性方法，其包括在樣品中檢測在狗基因組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏：(a)SNPATP7A_Reg3_F_6(SEQIDNO:142)和(b)與(a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。
【專利說明】用于狗肝銅積累的遺傳檢測和低銅寵物飲食
[0001] 本申請是申請日為2010年4月7日的中國專利申請201080025445. 5 "用于狗肝 銅積累的遺傳檢測和低銅寵物飲食"的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及測定狗受到免于肝銅積累和免于銅相關(guān)肝疾病的保護(hù)的可能性的方 法。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防狗肝銅積累和銅相關(guān)肝疾病的狗用食品和制造所述食品的方 法。

【背景技術(shù)】
[0003] 盡管肝疾病在狗中不常見，但其最常見的形式之一是慢性肝炎（CH)。CH是一種組 織學(xué)診斷，其特征在于纖維化、炎癥和肝細(xì)胞凋亡和壞死的存在。此疾病的最終階段可導(dǎo)致 肝硬化。CH的病因之一是肝銅積累。肝銅積累可由于提高的銅攝入、肝銅代謝的原發(fā)性代 謝缺陷或改變的銅膽汁排泄導(dǎo)致。在后一種情況中，銅毒性對于肝臟炎癥、纖維化和膽汁淤 積是繼發(fā)性的，盡管不清楚這在狗中發(fā)生到何種程度。在繼發(fā)性銅貯積病中，銅積累主要限 于門脈周實(shí)質(zhì)（periportal parenchyma),并且肝銅濃度低于家族積病中的積累。雖然起 始因子和敏化抗原的性質(zhì)未知，但是原發(fā)性膽汁性肝硬變中觀察到的免疫學(xué)異常和形態(tài)學(xué) 特征與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制并發(fā)。
[0004] 小腸被認(rèn)為是哺乳動物中飲食銅吸收的主要部位。從腸腔向腸粘膜的運(yùn)輸是載體 介導(dǎo)的過程，涉及可飽和的運(yùn)輸組分。一旦在粘膜細(xì)胞中大約80%的新吸收的銅在細(xì)胞質(zhì) 中，其主要與金屬硫蛋白（MT)結(jié)合。這些是低分子量的可誘導(dǎo)的蛋白，具有許多功能，包 括金屬的動態(tài)平衡、儲存、運(yùn)輸和解毒。在通過腸后，銅進(jìn)入門脈循環(huán)，在那里銅結(jié)合載體蛋 白肽和氨基酸并被運(yùn)輸至肝，較少量進(jìn)入腎。在大多數(shù)哺乳動物中，銅被容易地排泄，銅主 要排泄途徑是膽汁。
[0005] 肝銅積累的遺傳基礎(chǔ)未知。其困難之處在于在大量不同的生物學(xué)途徑中涉及銅， 各途徑都高度復(fù)雜并涉及大量基因的事實(shí)。通常用D-青霉胺，一種有效的銅螯合劑來治療 具有過量肝銅積累的狗。但是，最終，最成功的可用于患有CH的狗的治療是肝移植。
[0006] WO 2009/044152 A2公開了測定狗對肝銅積累的敏感性的方法，其包括檢測（a)在 狗的G0LGA5，ATP7A或UBL5基因中的指示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性和/或（b)與所 述多態(tài)性（a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏，以及從而測定狗對肝銅積累的敏感 性。國際申請?zhí)朠CT/GB09/02355 (還未出版）公開了另外的多態(tài)性用于測定狗對肝銅積 累的敏感性的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]
【發(fā)明者】已發(fā)現(xiàn)犬ATP7A基因中一個編碼突變，其與狗肝銅低水平相關(guān)并因此指示 免于肝銅積累的保護(hù)。該突變是單核苷酸多態(tài)性（SNP)，其引起蛋白質(zhì)中一個氨基酸的改 變。在該文所述研究中，多態(tài)性已顯示對細(xì)胞中的銅運(yùn)輸具有功能性作用。在ATP7A基因 中該多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)提供了通過篩選該多態(tài)性和/或與多態(tài)性處于連鎖不平衡的一種或多 種多態(tài)性預(yù)測狗是否受到免于肝銅積累的保護(hù)的檢測的基礎(chǔ)。
[0008]
【發(fā)明者】最近還發(fā)現(xiàn)在犬G0LGA5、ATP7A和UBL5基因或其區(qū)域中的多態(tài)性與肝銅的 高水平相關(guān)，并且因此指示了對肝銅積累的敏感性（W0 2009/044152 A2和未出版的國際申 請?zhí)朠CT/GB09/02355)。因此，將檢測狗中一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性的 結(jié)果與對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性的結(jié)果組合的遺傳檢測應(yīng)對狗處于肝銅積累的風(fēng)險(xiǎn) 的可能性特別具有信息性。
[0009] 在狗肝中的銅積累可導(dǎo)致一種或多種由高肝銅引起的肝疾病或病癥。例如，高肝 銅可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和最終的肝功能衰竭。本發(fā)明因此能夠鑒定不受到免于這些與 高銅相關(guān)的肝疾病或病癥的保護(hù)或處于發(fā)生這些與高銅相關(guān)的肝疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的狗。 一旦鑒定了狗不具有免于肝銅積累的保護(hù)的突變指示，有可能對該狗確定合適的預(yù)防措施 以將肝銅水平維持在低或正常水平，例如通過施用本發(fā)明的食品。此外，鑒定為具有與免于 肝銅積累的保護(hù)相關(guān)的突變的狗可理想地用于育種程序，目的在于產(chǎn)生不太可能患與高銅 相關(guān)的肝疾病或其它病癥的狗。
[0010] 本發(fā)明因此提供了檢測狗以測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法， 其包括在樣品中檢測在狗基因組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏：(a) SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和（b)與（a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。 [0011] 本發(fā)明還提供： - 數(shù)據(jù)庫，其包含與SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和/或與其處于連鎖不 平衡的一種或多種多態(tài)性及它們與保護(hù)狗免于肝銅積累的聯(lián)系相關(guān)的信息。； - 測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，其包括： (a) 將與狗基因組中存在或缺乏如本文定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)； (b) 將數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫比較，所述數(shù)據(jù)庫包含與所述多態(tài)性及它們與保護(hù)狗免于 肝銅積累、或狗對肝銅積累的敏感性的聯(lián)系相關(guān)的信息；和 (c) 基于所述比較測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性； - 計(jì)算機(jī)程序，其包含這樣的程序編碼裝置，即當(dāng)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行時(shí)，所述程序 編碼裝置命令計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明的方法； - 計(jì)算機(jī)存儲介質(zhì)，其包含本發(fā)明的計(jì)算機(jī)程序和本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫； - 被設(shè)置以進(jìn)行本發(fā)明方法的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含： (a) 接收與狗基因組中存在或缺乏如本文定義的多態(tài)性相關(guān)的數(shù)據(jù)的裝置； (b) 數(shù)據(jù)庫，其包含與所述多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性及 它們與保護(hù)狗免于肝銅積累、或狗對肝銅積累的敏感性的聯(lián)系相關(guān)的信息； (c) 用于將數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫比較的模塊；和基于所述比較測定狗受到免于肝銅積累的保 護(hù)的可能性的裝置； - 檢測狗以測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，其包括檢測狗基因 組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏：（a) SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142)和（b)與（a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性；和 - 如本文定義的多態(tài)性在測定狗對肝銅積累的敏感性中的用途；和 - 選擇用于產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的狗的方法，其包括： -根據(jù)本發(fā)明測定候選的第一只狗的基因組中是否包含指示保護(hù)免于肝銅積累的一 種或多種多態(tài)性；和由此測定候選的第一只狗是否適合產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù) 的后代； -任選地，根據(jù)本發(fā)明測定與第一只狗性別相反的第二只狗的基因組中是否包含指示 保護(hù)免于肝銅積累的一種或多種多態(tài)性；和 -任選地，將第一只狗和第二只狗交配以產(chǎn)生可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代。
[0012] 此外，并且令人驚訝地，
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)了比使用藥物青霉胺更有效地降低拉布拉多 尋回犬（Labrador Retriever)的肝銅濃度的食品。此食品因此在預(yù)防拉布拉多尋回犬品 種狗的肝銅積累中有用，并可用于預(yù)防與高肝銅相關(guān)的疾病或病癥，例如慢性肝炎、肝硬化 和肝功能衰竭。
[0013] 由此，本發(fā)明還提供了包含4. 5至12 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食品，所述食品用 于在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病的方法，優(yōu)選 地，其中所述狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性已通過本發(fā)明的方法測定。
[0014] 本發(fā)明還提供： - 在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病的方法， 優(yōu)選地，其中所述狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性已通過本發(fā)明的方法測定，所述方 法包括對狗喂食本發(fā)明的食品； -銅在制造食品中的用途，所述食品用于具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗，優(yōu) 選地，其中所述狗通過本發(fā)明的方法已被測定為對肝銅積累敏感，其中所述食品包含4. 5 至12 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅并用于預(yù)防在所述狗中由肝銅積累導(dǎo)致的疾??； -包含具有4. 5至12 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食物和提供至少120mg/kg干物質(zhì)濃 度的鋅的補(bǔ)充劑的套裝，所述食物和鋅補(bǔ)充劑用于同時(shí)、分別或相繼使用以在具有拉布拉 多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病，優(yōu)選地，其中所述狗受到免于 肝銅積累的保護(hù)的可能性已通過本發(fā)明的方法測定；和 -本發(fā)明的帶標(biāo)簽的食品或本發(fā)明的帶標(biāo)簽的套裝。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1說明不加治療的肝銅積累的進(jìn)展。該圖顯示了在任何治療以前，在相隔8. 7 個月（范圍為6-15個月）的2次檢查中11只拉布拉多尋回犬的肝銅濃度（mg/kg干重)。在 此時(shí)間內(nèi)對所有動物喂食它們通常的維持飲食，根據(jù)制造商其包含以干物質(zhì)計(jì)12-25 mg/ kg之間的飲食銅濃度和以干物質(zhì)計(jì)80-270 mg/kg之間的鋅濃度。菱形符號表示離群值。
[0016] 圖2說明24只拉布拉多尋回犬在研究開始和飲食管理中的2次控制檢查中的肝 銅濃度（mg/kg干重)。將狗如下分為2組：組1=飲食+葡萄糖酸鋅片，組2=飲食+安慰劑。 X-軸編號的解釋如下：1+2=治療前，3+4=復(fù)查1(8個月后的第一次控制檢查(范圍為5-13 個月）），5+6=復(fù)查2(16個月后的第二次控制檢查(范圍為12-25個月））。檢測的狗數(shù)目如 下：1 :在組1中N=12只狗，2 :在組2中N=12只狗，3 :在組1中N=9只狗，4 :在組2中N=12 只狗，5 :在組1中N=6只狗，6 :在組2中N=IO只狗。菱形符號表示離群值。點(diǎn)線代表成年 狗的肝銅正常水平。
[0017] 圖3說明在18只拉布拉多尋回犬中本發(fā)明的飲食與青霉胺單獨(dú)作用相比對肝銅 濃度（mg/kg干重）的有效性。x-軸的解釋如下：1=青霉胺前，2=青霉胺后/食物前,3=食 物后。沿X-軸從1至2的發(fā)展證明青霉胺的作用，而從2至3的發(fā)展證明食物的作用。點(diǎn) 線代表成年狗的肝銅正常水平。
[0018] 圖4說明布置用于實(shí)施本發(fā)明的功能組分的圖表實(shí)施方案。
[0019] 圖5描繪了在拉布拉多尋回犬中根據(jù)性別和ATP7A基因型的平均銅水平(表VII 的數(shù)據(jù))。y-軸為肝銅干重(mg/kg)。X-軸為ATP7A基因型：從左到右，前3個為研究中的 雌性狗，最后2個為研究中的雄性狗。誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0020] 圖6為在拉布拉多尋回犬中根據(jù)性別和ATP7A基因型的銅組織學(xué)得分的箱形圖 (表VII的數(shù)據(jù))。y-軸為銅組織學(xué)得分值。X-軸為ATP7A基因型：從左到右，前3個為研 究中的雌性狗，最后2個為研究中的雄性狗。kruskal-walis p值為0. 000396。
