一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型及其建立方法。所述的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型包括前肢肩背部皮下接種有處理過的肝癌組織塊的小鼠。其建立方法包括取新鮮肝癌組織，對其進行處理，將處理后的肝癌組織塊接種于無瘤小鼠前肢肩背部皮下，常規(guī)飼養(yǎng)，得到肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型。本發(fā)明建立過程簡單易行，成瘤發(fā)生率達40％-50％，可用于肝癌藥物篩選及肝癌機制研究。通過本發(fā)明建立的肝癌患者來源異種移植瘤模型具有制作過程簡單易行，操作所致死亡率低，成功率高、易于推廣；可大批制作且同步性好的優(yōu)點，適用于藥物篩選及實驗研究。
【專利說明】一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝癌是位列全世界第五、我國第三的惡性腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計，在2030年前，肝癌都將保持持續(xù)增長，其病死率更是高居第二位。目前，外科手術(shù)仍是肝癌的主要治療方法之一，但超過60%的肝癌患者在初次就診時已經(jīng)進入中晚期并伴有轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，從而失去手術(shù)治療的機會。
[0003]腫瘤動物模型是進行腫瘤相關(guān)機制和藥物篩選研究的重要平臺。目前，臨床前腫瘤動物模型多采用腫瘤細胞系懸液建模的方法，它具有腫瘤細胞系易獲得和實驗易重復(fù)等優(yōu)點。但是利用細胞系建立的腫瘤模型存在諸多缺陷。腫瘤細胞在體外建系的過程脫離了自然的腫瘤微環(huán)境，導致其基因發(fā)生改變；體外培養(yǎng)過程中選擇性壓力以及經(jīng)過消化酶處理，破壞腫瘤組織及細胞異質(zhì)性與原結(jié)構(gòu)，一株細胞系所建立的動物模型僅能反映一個癌癥病人；細胞系所成的腫瘤缺乏原發(fā)瘤相關(guān)微環(huán)境組份。最終導致腫瘤生物學行為和自然屬性不可逆性改變，嚴重阻礙人類對腫瘤機制及治療應(yīng)答的研究，它已成為影響肝癌療效改善的瓶頸，亟待解決。
[0004]肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型直接將手術(shù)切除肝癌組織種植在免疫缺陷小鼠體內(nèi)，最大程度地模擬了人體內(nèi)環(huán)境，保留腫瘤的特異基因、分子及其組織學異質(zhì)性，可廣泛應(yīng)用于肝癌病因、發(fā)病機制、發(fā)展過程及治療。與傳統(tǒng)人癌細胞系建立的腫瘤動物模型相比，人源性腫瘤動物模型由于減少了體外處理步驟，可以更好地保持臨床腫瘤組織的