[0021] 圖7A和7B顯示在狗原代成纖維細(xì)胞中銅同位素測量。在（A)用10 μΜ、50 μΜ和 100 μΜ 64Cu孵育24 h或48小時(shí)或（B)孵育24小時(shí)，隨后在無銅同位素培養(yǎng)基中充分洗 滌和孵育2小時(shí)之后，在ATP7Ae/e、ATP7A e/T和ΑΤΡ7Ατ/τ細(xì)胞中進(jìn)行銅同位素（64Cu)測量。 借助于蛋白和MTS測定對細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行Y-計(jì)數(shù)校正。24小時(shí)孵育的數(shù)據(jù)點(diǎn)代表兩份 重復(fù)進(jìn)行的兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM并表示為全細(xì)胞蛋白每分鐘的計(jì)數(shù)（cpm)。其他 數(shù)據(jù)點(diǎn)代表兩份重復(fù)中來自一次實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM。
[0022] 圖7C和7D顯示在人原代成纖維細(xì)胞中銅同位素測量。在（C)用10 μΜ、50 μΜ和 100 μΜ 64Cu孵育24 h或48小時(shí)或（D)孵育24小時(shí)，隨后在無銅同位素培養(yǎng)基中充分洗 滌和孵育2小時(shí)之后，在衍生自Menkes患者或非Menkes患者（對照）的原代成纖維細(xì)胞 中進(jìn)行銅同位素^4Cu)測量。借助于蛋白測定對細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行Y-計(jì)數(shù)校正。數(shù)據(jù) 點(diǎn)如⑷和⑶表示。
[0023] 圖8顯示在狗原代成纖維細(xì)胞中ATP7A的基因表達(dá)水平。（A) ATP7Ae/e、ATP7Ae/T 和ΑΤΡ7Ατ/τ細(xì)胞未處理（上圖）或在100 μΜ銅存在下孵育24小時(shí)（下圖），然后進(jìn)行3' (ATP7Aiii)區(qū)域、5'（ATP7Aii)區(qū)域或重疊突變的區(qū)域（ATP7Ai)的qPCR分析。數(shù)據(jù)描 述了來自在三份重復(fù)的孔中進(jìn)行的兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+/_ SD。（B) ATP7A表達(dá)的蛋白 質(zhì)印跡分析。細(xì)胞未處理（-)、用100 μΜ BCS或100 μΜ銅孵育24小時(shí)。裂解樣品，隨 后將蛋白在12 % SDS-PAGE凝膠上分離和用雞抗-ΑΤΡ7Α (1:2000稀釋）免疫印跡1小時(shí)。 然后用山羊抗雞Ig HRP-綴合的抗體（1:10, 000稀釋）孵育膜另外1小時(shí)然后使用ECLtm 蛋白質(zhì)印跡檢測試劑顯色。將膜洗脫（stripped)并用β-微管蛋白（1:20,000稀釋）在 標(biāo)記以確保等量上樣。箭頭表示期望的全長蛋白。
[0024] 圖9提供在狗原代成纖維細(xì)胞中金屬硫蛋白的基因表達(dá)水平。ATP7Ae/e、ATP7A e/T 和ΑΤΡ7Ατ/τ細(xì)胞在1、10或100 μΜ銅存在下孵育或未處理（UT) 24小時(shí)并進(jìn)行金屬硫蛋 白基因的qPCR分析。圖9 (A)描述了與UT ATP7AG/G相比較的倍數(shù)變化，具有95%置信區(qū) 間（CI)，（B)描述了與UT ΑΤΡ7Α?Β?表達(dá)相比較的倍數(shù)變化，具有95% CI，和（C)描述了 IoglO表達(dá)水平，具有95%置信區(qū)間（Cl)。在（C)中，圖中上部線是基因型ΑΤΡ7Ατ/τ，中部 線是ATP7A e/T和下部線ATP7Ae/e。
[0025] 圖10圖示了在狗腸和肝組織中金屬硫蛋白的基因表達(dá)水平。（A)肝和（B)小腸 組織從表達(dá)ATP7A e/e、ATP7Ae/T或ΑΤΡ7Ατ/τ ATP7A的狗提取并進(jìn)行金屬硫蛋白基因的qPCR 分析。數(shù)據(jù)描述了來自5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的IoglO表達(dá)水平的平均值和95% Cl (右圖）和與 ATP7Ae/e相比較的倍數(shù)變化，具有95 % Cl。
[0026] 圖11是銅介導(dǎo)的ATP7蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)的特征。ATP7A?（左圖）和ΑΤΡ7Ατ/τ (右圖） 細(xì)胞在100 μΜ BCS存在下在載玻片上生長18小時(shí)，然后在培養(yǎng)基中洗滌和用100 μΜ銅 孵育1、2或3小時(shí)。固定細(xì)胞并用抗-ΑΤΡ7Α (每幅圖中的第一列）和抗-58Κ (每幅圖中的 第二列）抗體染色，并進(jìn)行三標(biāo)記間接顯微鏡檢查，然后使用表面熒光顯微鏡觀察。ΑΤΡ7Α 和58Κ的圖像合并以描述重疊區(qū)域（每幅圖中的第三列）。
[0027] 序列簡述 SEQ ID NO: 1至143顯示了包含本發(fā)明SNP的多核苷酸序列。
[0028] SEQ ID NOs: 144 至 159 是引物序列。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 鑒定免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的敏感性 在肝中的銅積累在許多狗品種中導(dǎo)致肝疾病，所述狗品種包括拉布拉多尋回犬、杜 賓犬（Doberman Pinscher)、德國牧羊犬（German Shepherd)、荷蘭獅毛犬（Keeshond)、 可卡犬（Cocker Spaniel)、西部高地白梗（West Highland White Terrier)、貝靈頓梗 (Bedlington Terrier)和斯凱梗（Skye Terrier)。任意品種的正常狗的肝內(nèi)平均銅濃度 為以干重計(jì)200至400 mg/kg，盡管新生狗通常具有較高的肝銅濃度。狗的肝內(nèi)銅的量可通 過活檢測量。
[0030] 受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗具有積累肝銅的低風(fēng)險(xiǎn)或可能性，從而其肝銅濃度 不太可能達(dá)到高于以干重計(jì)400mg/kg的水平。受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗的肝銅濃度 將低于600 mg/kg，例如低于500 mg/kg、400 mg/kg、或低于300 mg/kg。根據(jù)本發(fā)明測定狗 受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性涉及測定下述可能性，即狗將積累肝銅至低于600mg/kg 的水平，例如低于500 mg/kg、400 mg/kg、或低于300 mg/kg。
[0031] 對肝銅積累敏感的狗具有積累銅的傾向，從而其肝銅濃度達(dá)到高于以干重計(jì)400 mg/kg的水平。測定狗對肝銅積累敏感的風(fēng)險(xiǎn)或可能性涉及測定下述風(fēng)險(xiǎn)或可能性，即狗將 積累肝銅至高于400mg/kg的水平，例如高于600mg/kg、高于800mg/kg、高于1000mg/kg、高 于 1500mg/kg、高于 2000mg/kg、高于 5000mg/kg 或高于 10000mg/kg。
[0032] 肝銅積累可通過組織化學(xué)評估。例如，肝銅濃度可通過組織化學(xué)半定量地評估，使 用如前所述的紅氨酸染料染色技術(shù)用于評估銅的分布（Van den Ingh等人，（1988) Vet Q 10: 84 - 89)。濃度可如下分級為0-5的等級：0 =沒有銅存在；1 =含有一些銅陽性顆粒 的孤立肝細(xì)胞和/或網(wǎng)狀組織（RHS)細(xì)胞；2 =含有少量至中等量的銅陽性顆粒的小群肝 細(xì)胞和/或RHS細(xì)胞；3 =含有中等量的銅陽性顆粒的較大群或面積的肝細(xì)胞和/或RHS 細(xì)胞；4 =具有許多銅陽性顆粒的大面積的肝細(xì)胞和/或RHS細(xì)胞；和5 =具有許多銅 陽性顆粒的彌散存在的肝細(xì)胞和/或RHS細(xì)胞。根據(jù)該分級系統(tǒng)，超過2的銅得分為異常 的。
[0033] 因此，根據(jù)本發(fā)明測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性可涉及測定下述可能 性，即狗將獲得小于或等于3的得分，例如小于或等于2. 5、2、1. 5,或小于或等于1，其使用 Van den Ingh等人中所述的分級系統(tǒng)進(jìn)行。測定狗對肝銅積累敏感的風(fēng)險(xiǎn)或可能性可涉 及測定下述風(fēng)險(xiǎn)或可能性，即狗將獲得大于或等于2的得分，例如大于或等于2. 5、3、3. 5， 或大于或等于4,其使用Van den Ingh等人中所述的分級系統(tǒng)進(jìn)行。
[0034] 可將保護(hù)的可能性或敏感性的風(fēng)險(xiǎn)表示為例如風(fēng)險(xiǎn)因子、百分比或概率。有可能 測定狗是否會積累銅至上述水平。例如，測定受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法可 包括測定狗是否會積累銅至高于400 mg/kg的水平。
[0035] 高于400mg/kg的肝銅積累水平與肝疾病相關(guān)，并可最終導(dǎo)致肝功能衰竭。因此測 定狗基因組是否包含指示受到免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性指示了所述狗不 太可能患肝銅積累導(dǎo)致的疾病或病癥例如慢性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。相反地，測定狗 基因組是否包含指示肝銅積累敏感性的一種或多種多態(tài)性指示了所述狗對所述疾病或病 癥的敏感性。因此，本發(fā)明提供了檢測狗對肝銅積累相關(guān)疾病例如慢性肝炎、肝硬化和肝功 能衰竭的敏感性或保護(hù)狗免于所述疾病的可能性的方法。
[0036] 對銅積累的敏感性或免于銅積累的保護(hù)的多態(tài)性和指示
【發(fā)明者】已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了影響ATP7A蛋白質(zhì)序列的多態(tài)性，其指示了免于肝銅積累 的保護(hù)，如與指示對肝銅積累的敏感性相反(實(shí)施例2-5)。所述多態(tài)性改變了基因 ATP7A在 328位氨基酸處的蛋白質(zhì)序列，從蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼帷ｓw外實(shí)驗(yàn)已測定該突變對蛋白質(zhì)具 有較大功能影響(實(shí)施例5)。實(shí)驗(yàn)已表明表達(dá)該突變形式的蛋白的細(xì)胞中銅積累的速率更 大；在銅暴露過程中積累更大，在銅暴露后釋放更慢。另外，響應(yīng)于銅暴露的細(xì)胞外ATP7A 運(yùn)動在攜帶該突變的細(xì)胞中改變。在攜帶該突變的細(xì)胞中還存在銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的增加的表 達(dá)。ATP7A的表達(dá)水平在攜帶兩種形式的細(xì)胞之間沒有改變。ATP7A編碼突變因此對蛋白 質(zhì)的功能具有顯著作用。
[0037] 本發(fā)明因此涉及測定狗基因組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的 多態(tài)性的方法。具體地，本發(fā)明提供了測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方法，包 括在狗基因組中檢測一種或多種選自下述的多態(tài)性的存在或缺乏：（a)SNP ATP7A_Reg3_ F_6 (SEQ ID NO: 142的位置102)和（b)與（a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。
[0038] 短語"檢測多態(tài)性的存在或缺乏"通常指測定多態(tài)性是否存在于狗基因組中。多 態(tài)性包括單核苷酸多態(tài)性（SNP)，微衛(wèi)星多態(tài)性，插入多態(tài)性和缺失多態(tài)性。優(yōu)選地，多態(tài)性 為SNP。檢測SNP的存在或缺乏指將SNP按基因型分型或?qū)⒐坊蚪M中存在的核苷酸(一個 或多個）針對SNP分型。通常會測定2條同源染色體相同位置上存在的核苷酸。因此狗可 被測定為在SNP的第一個等位基因上是純合的，在SNP的第二個等位基因上是雜合的或純 合的。
[0039] 測定個體的表型，例如個體對疾病或病癥的敏感性或保護(hù)個體免于疾病或病癥不 限于檢測導(dǎo)致疾病或病癥的多態(tài)性。在遺傳作圖研究中，檢測個體樣品中一組標(biāo)記物基因 座的遺傳變異以獲得與特定表型的聯(lián)系。如果在特定標(biāo)記物基因座和表型之間發(fā)現(xiàn)這樣的 聯(lián)系，這表示在該標(biāo)記物基因座的變異影響目的表型，或在該標(biāo)記物基因座的變異與未被 基因分型的真正表型相關(guān)基因座處于連鎖不平衡。在一組彼此處于連鎖不平衡的多態(tài)性的 情況下，知道在特定個體中所有這些多態(tài)性的存在通常提供冗余信息。因此，當(dāng)測定狗基因 組中是否包含一種或多種多態(tài)性(其指示對肝銅積累或銅相關(guān)肝疾病的敏感性或免于肝銅 積累或銅相關(guān)肝疾病的保護(hù)）時(shí)，必須檢測所述多態(tài)性組中的僅一種多態(tài)性。
[0040] 作為連鎖不平衡的結(jié)果，不是功能敏感性/保護(hù)性多態(tài)性而是與功能多態(tài)性處于 連鎖不平衡的多態(tài)性可作為標(biāo)記物指示功能多態(tài)性的存在。與本發(fā)明的多態(tài)性處于連鎖不 平衡的多態(tài)性指示對肝銅積累的敏感性，或免于肝銅積累的保護(hù)。
[0041] 由此，如本文定義的任意一種多態(tài)位置可被直接分型，也就是說通過測定在該位 置存在的核苷酸，或被間接分型，例如通過測定與所述多態(tài)性位置處于連鎖不平衡的另一 個多態(tài)位置存在的核苷酸。
[0042] 連鎖不平衡是種群中不同基因座上的等位基因的非隨機(jī)配子聯(lián)系。具有共同遺傳 而不是通過隨機(jī)排列獨(dú)立遺傳傾向的多態(tài)性是處于連鎖不平衡的。如果2種多態(tài)性共同 存在的頻率是2種多態(tài)性各自存在的頻率的乘積，則多態(tài)性是隨機(jī)排列的或彼此獨(dú)立遺傳 的。例如，如果在不同多態(tài)位點(diǎn)的2種多態(tài)性在種群的50%染色體中存在，那么，如果這2 個等位基因共同在種群的25%染色體中存在，就可以說它們是隨機(jī)排列的。更高的百分比 將意味著這2個等位基因是連鎖的。如果在種群中2種多態(tài)性共同存在的頻率高于2種多 態(tài)性獨(dú)立存在的頻率的乘積，則第一種多態(tài)性與第二種多態(tài)性處于連鎖不平衡。優(yōu)選地，如 果2種多態(tài)性共同存在的頻率比2種多態(tài)性獨(dú)立存在的頻率的乘積高10%，例如高于30%， 高于50%或高于70%，則第一種多態(tài)性與第二種多態(tài)性處于連鎖不平衡。。
[0043] 研究顯不連鎖不平衡在狗中是廣泛的（Extensive and breed-specific linkage disequilibrium in Canis familiaris, Sutter 攀 yl , Genome Research 14: 2388-2396)。處于連鎖不平衡的多態(tài)性經(jīng)常在物理上很接近，這解釋了它們?yōu)槭裁垂策z傳。 與本文提及的多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性位于相同的染色體上。在狗中處于連鎖不平 衡的多態(tài)性通常位于多態(tài)性的5mb以內(nèi)，優(yōu)選2mb以內(nèi)、Imb以內(nèi)、700kb以內(nèi)、600kb以內(nèi)、 500kb以內(nèi)、400kb以內(nèi)、200kb以內(nèi)、IOOkb以內(nèi)、50kb以內(nèi)、IOkb以內(nèi)、5kb以內(nèi)、Ikb以內(nèi)、 500bp以內(nèi)、IOObp以內(nèi)、50bp以內(nèi)或IObp以內(nèi)，。
[0044] 使用常規(guī)技術(shù)鑒定與本文定義的任意一種多肽位置處于連鎖不平衡的多態(tài)性應(yīng) 當(dāng)是技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。一旦選擇了潛在的多態(tài)性，技術(shù)人員可容易地測定此多態(tài)性 是否與本文定義的任意一種多態(tài)性顯著相關(guān)，和所述多態(tài)性的哪種版本或等位基因與本文 定義的任意一種多態(tài)性顯著相關(guān)。
[0045] 更詳細(xì)地，為測定多態(tài)性是否與本文定義的任意一種多態(tài)性處于連鎖不平衡，技 術(shù)人員應(yīng)當(dāng)對候選多態(tài)性和一種或多種本文定義的多態(tài)性在一組狗中進(jìn)行基因分型。組 的大小應(yīng)當(dāng)足夠大以得到統(tǒng)計(jì)上顯著的結(jié)果。通常應(yīng)當(dāng)對來自至少100,優(yōu)選至少150或 至少200只不同狗的樣品進(jìn)行基因分型。組中的狗可為任意品種，但通常具有相同或相 似的遺傳品種背景。一旦在一組狗中對多態(tài)性進(jìn)行了基因分型，使用多種可容易得到的 統(tǒng)計(jì)軟件包中的任意一種可測量一對或多對多態(tài)性之間的連鎖不平衡。免費(fèi)軟件包的 實(shí)例為 Haploview (Haploview: analysis and visualisation of LD and haplotype maps, Barrett 等人，2005，Bioinformatics, 21 (2) : 263-265)，可在 http: //www. broadinstitute. org/hapIoview/hapIoview 下載。
[0046] 連鎖不平衡的量度為D'。0. 5至I范圍的D'指示一對多態(tài)性處于連鎖不平衡，I 指示最顯著的連鎖不平衡。因此如果發(fā)現(xiàn)候選多態(tài)性和本文定義的特定多態(tài)性的D'處于 0. 5至1，優(yōu)選0. 6至1、0. 7至1、0. 8至1、0. 85至1、0. 9至1、0. 95至1或最優(yōu)選為1，貝Ij 可以說候選多態(tài)性預(yù)測本文定義的多態(tài)性，并且會因此指示對肝銅積累的敏感性或免于肝 銅積累的保護(hù)。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，與本文定義的多態(tài)性處于連鎖不平衡的多態(tài)性在 680 kb以內(nèi)并與本文定義的多態(tài)性處于相同的染色體上，并且多態(tài)性對之間的連鎖不平衡 的計(jì)算量度D'大于或等于0.9。
[0047] 連鎖不平衡的另一種量度是R平方，其中R為相關(guān)系數(shù)。R平方(又稱"測定系數(shù)"） 是第一種多態(tài)性基因型中的變異占第二種多態(tài)性基因型的變異的分?jǐn)?shù)。因此對候選多態(tài)性 和本文定義的特定多態(tài)性來說，〇. 5的R平方意味著候選多態(tài)性占特定多態(tài)性變異的50%。 通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包(例如Haploview)可產(chǎn)生R平方。通常地，認(rèn)為0. 25或更高（R>0. 5 或〈-0. 5)的R平方是高相關(guān)性。因此對候選多態(tài)性和本文定義的特定多態(tài)性來說，如果發(fā) 現(xiàn)R平方為〇. 5或更高，優(yōu)選0. 75或更高、0. 8或更高、0. 85或更高、0. 9或更高或0. 95或 更高，則可以說候選多態(tài)性預(yù)測本文定義的多態(tài)性，并且會因此指示對肝銅積累的敏感性 或免于肝銅積累的保護(hù)。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，與本文定義的多態(tài)性處于連鎖不平衡的 多態(tài)性在680 kb以內(nèi)并與本文定義的多態(tài)性處于相同的染色體上，并且多態(tài)性對之間的連 鎖不平衡的計(jì)算量度R平方大于或等于〇. 85。
[0048] 一旦鑒定了與本文定義的多態(tài)性處于連鎖不平衡的（因此與其相關(guān)的）的多態(tài)性， 技術(shù)人員可容易地測定多態(tài)性的那種版本，即哪個等位基因與對肝銅積累的敏感性或免于 肝銅積累的保護(hù)相關(guān)。這可通過測定一組狗的肝銅積累表型并根據(jù)肝銅積累的水平將狗分 類而實(shí)現(xiàn)。然后將這組狗針對目的多態(tài)性進(jìn)行基因分型。然后將基因型與肝銅水平相關(guān)聯(lián) 以測定基因型和肝銅水平的聯(lián)系，由此測定哪個等位基因與對肝銅積累的敏感性或免于肝 銅積累的保護(hù)相關(guān)。
[0049] 指示免于肝銅積累的保護(hù)的本發(fā)明的多態(tài)性是表VI中鑒定的SNP(ATP7a_ Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142的位置102))和與該SNP處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài) 性。因此，本發(fā)明的方法包括測定在狗基因組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺 乏：（a) SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和（b)與（a)處于連鎖不平衡的一種或多 種多態(tài)性。優(yōu)選地，本發(fā)明包括測定表VI中鑒定的SNP(ATP7a_Reg3_F_6(SEQIDN0 :142 的位置102))即多態(tài)性（a)的存在或缺乏。
[0050] 可檢測多態(tài)性的任意數(shù)目和任意組合來實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)選檢測至少2種多態(tài)性。 優(yōu)選檢測2至5、3至8或5至10種多態(tài)性。
[0051] 可對狗DNA在以下各個位置進(jìn)行分型： ⑴多態(tài)性（a); (ii) 一種或更多種多態(tài)性（b);或 (iii) 多態(tài)性（a)和一種或多種多態(tài)性（b)。
[0052] 優(yōu)選的方法包括檢測（a)SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和與所述多態(tài)性 (a)處于連鎖不平衡的至少一種多態(tài)性（b)的存在或缺乏。
[0053] 在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，與所述多態(tài)性（a)處于連鎖不平衡的多態(tài)性為SNP。優(yōu)選 地，多態(tài)性是在狗ATP7A基因或基因區(qū)域中指示免于肝銅積累的保護(hù)的任意多態(tài)性。與多 態(tài)性（a)處于連鎖不平衡的SNP的實(shí)例是SNPATP7a_Regl6_F_42(SEQIDN0 :143的位置 68).該SNP發(fā)現(xiàn)與SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)處于連鎖不平衡并指示免于 肝銅積累的保護(hù)（實(shí)施例4)。因此，該SNP可自己使用或與多態(tài)性（a)組合使用以測定狗 受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性。因此，測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的方 法可包括檢測在狗基因組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏：（a) SNP ATP7a_ Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)，（b) SNP ATP7a_Regl6_F_42 (SEQ ID N0:143)和與（a)處于 連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性和/或（b)。優(yōu)選方法包括檢測（a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和（b) SNP ATP7a_Regl6_F_42 (SEQ ID N0:143)的存在或缺乏。
[0054] 表 VI 中鑒定的 ATP7A SNP 的 T 等位基因（ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142) 已被
【發(fā)明者】測定以指示保護(hù)免于肝銅積累。該SNP位于X染色體。對于T等位基因是純 合體（在母狗的情況下）或雜合體（在公狗的情況下）的狗受到免于肝銅積累的保護(hù)。具 有C等位基因的狗不顯示受到免于肝銅積累的保護(hù)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選方法包括測定對 于表VI所鑒定的SNP(ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142))的T等位基因的存在或缺乏。 因此，本發(fā)明的優(yōu)選方法包括檢測在ATP7a_Reg3_F_6 (SNP 142)處的TT或TC基因型的存 在或缺乏以及從而測定狗的基因組是否包括指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。
[0055] 由于表VI所鑒定的ATP7A SNP位于X染色體且保護(hù)作用是隱性的事實(shí)，公狗更可 能具有保護(hù)性表型。本發(fā)明的方法可因此包括測定狗的性別。鑒于公狗通常與母狗相比 具有對銅積累的更低的敏感性，ATP7A SNP ((ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO: 142))特別用 于所有品種的狗，包括未知品種或雜交品種（雜種，mongrel)的狗。實(shí)施例3還提供了本 發(fā)明的方法適用于所有品種和在所有地理區(qū)域中的狗的證據(jù)。本發(fā)明的方法可因此包括測 定雜交或雜種犬、或雜種或遠(yuǎn)交犬的基因組是否包括ATP7A基因中指示免于肝銅積累的保 護(hù)的一種或多種多態(tài)性或與其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性。
[0056] 對于 SNP ATP7a_Regl6_F_42 (SEQ ID NO: 143)，其已發(fā)現(xiàn)與 SNP ATP7a_Reg3_ F_6 (SEQ ID NO: 142)處于連鎖不平衡，T等位基因已被
【發(fā)明者】測定以指示保護(hù)免于肝銅 積累。如上所解釋，ATP7A基因和因此該SNP位于X染色體。對于T等位基因是純合體 (在母狗的情況下）或雜合體（在公狗的情況下）的狗受到免于肝銅積累的保護(hù)。具有C 等位基因的狗不顯示受到免于肝銅積累的保護(hù)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選方法包括測定對于表X 所鑒定的SNP(ATP7a_Regl6_F_42 (SEQ ID NO: 143)的T等位基因的存在或缺乏。因此， 本發(fā)明的優(yōu)選方法包括檢測在（ATP7a_Regl6_F_42 (SEQ ID NO: 143)處的TT或TC基因 型的存在或缺乏以及從而測定狗的基因組是否包括指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。
[0057]
【發(fā)明者】已發(fā)現(xiàn)在犬G0LGA5、ATP7A和UBL5基因或其區(qū)域中的多態(tài)性指示了對肝銅 積累的敏感性（實(shí)施例1-2)。因此這些多態(tài)性可用于與本發(fā)明的多態(tài)性組合以提供測定 狗對肝銅積累敏感的風(fēng)險(xiǎn)或受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性的增強(qiáng)的遺傳測試。本發(fā)明 的方法因此可包括測定指示對肝銅積累的敏感性和免于肝銅積累的保護(hù)的SNP組合的存 在或缺乏。來著狗的DNA可在指示對肝銅積累的敏感性的一個或多個SNP處被分型以及在 指示免于肝銅積累的保護(hù)的一個或多個SNP分型。一個或多個"敏感性" SNP的存在與一 個或多個"保護(hù)性" SNP的缺乏的組合表明狗對肝銅積累的敏感性。一個或多個"保護(hù)性" SNP的存在與一個或多個"敏感性" SNP的缺乏的組合表明狗受到免于肝銅積累的保護(hù)。
[0058] 指示對肝銅積累的敏感性的本發(fā)明的多態(tài)性可存在于G0LGA5、ATP7a或UBL5基因 中的任意一個中或不存在于這些基因中的任意一個中但與這些基因中的任意一個中的多 態(tài)性處于連鎖不平衡。本發(fā)明因此涉及檢測（c)在狗G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中指示對 肝銅積累的敏感性的多態(tài)性和/或（d)與所述多態(tài)性（c)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在 或缺乏。可檢測多態(tài)性的任意數(shù)目和任意組合來實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)選檢測至少2種多態(tài)性。 優(yōu)選檢測2至5、3至8或5至10種多態(tài)性。
[0059] 因此，狗的DNA可在⑴多態(tài)性（a)和/或（ii) 一種或多種多態(tài)性（b)的各自 位置處被分型。另外，可對狗DNA在以下各個位置進(jìn)行分型： (iii) 2種或更多種多態(tài)性（c); (iv) 2種或更多種多態(tài)性（d);或 (V) -種或多種多態(tài)性（c)和一種或多種多態(tài)性（d)。
[0060] 當(dāng)為2種多態(tài)性（c)時(shí)，每種多態(tài)性可在單獨(dú)的G0LGA5、ATP7A和UBL5基因之一 中或只在這些基因之一中。當(dāng)為3種或更多多態(tài)性（c)時(shí)，例如3至10種所述多態(tài)性，多 態(tài)性可在同一個基因中，在2個基因中或在所有3個基因中。
[0061] 類似地，當(dāng)為2種多態(tài)性（d)時(shí)，每種多態(tài)性可與在單獨(dú)的G0LGA5、ATP7A和UBL5 基因之一中或只在這些基因之一中的多態(tài)性處于連鎖不平衡。當(dāng)為3種或更多多態(tài)性（d) 時(shí)，例如3至10種所述多態(tài)性，多態(tài)性可與在同一個基因中，在2個基因中或在所有3個基 因中的多態(tài)性處于連鎖不平衡。
[0062] 優(yōu)選的方法包括檢測（c)在狗G0LGA5、ATP7A或UBL5基因中指示對肝銅積累的敏 感性的至少一種多態(tài)性和與所述多態(tài)性（c)處于連鎖不平衡的至少一種多態(tài)性（d)的存在 或缺乏。
[0063] 在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，指示敏感性的多態(tài)性為SNP。SNP可為狗G0LGA5、ATP7A 或UBL5基因或基因區(qū)域中指示對肝銅積累的敏感性的任意SNP和/或與其處于連鎖不平 衡的SNP。
[0064] 當(dāng)方法包括測定狗基因組是否包含指示對肝銅積累的敏感性的一種或多種多態(tài) 性時(shí)，優(yōu)選地，SNP選自表III、表IV和表V中鑒定的SNP。在表III和表IV中各SNP位于 序列的第61位。提供了各SNP在該位置的第一和第二等位基因（[第一 /第二])。在表V 中，也指示了各SNP的第一和第二等位基因?？墒褂萌我鈹?shù)目和以任意組合的來自表III、 IV和V的SNP。SNP可與多態(tài)性的不同類型組合。
[0065] 優(yōu)選地，當(dāng)方法包括測定狗基因組是否包含指示對肝銅積累的敏感性的一種或多 種多態(tài)性時(shí)，方法包括檢測選自表III和表V中SNP的一種或多種SNP和/或與其處于連鎖 不平衡的一種或多種SNP的存在或缺乏。因此優(yōu)選地，一種或多種SNP選自BICF2P506595 (SEQIDN0:1的位置61)、BICF2P772765 (SEQIDN0:2的位置61)、BICF2S2333187 (SEQ ID N0:3 的位置 61)、BICF2P1324008 (SEQ ID N0:4 的位置 61)、BICF2P591872 (SEQ ID N0:5的位置61)、ATP7A_Reg4_F_9(SEQIDN0:131的位置164)、UBL5_ReglF_16(SEQID NO: 132 的位置 97)、golga5_Regl_24 (SEQ ID NO: 133 的位置 70)、golga5_26 (SEQ ID NO: 134 的位置 88)、golga5_27 (SEQ ID NO: 135 的位置 104)、golga5_28 (SEQ ID NO: 136 的位置 139)、golga5_29 (SEQ ID NO: 137 的位置 128)、golga5_30 (SEQ ID NO: 138 的位置 95)、golga5_31 (SEQ ID NO: 139 的位置 106)、ATP7Aregl7_32 (SEQ ID NO: 140 的位置95)、ATP7Aregl7_33 (SEQ IDN0: 141的位置90)和與其處于連鎖不平衡的一種或 多種SNP。由此，可對這16種SNP中的任一種或與這16種SNP中的任一種處于連鎖不平衡 的任意SNP進(jìn)行分型。優(yōu)選地，對這16種SNP或與其處于連鎖不平衡的SNP中的至少2種 進(jìn)行分型。
[0066] 更優(yōu)選地，當(dāng)方法包括測定狗基因組中是否包含指示對肝銅積累的敏感性的一種 或多種多態(tài)性時(shí)，所述方法包括檢測選自表ΠΙ中SNP的一種或多種SNP的存在或缺乏。由 此，可對這5種SNP中的任一種或與這5種SNP中的任一種處于連鎖不平衡的任意SNP進(jìn) 行分型。優(yōu)選地，對這5種SNP或與其處于連鎖不平衡的SNP中的至少2種進(jìn)行分型。更 優(yōu)選地，對所有5個位置進(jìn)行分型。因此優(yōu)選地，被分型的核苷酸(一個或多個)選自與下述 等同的位置： -SEQ ID NO: 1 的第 61 位（BICF2P506595, SNPl); -SEQ ID NO: 2 的第 61 位（BICF2P772765, SNP 2); -SEQ ID NO: 3 的第 61 位（BICF2S2333187, SNP 3); -SEQ ID NO: 4 的第 61 位（BICF2P1324008, SNP 4); -SEQ ID NO: 5的第61位（BICF2P591872, SNP 5);或與這些位置中的任一個處 于連鎖不平衡的任意位置。優(yōu)選地，所述方法包括檢測SNP BICF2P506595 (SEQ ID N0:1)、 BICF2P772765 (SEQ ID NO:2), BICF2S2333187 (SEQ ID NO:3), BICF2P1324008 (SEQ ID N0:4)和 BICF2P59I872 (SEQ ID NO:5)的存在或缺乏。
[0067] SNPl位于G0LGA5基因的內(nèi)含子中。SNP2、3和4位于UBL5基因區(qū)域中。SNP5位 于ATP7A基因區(qū)域中。本發(fā)明的檢測方法因此涉及在一個或多個這些基因的區(qū)域中（在編 碼區(qū)或其它區(qū)域中）存在的任意SNP，或與其處于連鎖不平衡的任意其它SNP。
[0068] 實(shí)施例1證明了這些SNP在建立對銅積累的敏感性的Boolean模型中的用途。表 I表示在3個基因組位置上的等位基因的雙值條件。二進(jìn)制值指示具有指示對銅積累的敏 感性的等位基因（"壞"等位基因）的狗。例如〇〇〇表不不具有3種壞等位基因中的任一種。 111表不具有所有3種壞等位基因。X是在該基因中未使用的等位基因。彳Tlxx和Oxx顯 示了僅使用G0LGA5基因中的SNP的單基因檢測會得到的效力。
[0069]
【發(fā)明者】已測定出SNP BICF2P506595 (SNP 1)的A等位基因指示對肝銅積累的 敏感性。A等位基因純合的狗對肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測定SNP BICF2P506595的A等位基因的存在或缺乏，由此測定狗基因組是否包含指示對肝銅積累的 敏感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測SNP BICF2P506595的AA基因型的存在或缺乏。
[0070]
【發(fā)明者】已測定出SNP BICF2P772765 (SNP 2)的G等位基因指示對肝銅積累的 敏感性。G等位基因純合的狗對肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測定SNP BICF2P772765的G等位基因的存在或缺乏，由此測定狗基因組是否包含指示對肝銅積累的 敏感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測SNP BICF2P772765的GG基因型的存在或缺乏。
[0071]
【發(fā)明者】已測定出SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的C等位基因指示對肝銅積累的 敏感性。C等位基因純合的狗對肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測定SNP BICF2S2333187的C等位基因的存在或缺乏，由此測定狗基因組是否包含指示對肝銅積累 的敏感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測SNP BICF2S2333187的CC基因型的存在或缺 乏。
[0072]
【發(fā)明者】已測定出SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的G等位基因指示對肝銅積累的 敏感性。G等位基因純合的狗對肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測定SNP BICF2P1324008的G等位基因的存在或缺乏，由此測定狗基因組是否包含指示對肝銅積累 的敏感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測SNP BICF2P1324008的GG基因型的存在或缺 乏。
[0073]
【發(fā)明者】已測定出SNP BICF2P591872 (SNP 5)的A等位基因指示對肝銅積累的敏 感性。A等位基因純合的狗對肝銅積累敏感。因此，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測定SNP SNP BICF2P591872的A等位基因的存在或缺乏，由此測定狗基因組是否包含指示對肝銅積累 的敏感性的多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測SNP SNP BICF2P591872的AA或AG基因型的 存在或缺乏。
[0074] 因此，本發(fā)明更優(yōu)選的方法包括檢測⑴在ATP7a_Reg3_F_6 (SNP 142)處的TT 或TC基因型；和/或（ii)在ATP7a_Regl6_F_42 (SNP 143)處的TT或TC基因型的存在或 缺乏；以及可進(jìn)一步檢測下述基因型的存在或缺乏： (iii) SNP BICF2P506595 (SNP 1)的 AA 基因型； (iv) SNP BICF2P772765 (SNP 2)的 GG 基因型； (V) SNP BICF2S2333187 (SNP 3)的 CC 基因型； (vi) SNP BICF2P1324008 (SNP 4)的 GG 基因型；和 / 或 (vii) SNP BICF2P591872 (SNP 5)的 AA 或 AG 基因型； 和由此測定狗基因組中是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)和/或?qū)Ω毋~積累的敏感 性的一種或多種多態(tài)性。更優(yōu)選的方法包括檢測基因型（iii);基因型（iv)、（v)和（vi); 或基因型（vii)的存在或缺乏。甚至更優(yōu)選的方法包括檢測所有5種基因型（iii)至（vii) 的存在或缺乏。
[0075] 可對狗DNA在以下位置分型： ⑴一種或多種選自下述的SNP:(a)表VI中鑒定的SNP(ATP7A_Reg3_F_6 (SNP 142)) 和（b)與所述SNP(a)處于連鎖不平衡的一種或多種SNP，例如表X中所鑒定的SNP(ATP7a_ Regl6_F_42 (SNP 143));以及 (ii) 一種或多種選自下述的SNP : (a)表III、IV和V中鑒定的SNP和（b)與所述SNP (a)處于連鎖不平衡的一種或多種SNP。
[0076] 對狗基因組中在表III、IV、V、VI或X中的任一個表中鑒定的位置（一個或多個） 處存在的核苷酸分型可能意味著對在與表III、IV、V、VI或X中鑒定的序列精確對應(yīng)的序 列中在此位置存在的核苷酸分型。然而，應(yīng)當(dāng)理解在表III中鑒定的SEQ ID NO: 1至5， 表IV中鑒定的SEQ ID N0:6至130,表V中鑒定的SEQ ID NO: 131至141，表VI中鑒定的 SEQ ID NO: 142和表X中鑒定的SEQ ID NO: 143存在的精確序列不一定在待檢測的狗中 存在。因此可在表III、IV、V、VI或X中鑒定的位置或等同或?qū)?yīng)的位置對在序列中存在的 核苷酸分型。因此如本文使用的術(shù)語等同的意思是在表III、IV、V或VI中鑒定的位置或其 對應(yīng)位置。SNP的序列可發(fā)生變化，因此其位置可發(fā)生變化，例如由于狗基因組中核苷酸的 缺失或插入。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定與各SEQ ID NOs: 1至143中的相關(guān)位置對應(yīng)或等 同的位置,例如使用計(jì)算機(jī)程序如GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN、PILEUP或BLAST。UWGCG 軟件包提供了可用于計(jì)算同源性或排列序列的程序，包括GAP、BESTFIT、COMPARE、ALIGN和 PILEUP (例如使用它們的默認(rèn)設(shè)置)。BLAST算法也可用于比較或排列2個序列，通常使用 其默認(rèn)設(shè)置。用于進(jìn)行2個序列的BLAST比較的軟件從國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information) (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/)可公開地獲 得。此算法在下面進(jìn)一步描述。用于序列比對和比較的類似可公開獲得的工具可在歐洲生 物信息研究所（European Bioinformatics Institute)網(wǎng)站(http: //www. ebi. ac. uk)找 至Ij,例如ALIGN和CLUSTALW程序。
[0077] 有許多不同的方法可用于測定多態(tài)性是否指示對肝銅積累的敏感性或免于肝銅 積累的保護(hù)。通常將候選多態(tài)性與多態(tài)性及其與對肝銅積累的敏感性或免于肝銅積累的保 護(hù)的聯(lián)系的數(shù)據(jù)庫相比較。這樣的數(shù)據(jù)庫通過對一組狗針對肝銅積累進(jìn)行表型分型，例如 通過肝活組織檢查，并根據(jù)銅積累的水平將狗分類而生成。所述組中的狗也針對一組多態(tài) 性被基因分型。然后有可能測定各基因型和肝銅水平的聯(lián)系。因此通過在數(shù)據(jù)庫中定位多 態(tài)性可測定多態(tài)性是否指示對肝銅的敏感性或免于肝銅的保護(hù)。
[0078] 如果目的多態(tài)性不在上述數(shù)據(jù)庫中，仍然有可能測定多態(tài)性是否指示對肝銅積累 的敏感性或免于肝銅積累的保護(hù)。這可通過對一組狗針對肝銅積累進(jìn)行表型分型和根據(jù)肝 銅積累的水平將狗分類而實(shí)現(xiàn)。然后將所述組的狗針對目的多態(tài)性進(jìn)行基因分型。然后將 基因型和肝銅水平相聯(lián)系以測定基因型和肝銅水平的關(guān)聯(lián)。
[0079] -旦在狗基因組中檢測了到一種或多種本發(fā)明的多態(tài)性的存在或缺乏，就由此測 定了狗是否受到免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累敏感。各單獨(dú)的多態(tài)性或與其它多態(tài)性 組合的多態(tài)性的基因型指示狗受到免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累敏感。
[0080] 為測定狗是否受到免于肝銅積累的保護(hù)，可使用狗的DNA樣品在狗基因組中對表 VI中鑒定的SNP進(jìn)行基因分型。此功能突變位于ATP7A (在X染色體上)中，在純合（TT)時(shí) 顯示為保護(hù)性的。這可解釋慢性肝炎的雌性偏向，因?yàn)樾坌詢H具有一個拷貝的X染色體，因 此在ATP7A基因座上為半合子。因?yàn)樾坌訶染色體的半合狀態(tài)，伴X染色體的隱性基因效 應(yīng)更可能在雄性而不是雌性中見到。此處的保護(hù)性作用是隱性的，因此我們在雌性群體中 觀察到更多的案例（見實(shí)施例2,表VII和圖5)。一旦測定了 SNP的基因型，就有可能測定 狗是否受到免于肝銅積累的保護(hù)?？蛇x等位基因（T)的存在指示免于肝銅積累的保護(hù)?？?選等位基因?yàn)榧兒希═T)的狗最可能受到免于肝銅積累的保護(hù)。本發(fā)明優(yōu)選的方法因此包括 測定在狗基因中ATP7A SNP的T等位基因的存在或缺乏。所述方法可包括測定狗對ATP7A SNP的T等位基因是純合的(在雌性狗的情況下）或半合的(在雄性狗的情況下)。
[0081] 如果方法進(jìn)一步包括檢測指示對肝銅積累的敏感性的SNP的存在或缺乏，模型可 用于組合結(jié)果以提供狗將對肝銅積累的敏感性火免于肝銅積累的保護(hù)的風(fēng)險(xiǎn)或可能性的 整體評估。作為實(shí)例，表I列舉了 G0LGA5、UBL5和ATP7a基因區(qū)域中5種SNP組合的不同 可能的基因型和具有這些基因型且具有高銅(肝水平高于600 mg/kg)的狗的百分比。在此 實(shí)例中，為了測定狗對肝銅積累的敏感性，可使用狗的DNA樣品在狗基因組中對5種SNP進(jìn) 行基因分型。一旦測定了 SNP的基因型，可基于實(shí)施例1中提供的譯碼（即基于基因型和高 銅關(guān)聯(lián)的程度)將其轉(zhuǎn)化成二進(jìn)制值。然后，使用表I基于具有該基因型模式和高銅的狗的 百分比將二進(jìn)制值轉(zhuǎn)化為風(fēng)險(xiǎn)因子。這些結(jié)果可因此與保護(hù)性多態(tài)性的結(jié)果組合。
[0082] 通過本發(fā)明的方法可檢測在任意年齡的狗，例如從0至12、0至6、0至5、0至4、0 至3、0至2或0至1歲。優(yōu)選地，在盡可能小的年齡檢測狗，例如在其生命的頭一年，頭6 個月或3個月以內(nèi)。優(yōu)選地在銅積累發(fā)生前檢測狗。可能知道或可能不知道狗的歷史。例 如，狗可能為已知父母的小狗，可能知道其父母關(guān)于銅積累的歷史?；蛘撸房赡転樽呤У?或被救援的狗，具有未知出身和歷史。
[0083] 通過本發(fā)明的任意方法檢測的狗可為任意品種。本發(fā)明提供了測定混種或雜交 狗，或雜種或遠(yuǎn)交狗的基因組是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的敏感性的 一種或多種多態(tài)性的方法。
[0084] 在用于測定狗基因組是否包含指示免于肝銅積累的保護(hù)的一種或多種多態(tài)性的 方法中，狗可為疑為受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗?？蛇x地，狗可被疑為對肝銅積累敏感。 在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，狗具有拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬（Golden Retriever)或迷你 貴賓犬（Miniature Poodle)的遺傳品種特征。狗可為混種或雜交狗，或雜種或遠(yuǎn)交狗。狗 基因組可具有至少25%、至少50%或至少100%遺傳自任意純種或更優(yōu)選地遺傳自選自拉布 拉多尋回犬、金毛尋回犬或迷你貴賓犬的任意品種。狗可為純種的。在本發(fā)明的一個實(shí)施 方案中，待檢測狗的一個或雙方父母為純種狗。在另一個實(shí)施方案中，一個或多個祖父母為 純種狗。待檢測狗的1、2、3或所有4個祖父母可為純種狗。
[0085] 優(yōu)選地，狗具有拉布拉多尋回犬的遺傳品種特征。狗可為純種拉布拉多尋回犬。 或者，狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一個或雙方父母可為純種拉布拉多尋回 犬。狗的1、2、3或4個祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少 50%或至少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來源于拉 布拉多尋回犬品種。
[0086] 通過評估遺傳標(biāo)記物(例如SNP或微衛(wèi)星)的等位基因頻率可測定狗的遺傳品種背 景。在狗中不同SNP或微衛(wèi)星的等位基因頻率的組合提供了允許測定狗品種或產(chǎn)生混種狗 的品種的識別標(biāo)志。這樣的遺傳檢測可為市售的檢測?；蛘?，不需要檢測狗的特定品種遺 傳特征，因?yàn)槔绻分魅嘶颢F醫(yī)懷疑其具有特定品種特征。這可能是由于例如知道狗的祖 先或由于其外觀。
[0087] 本發(fā)明的預(yù)測檢測可與一種或多種其它預(yù)測或診斷檢測(例如測定狗的遺傳品種 背景/特征或?qū)σ环N或多種其它疾病的敏感性）共同實(shí)施。
[0088] 多態(tài)性的檢測 根據(jù)本發(fā)明的多態(tài)性的檢測可包括將來自狗的樣品中的多核苷酸或蛋白質(zhì)與針對多 態(tài)性的特異性結(jié)合試劑接觸并測定所述試劑是否結(jié)合所述多核苷酸或蛋白質(zhì)，其中試劑的 結(jié)合指示多態(tài)性的存在，而不出現(xiàn)試劑的結(jié)合指示多態(tài)性的缺乏。
[0089] 所述方法通常在來自狗的樣品中體外實(shí)施，其中樣品包含來自狗的DNA。樣品通常 包含狗的體液和/或細(xì)胞，例如使用拭子(例如口腔拭子河獲得。樣品可為血液、尿、唾液、 皮膚、臉頰細(xì)胞或發(fā)根樣品。通常在實(shí)施方法前處理樣品，例如可進(jìn)行DNA提取。樣品中的 多核苷酸或蛋白質(zhì)可被物理或化學(xué)切割，例如使用合適的酶。在一個實(shí)施方案中，在檢測多 態(tài)性以前樣品中的多核苷酸部分被拷貝或擴(kuò)增，例如通過克隆或使用基于PCR的方法。
[0090] 在本發(fā)明中，任意一種或多種方法可包括測定一種或多種多態(tài)性在狗中的存在或 缺乏。通常通過直接測定狗的多核苷酸或蛋白質(zhì)中多態(tài)序列的存在檢測多態(tài)性。這樣的多 核苷酸通常為基因組DNA、mRNA或cDNA?？赏ㄟ^任意合適的方法(例如下面提及的那些)檢 測多態(tài)性。
[0091] 特異性結(jié)合試劑是優(yōu)先或以高親和力與具有多態(tài)性的蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合但不與 或僅以低親和力與其它多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的試劑。特異性結(jié)合試劑可為探針或引物。探針 可為蛋白質(zhì)(例如抗體)或寡核苷酸。探針可被間接標(biāo)記或能夠被間接標(biāo)記。探針與多核苷 酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合可用于固定探針或多核苷酸或蛋白質(zhì)。
[0092] 通常在方法中，可通過測定試劑與狗的多態(tài)多核苷酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合檢測多態(tài) 性。然而在一個實(shí)施方案中，試劑也能夠結(jié)合對應(yīng)的野生型序列，例如結(jié)合在變異位置兩側(cè) 的核苷酸或氨基酸，然而可以檢測到與野生型序列的結(jié)合和與含有多態(tài)性的多核苷酸或蛋 白質(zhì)的結(jié)合的方式不同。
[0093] 方法可基于寡核苷酸連接測定，其中使用2種寡核苷酸探針。這些探針結(jié)合至含 有多態(tài)性的多核苷酸的相鄰區(qū)域，在結(jié)合后允許2種探針通過合適的連接酶連接在一起。 然而在一種探針中的單個錯配的存在將破壞結(jié)合和連接。因此僅在含有多態(tài)性的多核苷酸 中出現(xiàn)連接的探針，因此連接產(chǎn)物的檢測可用于測定多態(tài)性的存在。
[0094] 在一個實(shí)施方案中，探針用于基于異源雙鏈體分析的系統(tǒng)。在所述系統(tǒng)中當(dāng)探針 與含有多態(tài)性的多核苷酸序列結(jié)合時(shí)，其在存在多態(tài)性的位點(diǎn)形成異源雙鏈體，因此不形 成雙鏈結(jié)構(gòu)。這樣的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)可通過使用單鏈或雙鏈特異酶檢測。探針通常為RNA 探針，使用RNA酶H切割異源雙鏈體，通過檢測切割產(chǎn)物檢測多態(tài)性。
[0095] 所述方法可基于熒光化學(xué)切割錯配分析，其在例如PCR Methods and Applications 3, 268-71 (1994) and Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 4397-4401 (1998) 中描述。
[0096] 在一個實(shí)施方案中使用PCR引物，只有當(dāng)其與含有多態(tài)性的多核苷酸結(jié)合時(shí)引發(fā) PCR反應(yīng)，例如序列特異性PCR系統(tǒng)，通過檢測PCR產(chǎn)物可測定多態(tài)性的存在。優(yōu)選地與多 態(tài)性互補(bǔ)的引物區(qū)域在引物的3'端或靠近引物的3'端。使用基于熒光染料和猝滅劑的 PCR測定例如Taqman PCR檢測系統(tǒng)可測定多態(tài)性的存在。
[0097] 特異性結(jié)合試劑可能能夠特異性結(jié)合由多態(tài)序列編碼的氨基酸序列。例如，試劑 可為抗體或抗體片段。檢測方法可基于ELISA系統(tǒng)。方法可為基于RFLP的系統(tǒng)。如果多 核苷酸中的多態(tài)性的存在產(chǎn)生或破壞了被限制性內(nèi)切酶識別的限制性內(nèi)切位點(diǎn)，則可使用 此系統(tǒng)。
[0098] 可基于多態(tài)性的存在導(dǎo)致多核苷酸或蛋白質(zhì)在凝膠電泳中遷移率的改變測定多 態(tài)性的存在。在多核苷酸的情況下，可使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)或變性梯度凝膠電泳 (DDGE)分析。在另一個檢測多態(tài)性的方法中，對含有多態(tài)區(qū)域的多核苷酸在含有多態(tài)性的 區(qū)域測序以測定多態(tài)性的存在。
[0099] 可通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET )檢測多態(tài)性的存在。具體來說，可通過雙雜交探 針系統(tǒng)檢測多態(tài)性。此方法包括使用2種彼此位置接近且與靶目的多核苷酸的內(nèi)部區(qū)段互 補(bǔ)的寡核苷酸探針，其中2種探針分別用熒光團(tuán)標(biāo)記。任意合適的熒光標(biāo)記物或染料可用 作熒光團(tuán)，使一種探針(供體）上的熒光團(tuán)的發(fā)射波長與第二種探針(接受體）上的熒光團(tuán)的 激發(fā)波長部分重疊。通常的供體熒光團(tuán)為熒光素（FAM)，通常的接受體熒光團(tuán)包括德克薩斯 紅、羅丹明、LC-640、LC-705和青色素5 (Cy5)。
[0100] 為了使熒光共振能量轉(zhuǎn)移能夠發(fā)生，2種探針與靶雜交后2種熒光團(tuán)需要相距很 近。當(dāng)供體熒光團(tuán)被合適波長的光激發(fā)時(shí)，發(fā)射譜能量被轉(zhuǎn)移至接受體探針上的熒光團(tuán)，得 到其熒光。因此，在合適波長下激發(fā)供體熒光團(tuán)時(shí)檢測此波長的光指示雜交和2種探針上 熒光團(tuán)的緊密聯(lián)系?？稍谝欢擞脽晒鈭F(tuán)標(biāo)記每種探針，使位于上游（5'）的探針在其3'端 被標(biāo)記，位于下游（3'）的探針在其5'端被標(biāo)記。當(dāng)與靶序列結(jié)合時(shí)2種探針之間的間隔 可為1至20個核苷酸，優(yōu)選1至17個核苷酸，更優(yōu)選1至10個核苷酸，例如1、2、4、6、8或 10個核苷酸的間隔。
[0101] 可將2種探針中的第一種設(shè)計(jì)為與多態(tài)性相鄰基因的保守序列結(jié)合，將第二種探 針設(shè)計(jì)為與包括一種或多種多態(tài)性的區(qū)域結(jié)合。在第二種探針靶向的基因序列中的多態(tài)性 可通過測量由產(chǎn)生的堿基錯配導(dǎo)致的解鏈溫度的改變而檢測。解鏈溫度改變的程度將取決 于核苷酸多態(tài)性涉及的數(shù)目和堿基類型。
[0102] 使用引物延伸技術(shù)也可進(jìn)行多態(tài)性分型。在此技術(shù)中，多態(tài)性位點(diǎn)周圍的靶區(qū)域 被拷貝或擴(kuò)增，例如通過使用PCR。之后進(jìn)行單堿基測序反應(yīng)，其使用在遠(yuǎn)離多態(tài)性位點(diǎn)一 個堿基的位置退火的引物(等位基因特異性核苷酸并入)。然后檢測引物延伸產(chǎn)物以測定在 多態(tài)位點(diǎn)存在的核苷酸。有幾種方法可檢測延伸產(chǎn)物。例如在一種檢測方法中，使用熒光 標(biāo)記的雙脫氧核苷酸終止子在多態(tài)位點(diǎn)處終止延伸反應(yīng)?；蛘?，使用質(zhì)量修飾的雙脫氧核 苷酸終止子，并使用質(zhì)譜檢測引物延伸產(chǎn)物。通過特異性標(biāo)記一種或多種終止子，可推斷出 延伸的引物的序列和因此推斷出在多態(tài)位點(diǎn)存在的核苷酸。每次反應(yīng)可分析多于一種反應(yīng) 產(chǎn)物，因此如果特異性標(biāo)記多于一種的終止子，可測定在2條同源染色體上存在的核苷酸。
[0103] 本發(fā)明還提供了可用于檢測本文定義的任意SNP的引物或探針以用于預(yù)測對銅 積累的敏感性。本發(fā)明的多核苷酸還可作為引物用于引物延伸反應(yīng)以檢測本文定義的SNP。
[0104] 這些引物、探針和其它多核苷酸片段的長度優(yōu)選地可為至少10個，優(yōu)選地至少15 或至少20個，例如至少25個，至少30個或至少40個核苷酸。它們的長度通常多達(dá)40、50、 60、70、100或150個核苷酸。探針和片段的長度可超過150個核苷酸，例如多達(dá)200、300、 400、500、600、700個核苷酸的長度，或甚至比本發(fā)明的全長多核苷酸序列短至幾個核苷酸， 例如5或10個氨基酸。
[0105] 可使用本領(lǐng)域已知的任意合適的設(shè)計(jì)軟件使用表III、IV、V、VI或X中的SNP序列 設(shè)計(jì)對本發(fā)明的SNP進(jìn)行基因分型的引物和探針。這些多核苷酸序列的同源物也適于設(shè)計(jì) 引物和探針。這些同源物通常具有至少70%的同源性，優(yōu)選至少80、90%、95%、97%或99%的 同源性，例如覆蓋至少15、20、30、100或更多連續(xù)核苷酸的區(qū)域。可基于核苷酸同一性(有 時(shí)被稱為"硬同源性（hard homology)"）計(jì)算同源性。
[0106] 例如UWGCG軟件包提供了可用于計(jì)算同源性的BESTFIT程序(例如在其默認(rèn)設(shè)置 上使用）（Devereux 藥乂（1984) TfesearcA 12，p387_395)?？墒褂?PILEUP 和BLAST算法可用于計(jì)算同源性或排列序列(例如鑒定等同或?qū)?yīng)序列(通常使用其默認(rèn) 設(shè)置），例如在 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F 攀yl (1990) J Mol Biol 215:403-10 中所描述的。
[0107] 進(jìn)行BLAST分析的軟件在國家生物技術(shù)信息中心(http://www. ncbi. nlm. nih. ￡2lZ)可公開地獲得。此算法涉及通過鑒定當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字串比對時(shí)匹配 或滿足一定正值閾值得分T的查詢序列中的長度為W的短字串而首先鑒定高得分序列對 (HSP)。T被稱為鄰近字串得分閾值（Altschul藥乂，見上文）。這些最初的相鄰字串擊中 作為種子用于起始檢索以尋找含有它們的HSP。字串擊中在每條序列的2個方向上延伸，只 要可增加累積的比對得分。當(dāng)累積比對得分從其最大獲得值下降X的量；由于一個或多個 負(fù)得分殘基比對的累積，累積得分到達(dá)〇或更低；或達(dá)到任一序列的末端時(shí)，在各自方向上 的字串擊中延伸終止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的敏感度和速度。BLAST程序使 用 11 的字串長度（W)、BL0SUM62 得分矩陣（見 Henikoff 和 Henikoff (1992) 乂 Acad. Sci. USA 89: 10915_10919)、50 的比對（Β)、10 的期望（Ε)、Μ=5、Ν=4 和 2 條鏈的比 較作為默認(rèn)設(shè)置。
[0108] BLAST算法對2條序列之間的相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；見例如Kar I in and Altschul (1993) 以· JcatZ 5bi. USA 90: 5873-5787。BLAST 算法提供的一種 相似性的測量為最小和概率（P(N))，其提供了 2條多核苷酸序列間會偶然發(fā)生匹配的概率 的指示。例如，如果第一條序列與第二條序列的比較的最小和概率低于約1，優(yōu)選地低于約 〇. 1，更優(yōu)選地低于約〇. 01，和最優(yōu)選地低于約〇. 001，則認(rèn)為一條序列與另一條序列相似。 [0109] 同源序列通常具有至少1、2、5、10、20或更多個突變的差異，其可為核苷酸的取 代、缺失或插入。
[0110] 本發(fā)明的多核苷酸例如引物或探針可以分離的或基本上純化的形式存在。它們可 與不干擾其預(yù)期用途的載體或稀釋劑混合并仍被視為是基本上分離的。它們也可為基本上 純化的形式，在這種情況下它們將通常包含至少90%，例如至少95%、98%或99%的制品的多 核苷酸。
[0111] 檢測抗體 檢測抗體為一種抗體，其特異針對一種多態(tài)性但不與如本文描述的任意其它多態(tài)性結(jié) 合。檢測抗體在例如涉及免疫沉淀技術(shù)的純化、分離或篩選方法中有用。
[0112] 抗體可針對本發(fā)明多肽的特定表位產(chǎn)生。當(dāng)抗體或其它化合物與其特異性針對 的蛋白質(zhì)優(yōu)先或高親和力結(jié)合但與其它多肽基本上不結(jié)合或僅以低親和力結(jié)合時(shí)，抗體 或其它化合物"特異性結(jié)合"多肽。多種測定抗體的特異性結(jié)合能力的競爭性結(jié)合或免 疫放射測定法的實(shí)驗(yàn)方案是本領(lǐng)域所熟知的（見例如Maddox藥乂，J. Exp. Med. 158, 1211-1226，1993)。這些免疫測定通常涉及特定蛋白質(zhì)和其抗體間的復(fù)合物的形成以及復(fù) 合物形成的測量。
[0113] 用于本發(fā)明的目的，除非另外規(guī)定，術(shù)語"抗體"包括結(jié)合本發(fā)明多肽的片段。這 些片段包括Fv，F(xiàn)(ab'）和F(ab'） 2片段，以及單鏈抗體。此外，抗體和其片段可為嵌合抗 體、CDR-移植的抗體或人源化抗體。
[0114] 抗體可用于在生物樣品中（例如任意本文提及的這些樣品）檢測本發(fā)明多肽的方 法，所述方法包括： I提供本發(fā)明的抗體； II將生物樣品與所述抗體在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下孵育；和 III測定包含所述抗體的抗體-抗原復(fù)合物是否形成。
[0115] 本發(fā)明的抗體可通過任意合適方法產(chǎn)生。制備和表征抗體的方法是本領(lǐng)域所熟知 的，見例如 Harlow and Lane (1988) "Antibody: A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY。例如，可通過在宿主動物中產(chǎn)生針 對完整多肽或其片段(例如其抗原表位，下文中的"免疫原"）的抗體而產(chǎn)生抗體。片段可為 本文提及的任意片段(通常至少10或至少15個氨基酸長)。
[0116] 產(chǎn)生多克隆抗體的方法包括用免疫原免疫合適的宿主動物，例如實(shí)驗(yàn)動物，并從 動物的血清中分離免疫球蛋白。因此，可用免疫原接種動物，之后從動物中取出血液并純化 IgG部分。產(chǎn)生單克隆抗體的方法包括永生化產(chǎn)生期望抗體的細(xì)胞。通過融合接種的實(shí)驗(yàn) 動物的脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞（Kohler and Milstein (1975) yVaiare 256， 495-497)〇
[0117] 可通過傳統(tǒng)程序選擇產(chǎn)生期望抗體的永生細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞可經(jīng)培養(yǎng)生長或經(jīng)腹 腔注射以形成腹水或注射至同種異體宿主或免疫系統(tǒng)受損的宿主的血流中。人抗體可通過 人淋巴細(xì)胞的體外免疫和之后使用埃-巴二氏病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞制備。
[0118] 為產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體二者，實(shí)驗(yàn)動物合適地為山羊、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、 雞、綿羊或馬。如果需要，免疫原可以偶聯(lián)物的形式施用，其中免疫原(例如通過氨基酸殘基 之一的側(cè)鏈）與合適的載體偶聯(lián)。載體分子通常為生理上可接受的載體。得到的抗體可為 分離的和純化的(如果需要)。
[0119] 檢測試劑盒 本發(fā)明也提供試劑盒，其包含對本文定義的一種或多種多態(tài)性分型的裝置。具體來說， 這些裝置可包括特定的結(jié)合劑、探針、引物、引物對或引物組合、或如本文定義的抗體(包括 抗體片段)，其能夠檢測或輔助檢測本文定義的多態(tài)性。引物或引物對或引物組合可為序列 特異性引物，其只引起包含如本文討論的待檢測的多態(tài)性的多核苷酸序列的PCR擴(kuò)增?？?選地，引物或引物對可能不特異針對多態(tài)核苷酸，而可能特異針對上游（5'）區(qū)和/或下游 (3'）區(qū)。這些引物允許包含多態(tài)核苷酸的區(qū)域被拷貝。適用于引物延伸技術(shù)的試劑盒可 特別地包括標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸（ddNTP)。它們可為例如熒光標(biāo)記的或質(zhì)量修飾的 從而能夠檢測延伸產(chǎn)物和因此測定在多態(tài)位置存在的核苷酸。
[0120] 試劑盒還可包含特異性結(jié)合試劑、探針、引物、引物對或引物組合或能夠檢測多態(tài) 性缺乏的抗體。所述試劑盒還可包含緩沖液或水溶液。
[0121] 試劑盒可另外地包含一種或多種其它能夠?qū)嵤┥鲜龇椒ǖ娜我鈱?shí)施方案的試劑 或設(shè)備。這些試劑或設(shè)備可包括一種或多種以下試劑或設(shè)備：檢測試劑與多態(tài)性結(jié)合的裝 置，可檢測的標(biāo)記物例如熒光標(biāo)記物，能夠作用于多核苷酸的酶，通常為聚合酶，限制性酶， 連接酶，RNA酶H或可將標(biāo)記物連接至多核苷酸的酶，用于酶試劑的合適緩沖液(一種或?qū)?致）或水溶液，與本文討論的多態(tài)性兩側(cè)的區(qū)域結(jié)合的PCR引物，陽性和/或陰性對照，凝 膠電泳設(shè)備，從樣品中分離DNA的裝置，從個體中取得樣品的裝置，例如拭子或包含針的設(shè) 備，或包含孔的支持物，在上面可進(jìn)行檢測反應(yīng)。試劑盒可為或包含陣列例如多核苷酸陣 列，其包含本發(fā)明的特異性結(jié)合試劑，優(yōu)選探針。試劑盒通常包含一套使用試劑盒的說明 書。
[0122] 生物信息學(xué) 多態(tài)性序列可以電子格式儲存，例如在計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫中。由此，本發(fā)明提供了數(shù)據(jù) 庫，其包含與SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或 多種多態(tài)性和它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息。本發(fā)明還提供了數(shù)據(jù) 庫，其包含與G0LGA5、ATP7A或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平 衡的一種或多種多態(tài)性和它們與狗對肝銅積累的敏感性的聯(lián)系相關(guān)的信息。數(shù)據(jù)庫可包括 有關(guān)多態(tài)性的其它信息，例如多態(tài)性與免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的敏感性的聯(lián)系 的程度。
[0123] 本文描述的數(shù)據(jù)庫可用于測定狗基因組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累 的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的敏感性的多態(tài)性。這樣的測定可通過電子裝置實(shí)施，例如通過使用 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(例如PC)。
[0124] 通常地，測定狗基因組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性將 通過下述進(jìn)行：將來自狗的遺傳數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)；比較遺傳數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù) 庫包含與SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和/或與其處于連鎖不平衡的一種或 多種多態(tài)性和它們與狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的聯(lián)系相關(guān)的信息，以及任選地，包含與 G0LGA5、ATP7A或UBL5基因中的一種或多種多態(tài)性和/或與其處于連鎖不平衡的一種或多 種多態(tài)性和它們與狗對肝銅積累的敏感性的聯(lián)系相關(guān)的信息；以及基于此比較測定狗基因 組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。該信息然后可用于指導(dǎo)狗肝銅 水平的管理。
[0125] 本發(fā)明還提供了計(jì)算機(jī)程序，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)，其包含進(jìn)行所有本 發(fā)明方法的所有步驟的程序編碼裝置。還提供了包含在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上儲存的程序編碼 裝置的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，當(dāng)所述程序在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。另外提供 了包含在載波上的程序編碼裝置的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，當(dāng)在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行時(shí)其命令計(jì)算機(jī)系 統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明的方法。
[0126] 如圖4中所示，本發(fā)明還提供了布置進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的設(shè)備。設(shè)備通常包 含計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，例如PC。在一個實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包含：裝置20,用于接收來自狗的 遺傳數(shù)據(jù)；模塊30,用于比較數(shù)據(jù)和包含多態(tài)性相關(guān)信息的數(shù)據(jù)庫10 ;和裝置40,用于基于 所述比較測定狗基因組是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的敏 感性的多態(tài)性。
[0127] 育種工具 定義育種值為個體作為親本的值，其通常在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用于改善牲畜（life-stock)的 期望性狀。為了改善狗的總體銅操縱能力和降低銅相關(guān)疾病例如慢性肝炎的發(fā)生率，選擇 受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗用于育種是有利的。此問題通過使用可用于測定狗是否受到 免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性為育種提供資料而解決。
[0128] 例如，父母在ATP7A基因座的基因型可影響2只狗的后代的銅操縱能力。在此基 因座的特定變體的轉(zhuǎn)移對后代將是有益的。通過測定在此基因座的基因型，有可能評估預(yù) 期親本的育種值并因此作出特定育種對是否合適的決定。
[0129] 由此，本發(fā)明提供了選擇用于產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的狗的方法， 其包括通過本發(fā)明的方法在候選第一只狗中測定狗的基因組中是否包含一種或多種指示 免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性；由此測定候選第一只狗是否適于產(chǎn)生免于肝銅積累的保護(hù) 的后代。所述方法可還包括通過本發(fā)明的方法在第二只與第一只狗性別相反的狗中測定狗 的基因組中是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性。如果結(jié)果是第一只和 /或第二只狗具有指示免于肝銅積累的保護(hù)的基因型，之后可將第一只狗和第二只狗交配 以產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代。
[0130] 例如，方法可包括測定選自SNP ATP7A_Reg3_F_6 (SEQ ID N0:142)和與其處于連 鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性的一種或多種多態(tài)性在候選第一只狗的基因組中的存在或 缺乏。更優(yōu)選地，所述方法包括測定ATP7A_Reg3_F_6 SNP (SEQ ID N0:142)和/或ATP7a_ Regl6_F_42 SNP (SEQ ID N0:143)的存在或缺乏。本發(fā)明的方法可包括測定ATP7A_Reg3_ F_6 SNP (SEQ ID N0:142)的 T 等位基因和 / 或 ATP7a_Regl6_F_42 SNP (SEQ ID N0:143) 的T等位基因的存在或缺乏。仍更優(yōu)選地，所述方法可包括測定狗對SNP ATP7A_Reg3_F_6 和/或SNP ATP7a_Regl6_F_42 (SEQ ID N0:143)的T等位基因是純合的(在雌性狗的情況 下）或半合的(在雄性狗的情況下)。所述SNP的存在指示第一只狗受到免于肝銅積累的保 護(hù)，因此是與第二只狗交配的良好候選者。優(yōu)選地，第一只和第二只狗對所述SNP的T等位 基因?yàn)榧兒匣虬牒系?。在第一只?或第二只狗中的純合性是最優(yōu)選的，因?yàn)檫@增加了后 代是純合的和因此受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性。
[0131] 本發(fā)明還提供了通過使用本發(fā)明的指示對銅積累的敏感性的多態(tài)性而選擇用于 產(chǎn)生受到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的狗的方法。在狗基因組中缺乏這些多態(tài)性指示所述 狗是用于交配的良好候選者。本發(fā)明的方法可因此進(jìn)一步包括測定候選第一只狗的基因組 是否包含一種或多種指示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性；由此測定候選第一只狗是否適于 產(chǎn)生免于肝銅積累的保護(hù)的后代。
[0132] 所述方法可包括測定候選第一只狗的基因組中（c)在G0LGA5、ATP7a或UBL5基因 中指示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性和/或（d)與所述多態(tài)性（c)處于連鎖不平衡的多態(tài) 性的存在或缺乏。所述方法可還包括測定與第一只狗性別相反的第二只狗的基因組是否包 含一種或多種指示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性。所述方法可因此包括檢測在第二只狗的 基因組中（c )在G0LGA5、ATP7a或UBL5基因中指示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性和/或（d ) 與所述多態(tài)性（c)處于連鎖不平衡的多態(tài)性的存在或缺乏。如果結(jié)果是第一只和/或第二 只狗的基因組中沒有指示對肝銅積累的敏感性的基因型，之后可將第一只狗和第二只狗交 配以產(chǎn)生對肝銅積累不敏感的后代。
[0133] 所述方法可包括測定選自表III、IV和V中鑒定的SNP的一種或多種多態(tài)性和與 其處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性在候選第一只狗的基因組中的存在或缺乏。一種或 多種這些多態(tài)性的存在指示第一只狗對肝銅積累敏感，因此不是與第二只狗交配以產(chǎn)生受 到免于肝銅積累的保護(hù)的后代的好候選者。
[0134] 候選第一只狗和/或第二只狗可為任意品種。優(yōu)選地，候選第一只狗和/或第二 只狗具有選自拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬或迷你貴賓犬的品種的遺傳品種特征。更優(yōu)選 地，候選第一只狗和/或第二只狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征。狗可為純種拉布 拉多尋回犬。可選地，狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一方或雙方父母可為純 種拉布拉多尋回犬。狗的1、2、3或4個祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景 中可具有至少50%或至少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少 75%可來源于拉布拉多尋回犬品種。
[0135] 通過評估遺傳標(biāo)記物(例如SNP或微衛(wèi)星)的等位基因頻率可測定狗的遺傳品種背 景。在狗中不同SNP或微衛(wèi)星的等位基因頻率的組合提供了允許測定狗品種或產(chǎn)生混種狗 的品種的識別標(biāo)志。這樣的遺傳檢測可為市售的檢測?；蛘撸恍枰獧z測狗的特定品種遺 傳特征，因?yàn)槔绻分魅嘶颢F醫(yī)懷疑其具有特定品種遺傳特征。這可能是由于例如知道狗 的祖先或由于其外觀。
[0136] 通過"封閉的（closed)血統(tǒng)證書"控制由所有品種的俱樂部登記驗(yàn)證的大多數(shù)品 種純種狗。血統(tǒng)證書通常是由例如品種協(xié)會或養(yǎng)犬俱樂部保存的被認(rèn)可的特定品種狗的 官方登記。如果只有其父母均為登記的情況下狗才可加入的話，通常稱為"封閉的"血統(tǒng)證 書。大多數(shù)品種具有封閉的血統(tǒng)證書，這導(dǎo)致近交，因?yàn)椴荒軓默F(xiàn)有種群以外引入遺傳多樣 性。在多個由養(yǎng)犬俱樂部認(rèn)可的品種中這已導(dǎo)致遺傳疾病或病的高發(fā)率和其它問題例如降 低的產(chǎn)仔數(shù)，降低的壽命和不能自然懷孕。
[0137] 為了避免與近交相關(guān)的問題，在特定品種中選擇彼此關(guān)系較遠(yuǎn)的狗比起關(guān)系較近 的狗進(jìn)行育種是有利的。因此在本發(fā)明的一個方面，測定候選第一只狗和候選第二只狗的 遺傳品種特征以測定2只狗的相關(guān)度。在本發(fā)明的此方面，術(shù)語"遺傳品種特征"涉及在特 定品種中狗的遺傳祖先?？赏ㄟ^本文描述的方法測定狗的遺傳品種特征。通過測定狗的遺 傳特征，有可能在單一品種中辨別2只狗以測定它們的關(guān)系有多近。
[0138] 因此，在本發(fā)明的一個方面測定候選第一只狗和候選第二只狗的相關(guān)度，其包括 比較候選第一只狗和相同品種的候選第二只狗的遺傳品種特征。優(yōu)選地，所述狗為純種狗。 每只狗的遺傳品種特征可通過例如鑒定在所述狗中的一種或多種品種特異多態(tài)性的存在 或缺乏而測定。
[0139] 可通過狗共有的品種特異性多態(tài)性的數(shù)目測定狗的相關(guān)度。例如，相同品種的2 只狗可共有從0至100%的檢測的品種特異多態(tài)性，例如從10至90%，從20至80%，從30至 70% 或從 40 至 60%。因此，2 只狗可共有至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 90% 檢 測的品種特異多態(tài)性?？墒褂?只狗共有的檢測的品種特異多態(tài)性的比例作為相關(guān)度的衡 量。在本發(fā)明的此方面，只有當(dāng)2只狗在遺傳上足夠地不相關(guān)時(shí)才可將其交配在一起。例 如，只有當(dāng)它們共有的檢測的品種特異多態(tài)性低于60%、50%、40%、30%或低于20%時(shí)才可將 其交配在一起。
[0140] 本發(fā)明還提供了選擇用于與受試狗育種的一只或多只狗的方法，所述方法包括： (a) 測定在受試狗和與受試狗性別相反的2只或多只狗組成的實(shí)驗(yàn)組中的每只狗的基 因組中是否包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性以及任選地一種或多種指 示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性；和 (b) 從實(shí)驗(yàn)組中選擇1只或多只狗用于與受試狗育種。
[0141] 實(shí)驗(yàn)組可由至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、75、100或200只不同的狗組成，例 如從2至100,從5至70或從10至50只狗。通常基于受到免于肝銅積累的保護(hù)從實(shí)驗(yàn)組 中選擇狗。從實(shí)驗(yàn)組中選擇的一只或多只狗可與受試狗具有相同或相似的遺傳品種特征。
[0142] 受試狗和實(shí)驗(yàn)組中的每只狗可為任意品種。優(yōu)選地，受試狗和/或?qū)嶒?yàn)組中的每 只狗具有選自拉布拉多尋回犬、金毛尋回犬或迷你貴賓犬的品種的遺傳品種特征。更優(yōu)選 地，狗具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳品種特征。狗可為純種拉布拉多尋回犬?？蛇x地，狗 可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一方或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗 的1、2、3或4個祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至 少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來源于拉布拉多 尋回犬品種。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，選擇基于免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的 敏感性的相關(guān)多態(tài)性的存在或缺乏的、實(shí)驗(yàn)組中最可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的狗與受 試狗育種。在另一個實(shí)施方案中，選擇實(shí)驗(yàn)組中可能受到免于肝銅積累的保護(hù)的幾只狗與 受試狗育種。例如，可選擇實(shí)驗(yàn)組中的至少2、3、4、5、10、15或20只狗?？苫谄渌蛩乩?如地理位置、年齡、育種狀態(tài)、病史、疾病敏感性或身體特征從選擇的狗的組中進(jìn)行進(jìn)一步 的選擇。
[0143] 如上面解釋的，交配相同品種中遺傳最不相關(guān)的狗是理想的。這是為了提高或維 持品種中的遺傳多樣性和降低在子代中發(fā)生近交相關(guān)問題的可能性。因此，從實(shí)驗(yàn)組中進(jìn) 一步選擇狗可基于狗與受試狗的遺傳相關(guān)性。由此，在本發(fā)明的一個方面，所述方法可進(jìn)一 步包括： (a)比較受試狗的遺傳品種特征和與受試狗品種相同且性別相反的2只或多只狗組成 的實(shí)驗(yàn)組中的每只狗的遺傳品種特征； (b) 根據(jù)受試者和實(shí)驗(yàn)組中每只狗的相關(guān)度的比較測定；和 (c) 從實(shí)驗(yàn)組中選擇用于與受試狗育種的1只或多只狗。
[0144] 可基于其與受試狗（即待育種的狗）的相關(guān)性從實(shí)驗(yàn)組中選擇狗。優(yōu)選地，從實(shí)驗(yàn) 組中選擇的一只或多只狗是在狗實(shí)驗(yàn)組中相關(guān)性最遠(yuǎn)的（即具有最低的相關(guān)度)。受試狗和 實(shí)驗(yàn)組中的狗的遺傳品種特征可為已知的或可通過例如市售的品種檢測法測定。
[0145] 本發(fā)明因此提供了推薦用于與受試狗育種的1只或多只合適的狗的方法。所述推 薦可對受試狗的主人或照顧者、獸醫(yī)、狗育種家、養(yǎng)犬俱樂部或品種登記進(jìn)行。
[0146] 本發(fā)明還涉及育種狗的方法，其中測定性別相反的至少2只狗受到免于肝銅積累 的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的敏感性，任選地在相同的品種中，在它們在一起育種以前測定。
[0147] 可以電子格式存儲狗受到免于肝銅積累的保護(hù)或?qū)Ω毋~積累的敏感性，例如在計(jì) 算機(jī)的數(shù)據(jù)庫中。由此，本發(fā)明提供了包含涉及1只或多只狗對肝銅積累的敏感性或受到 免于肝銅積累的保護(hù)和性別的信息的數(shù)據(jù)庫。所述數(shù)據(jù)庫可包括有關(guān)狗的進(jìn)一步信息，例 如狗的遺傳品種特征、育種狀態(tài)、年齡、地理位置、病史、疾病敏感性或身體特征。數(shù)據(jù)庫通 常還包含每只狗的唯一標(biāo)識符，例如狗的登記名。數(shù)據(jù)庫可通過遠(yuǎn)程訪問，例如使用互聯(lián) 網(wǎng)。
[0148] 本發(fā)明的食品 本發(fā)明涉及用于具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗的食品。
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)在商業(yè) 飲食中發(fā)現(xiàn)的銅水平與拉布拉多尋回犬中的肝銅積累相關(guān)，降低飲食中的銅水平令人驚訝 地使肝銅水平回到正常水平，比藥物青霉胺更有效。本發(fā)明的食品具有低銅濃度，具體地低 于21mg/kg干物質(zhì)的銅濃度。食品被用于預(yù)防在拉布拉多尋回犬的肝中的銅積累。因此其 對預(yù)防由肝銅積累引起的疾病或病癥有用。因此，本發(fā)明的食品可提供給狗，其中所述狗的 基因組已通過本發(fā)明的方法被測定為包含一種或多種指示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性。 本文中使用的術(shù)語"食品"包含食品、飲食、食物或補(bǔ)充劑。這些形式中的任一種可為固體、 半固體或液體。
[0149] 更具體地，本發(fā)明的食品包含低于21 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅。優(yōu)選地，銅濃度低 于20,低于17,低于15,低于12,低于10或低于8mg/kg干物質(zhì)。優(yōu)選地，銅濃度為至少3， 至少3. 5,至少4,至少4. 5,至少4. 75,至少5或至少8mg/kg干物質(zhì)。通常地，銅濃度在3 至 21 mg/kg,優(yōu)選 4 至 12mg/kg，4. 5 至 12mg/kg，4 至 llmg/kg，4. 5 至 llmg/kg，4 至 IOmg/ kg, 4. 5 至 10mg/kg，4 至 9mg/kg，4. 5 至 9mg/kg，4 至 8 mg/kg 或 4. 5 至 8 mg/kg 干物質(zhì)的 范圍內(nèi)。銅可以任意生理上可接受的形式存在于食品中。因此可以任意生理上可接受的鹽 例如硫酸銅提供銅。
[0150] 食品可進(jìn)一步包含至少120 mg/kg干物質(zhì)濃度的鋅。優(yōu)選地，鋅濃度為至少150， 至少180或至少200 mg/kg干物質(zhì)。優(yōu)選地，鋅濃度不超過食物監(jiān)管機(jī)構(gòu)允許的最大值。 鋅濃度通常低于250,低于240,低于230或低于220 mg/kg干物質(zhì)。鋅濃度通常在120至 250，150至250或200至250 mg/kg干物質(zhì)的范圍內(nèi)。
[0151] 優(yōu)選地，食品中的鋅量超過銅量。應(yīng)當(dāng)理解，狗吸收的食品中的鋅和/或銅的有效 濃度受到不可消化物質(zhì)的存在或缺乏的影響。優(yōu)選地，食品中的鋅與銅的比例為5或更多， 例如6、7、8、9、10或更多，按食品的質(zhì)量計(jì)算。
[0152] 可在本發(fā)明的提供銅水平的相同食品中提供鋅?？蛇x地，可以補(bǔ)充劑的形式提供 鋅，所述補(bǔ)充劑可加入本發(fā)明的食品。補(bǔ)充劑可為片劑、粉末或液體制劑的形式。鋅可以任 意生理上可接受的形式存在于食品中或作為補(bǔ)充劑提供。因此鋅可為任意生理上可接受的 鹽，例如醋酸鋅、硫酸鋅、葡萄糖酸鋅、碳酸鋅、氯化鋅或氧化鋅。
[0153] 本文中描述的食品中的銅或鋅濃度是以干物質(zhì)計(jì)，即以不含水的食品計(jì)，從而能 夠直接比較可能具有不同含水量的不同食品。為測量在濕的或半濕的食品中的銅或鋅濃 度，首先干燥食品樣品，例如使用烤箱以去除水。之后，可使用任意合適的技術(shù)測量干燥食 品樣品中的銅或鋅濃度。這些技術(shù)的一個實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的火焰原子吸收光譜法。
[0154] 本發(fā)明的食品可為例如濕寵物食品、半濕寵物食品或干寵物食品的形式。濕寵物 食品通常具有高于以重量計(jì)65%的含水量。半濕寵物食品通常具有以重量計(jì)20-65%之間 的含水量并可包含保濕劑和其它配料以防止微生物生長。干寵物食品（又稱粗磨粉)通常具 有低于以重量計(jì)20%的含水量，其加工過程通常包括擠壓、干燥和/或高溫烘焙。
[0155] 食品可以濕和干食物的混合物提供。這樣的組合物可預(yù)先混合提供，或以2種或 多種單獨(dú)的食品提供，其單獨(dú)、同時(shí)或相繼提供給狗。
[0156] 食品包含任意狗在其飲食中消耗的產(chǎn)品。本發(fā)明包含標(biāo)準(zhǔn)食物產(chǎn)品和寵物食品點(diǎn) 心。優(yōu)選地，食品為煮熟的食品。其可包括肉或動物來源的材料(例如牛肉、雞肉、火雞肉、 羊肉、魚肉等等)。可選地，產(chǎn)品可為不含肉的(優(yōu)選地包含肉替代物例如大豆、玉米蛋白或 大豆產(chǎn)品以提供蛋白質(zhì)來源)。產(chǎn)物可還包含淀粉來源，例如一種或多種谷物(例如玉米、大 米、燕麥、大麥等等)，或可為不含淀粉的。
[0157] 干寵物食品的配料可選自谷類、谷物、肉、家禽、脂肪、維生素和礦物質(zhì)。配料通常 為混合的并經(jīng)擠壓機(jī)/炊具處理。然后產(chǎn)品通常經(jīng)定型和干燥，干燥后，可在干的產(chǎn)品上涂 或噴灑調(diào)料和脂肪。
[0158] 所有寵物食品都需要提供一定水平的營養(yǎng)素。例如，美國飼料品管協(xié)會 (Association of American Feed Control 0fficials)(AAFC0)和寵物食品協(xié)會（Pet Food Institute)已基于通常使用的配料建立了狗食品的營養(yǎng)素組成（profile)。這些建立的組 成被稱為"AAFC0狗食品營養(yǎng)素組成"。在這些監(jiān)管下，狗食品必須被配制為包含達(dá)到AAFCO 測定的所有最低水平和不超過AAFCO測定的最高水平濃度的營養(yǎng)素。
[0159] 狗食品制劑可根據(jù)狗的熱量、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、纖維、維生素或礦物質(zhì)需 求定制。例如，狗食品制劑可定制為提供準(zhǔn)確量或比例的必需脂肪酸例如ω-6和ω-3脂 肪酸。ω-6脂肪酸的主要來源為植物，例如向日葵、大豆油、紅花和月見草油，而ω-3脂肪 酸主要在亞麻籽和海產(chǎn)來源中發(fā)現(xiàn)。銅含量高的和可在食品生產(chǎn)中避免的食物配料包括貝 類、肝、腎、心、肉、堅(jiān)果、蘑菇、谷類、可可、豆科植物和軟水(銅管道)。富含鋅和可在制劑中 包括的食物配料包括奶、明膠、蛋黃、大米和馬鈴薯。
[0160] 食品優(yōu)選為包裝的。包裝材料可為金屬(通常以錫或flexifoil的形式)、塑料(通 常以小袋或瓶子的形式)、紙或卡片。在任意產(chǎn)品中的含水量可影響可使用的或需要的包裝 的種類。
[0161] 本發(fā)明的食品可與鋅來源一起包裝。鋅可以任意形式提供。鋅可在一種或多種食 品中提供，或以單獨(dú)的補(bǔ)充劑的形式與包含本發(fā)明的最高水平的銅的食品一起包裝。當(dāng)在 食品中提供鋅時(shí)，可在包含本發(fā)明的特定水平的銅的相同食品中提供鋅，或可在一種或多 種單獨(dú)的食品中提供鋅，或二者都提供鋅。本發(fā)明因此提供了包含具有低于21 mg/kg干物 質(zhì)濃度的銅的食品和鋅補(bǔ)充劑的包裝。當(dāng)加入食品中時(shí)，鋅補(bǔ)充劑提供至少120mg/kg干物 質(zhì)的濃度。食品和鋅補(bǔ)充劑用于同時(shí)、單獨(dú)或相繼使用以在具有拉布拉多尋回犬品種的遺 傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。
[0162] 本發(fā)明還提供如本文討論的帶標(biāo)簽的食品。標(biāo)簽可例如指示所述食品適用于拉布 拉多尋回犬品種的狗?？商峁┢渌甘净蛘f明。例如，可陳述除了其它配料以外，飲食或食 品包含的銅和/或鋅的量。此外，可提供喂食說明。
[0163] 拉布拉多尋回犬 本發(fā)明的食品適用于在具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗中預(yù)防肝銅積累。狗 通常為伴侶狗或?qū)櫸?。狗可為純種拉布拉多尋回犬。狗可為純種拉布拉多尋回犬。可選地， 狗可為混種或雜交狗，或遠(yuǎn)交狗(雜種)。狗的一方或雙方父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗 的1、2、3或4個祖父母可為純種拉布拉多尋回犬。狗在其遺傳背景中可具有至少50%或至 少75%的拉布拉多尋回犬品種。因此，狗基因組的至少50%或至少75%可來源于拉布拉多 尋回犬品種。
[0164] 通過評估遺傳標(biāo)記物(例如SNP或微衛(wèi)星)的等位基因頻率可測定狗的遺傳品種背 景。在狗中不同SNP或微衛(wèi)星的等位基因頻率的組合提供了允許測定狗品種或產(chǎn)生混種狗 的品種的識別標(biāo)志。這樣的遺傳檢測可為市售的檢測?；蛘?，可不需要檢測狗的拉布拉多 尋回犬品種特征，因?yàn)槔绻分魅嘶颢F醫(yī)懷疑其具有拉布拉多尋回犬品種特征。這可能是 由于例如知道狗的祖先或由于其外觀。
[0165] 食品適用于任意年齡的狗。食品可適用于具有從0至12歲大，例如從1至5歲大， 從2至7歲大或從3至9歲大的年齡的狗。
[0166] 食品通常適用于健康的狗。其適用于沒有可檢測出的肝銅積累的狗。食品計(jì)劃用 于預(yù)防用途，即預(yù)防在狗肝中的銅積累。食品旨在使狗的銅積累風(fēng)險(xiǎn)最小從而降低狗產(chǎn)生 由肝銅積累導(dǎo)致的疾病或病癥例如慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭的可能性。食品通常用 于在沒有異常肝銅濃度和因此不太可能具有患銅相關(guān)肝炎的風(fēng)險(xiǎn)的狗中預(yù)防銅積累。狗也 可不具有積累銅的歷史。因此狗優(yōu)選地具有正常水平的在低于約400 mg/kg干肝重范圍內(nèi) 的肝銅。然而，在新生的狗中，肝銅的正常水平可被認(rèn)為是低于約600 mg/kg干肝重。為狗 提供食品的目的是預(yù)防肝銅濃度達(dá)到顯著高于正常水平的水平?？捎糜跍y定狗肝中的銅濃 度的方法是本領(lǐng)域熟知的。在實(shí)施例4中描述了一個合適的方法。
[0167] 食品可用于預(yù)防銅相關(guān)慢性肝炎。食品優(yōu)選地用于在沒有可檢測出的肝疾病的 狗中預(yù)防銅積累，目的是預(yù)防這些肝疾病。食品也可用于治療由肝銅積累導(dǎo)致的疾病或病 癥，例如慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭。肝疾病的證據(jù)或癥狀包括臨床指征例如嗜睡、腹 瀉和黃疸。肝疾病的生化指征包括異常提高的血清膽紅素和血清肝酶活性例如堿性磷酸酶 (ALP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。這些肝疾病指征 的生化測量是本領(lǐng)域熟知的。
[0168] 優(yōu)選地，食品計(jì)劃用于的狗沒有任何臨床問題。
[0169] 食品的制造 可通過將合適的配料混合在一起制造本發(fā)明的食品。制造是受控的以使食品具有所 需要的銅濃度。可在食品生產(chǎn)過程中監(jiān)控銅濃度。本發(fā)明因此提供了制造本發(fā)明的食品的 方法，其包括將用于食品的配料混合在一起以使食品具有低于21 mg/kg干物質(zhì)的銅濃度。 待摻入食品的一種或多種成分可提供銅來源。然而避免使用可能富含銅的成分是重要的。 富含銅的和在食品生產(chǎn)中可能避免的食品配料包括貝類、肝、腎、心、肉、堅(jiān)果、蘑菇、谷類、 可可、豆科植物和軟水(銅管道)。任選地，一種或多種成分將提供用于本發(fā)明的食品的鋅來 源。富含鋅的和在制劑中可能包括的食品配料包括奶、明膠、蛋黃、大米和馬鈴薯?？稍谑?品的制造/加工過程中的任意時(shí)間加入成分/配料。
[0170] 測量在食品中存在的銅濃度以確定濃度低于根據(jù)本發(fā)明的限度是重要的。也可測 量鋅濃度以檢查其高于根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的最低水平。在食品制造方法的一個步驟中可包 括測量食品樣品中的銅濃度。在已制備好食品后對食品樣品至少進(jìn)行一次銅濃度的測量。 也可在食品的制備過程中進(jìn)行測量以監(jiān)控由于更多配料的加入而積累的銅和/或鋅的水 平。例如，在加入一種或多種配料后可對樣品進(jìn)行測量?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任意合適方 法例如火焰原子吸收光譜法對樣品進(jìn)行銅、鋅和其它元素的測量。
[0171] 本發(fā)明的制造食品的方法通常包括以下步驟：將配料混合在一起并任選地烹調(diào)任 意原配料；在食品樣品中測量銅濃度和任選地測量鋅濃度；和包裝食品。制造食品的方法 可進(jìn)一步包括將食品提供給狗主人、負(fù)責(zé)喂養(yǎng)狗的人或獸醫(yī)和/或?qū)⑹称诽峁┙o狗。
[0172] 雖然食品不含有任何銅是罕見的，可將銅作為補(bǔ)充劑加入食品以獲得在狗飲食中 的銅的最低每日需求(例如美國飼料品管協(xié)會(AAFCO)推薦的）同時(shí)將銅濃度仍保持在低于 本發(fā)明所需的量。本發(fā)明因此也提供了銅在制造用于具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征 的狗的食品中的用途，其中所述食品包含低于21 mg/kg濃度的銅并用于預(yù)防在所述狗中的 銅積累。銅可以任意合適的形式加入食品。銅補(bǔ)充劑的實(shí)例包括氯化銅和五水合硫酸銅。 在本發(fā)明中使用的制造食物產(chǎn)品的設(shè)備通常包含一種或多種以下組成部分：用于干寵物食 品配料的容器；用于液體的容器；混合器；成型機(jī)頭和/或擠壓機(jī)；切斷裝置；烹飪裝置(例 如烤箱）；冷卻器；包裝裝置；和貼標(biāo)簽裝置。干配料容器通常在底部具有開口。此開口可 被體積調(diào)節(jié)元件例如回轉(zhuǎn)式塞（rotary lock)覆蓋。體積調(diào)節(jié)元件可根據(jù)電子制造指令開 和關(guān)以調(diào)節(jié)干配料加入寵物食品。在制造寵物食品中通常使用的干配料包括玉米、小麥、肉 和/或家禽肉。在制造寵物食品中通常使用的液體配料包括脂肪、動物脂和水。液體容器 可含有可控的泵，例如通過電子制造指令在寵物食品中加入測量過的量的液體。
[0173] 在一個實(shí)施方案中，干配料容器(一個或多個）和液體容器(一個或多個）與混合器 連接并傳遞特定量的干配料和液體至混合器?；旌掀骺墒茈娮又圃熘噶羁刂啤＠?，可控制 混合的持續(xù)時(shí)間或速度。之后通常將混合的配料傳遞至成型機(jī)頭或擠壓機(jī)。成型機(jī)頭/擠 壓機(jī)可為本領(lǐng)域已知的可用于將混合的配料成型為需要的形狀的任意成型機(jī)頭或擠壓機(jī)。 通?；旌系呐淞显趬毫ο聫?qiáng)制通過受限的開口以形成連續(xù)的帶（strand)。當(dāng)帶被擠壓后， 可通過切斷裝置例如刀將其切成小塊（粗磨粉)。通常對粗磨粉進(jìn)行烹飪，例如在烤箱中。 可通過電子制造指令控制烹飪的時(shí)間和溫度。烹飪的時(shí)間可以變化以產(chǎn)生食品的預(yù)期含水 量。之后可將烹飪后的粗磨粉轉(zhuǎn)移至冷卻器，例如含有一個或多個風(fēng)扇的室。
[0174] 寵物食品制造設(shè)備可包含包裝設(shè)備。包裝設(shè)備通常將寵物食品包裝進(jìn)例如塑料或 紙袋或盒的容器。設(shè)備可還包含在寵物食品上貼標(biāo)簽的裝置，通常在已包裝好食品之后。標(biāo) 簽可指示食品適用的狗的種類（即拉布拉多尋回犬）和/或食品的配料。
[0175] 食品的用途 本發(fā)明的食品可用于預(yù)防狗的肝銅積累的方法。因此，其可用于預(yù)防與高肝銅相關(guān)的 疾病或病癥，例如銅相關(guān)慢性肝炎、肝硬化或肝功能衰竭。由此，本發(fā)明提供了在具有拉布 拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗中預(yù)防肝銅積累和由肝銅積累導(dǎo)致的疾病的方法，其包括 對狗喂食本文中描述的食品。本發(fā)明還提供了在具有拉布拉多尋回犬品種的遺傳特征的狗 中預(yù)防銅相關(guān)慢性肝炎的方法，其包括對狗提供本發(fā)明的食品。本發(fā)明的食品通常用于在 拉布拉多尋回犬中預(yù)防銅積累的預(yù)防用途。其也通常用于在拉布拉多尋回犬中預(yù)防銅相關(guān) 慢性肝炎。
[0176] 本發(fā)明的食品優(yōu)選地用于預(yù)防狗的肝銅積累的方法，通過本文描述的遺傳檢測已 測定所述狗的基因組中不包含一種或多種指示免于肝銅積累的保護(hù)的多態(tài)性，以及任選地 已測定包含一種或多種指示對肝銅積累的敏感性的多態(tài)性。
[0177] 因此，本發(fā)明提供在狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病的方法，所述狗具有拉布拉 多尋回犬品種遺傳特征，所述方法包括（i)測定狗受到免于肝銅積累的保護(hù)的可能性，其包 括測定在狗基因組中選自下述的一種或多種多態(tài)性的存在或缺乏：(a) SNP ATP7A_Reg3_ F_6 (SEQ ID NO: 142)和（b)與（a)處于連鎖不平衡的一種或多種多態(tài)性；以及（ii)向狗 開出、提供或喂食含至少4. 5至小于12mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食物。食物可以提供給狗 主人、照顧者或獸醫(yī)。本發(fā)明還提供用于所述方法的食物。
[0178] 本發(fā)明的食品的用途可包括對狗提供鋅來源。如本文中描述的，可以任意合適的 形式將鋅提供給狗。包含低水平的本發(fā)明的銅的食品可進(jìn)一步包含鋅，例如以至少120 mg/ kg干物質(zhì)的濃度?？蛇x地，可以一種或多種單獨(dú)的食品或補(bǔ)充劑的形式提供鋅。本發(fā)明的 食品的用途可包括對狗提供鋅補(bǔ)充劑?？稍谌我鈺r(shí)間提供鋅補(bǔ)充劑，即與本發(fā)明的食品單 獨(dú)、同時(shí)或相繼提供。鋅補(bǔ)充劑可在例如將其提供給狗之前與本發(fā)明的食品混合，或可將其 置于狗的飲用水中。
[0179] 本發(fā)明的食品可每天一次或多次提供給狗。優(yōu)選地，提供食品代替狗的傳統(tǒng)食品。 可在無限期的時(shí)間內(nèi)（即在狗的一生中）使用預(yù)防銅積累或預(yù)防慢性肝炎的方法。
[0180] 通過以下實(shí)施例說明本發(fā)明： 實(shí)施例1 與對銅積累的敏感性相關(guān)的SNP的說明 對120只拉布拉多犬的DNA樣品在超過22000個SNP上進(jìn)行基因分型。72個狗樣品來 自高銅狗(高于600 mg/kg的肝銅水平)，48個狗樣品來自正常肝銅水平(低于400 mg/kg)。 使用成對比較在每對可能的狗之間分析數(shù)據(jù)。根據(jù)疾病信息基因座的支持整理數(shù)據(jù)。使用 最佳的3個基因組位置的數(shù)據(jù)使用布爾算子尋找與高銅水平相聯(lián)系的最佳匹配標(biāo)記。使用 3個位置的簡單布爾模型的結(jié)果顯示如下： 表1使用基因組位置CFA8、CFA32和CFAX的簡單布爾模型的結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種包含4. 5至12 mg/kg干物質(zhì)濃度的銅的食品,其用于制備一種套裝，所述套裝 用于在具有拉布拉多尋回犬品種遺傳特征的狗中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其中預(yù)防所述狗中由肝銅積累導(dǎo)致的疾病包括向所述狗提 供所述食品，每天一次或多次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其中預(yù)防所述狗中由肝銅積累導(dǎo)致的疾病包括在所述狗的 一生中持續(xù)給所述狗喂食所述食品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其進(jìn)一步包含至少120 mg/kg干物質(zhì)濃度的鋅。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其包含4. 5至10 mg/kg或4. 5至8 mg/kg干物質(zhì)濃度的 銅。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其包含120至250 mg/kg或150至250 mg/kg干物質(zhì)濃度 的鋅。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其用于制備一種套裝，所述套裝用于在具有下述特征的狗 中預(yù)防由肝銅積累導(dǎo)致的疾?。?(i) 具有至少一個親本是純種拉布拉多尋回犬； (ii) 沒有與肝銅積累相關(guān)的臨床癥狀； (iii) 具有低于400 mg/kg干肝重的肝銅濃度；和/或 (iv) 沒有可檢測到的肝疾病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其用于制備一種套裝，所述套裝用于預(yù)防銅相關(guān)慢性肝炎。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的食品，其中已通過以下方法測定所述狗受到免于肝銅積累的保護(hù) 或易患肝銅積累的可能性，所述方法包括對來自所述狗的DNA樣品進(jìn)行由SEQ ID NO:42的 102位置表示的SNP ATP7a_Reg3_F_6的直接或間接分型。
10. 帶標(biāo)簽的根據(jù)權(quán)利要求1的食品或套裝。
【文檔編號】A23K1/00GK104273317SQ201410227480
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日:2009年4月8日
【發(fā)明者】P.G.瓊斯, A.J.馬丁 申請人:瑪爾斯有限公司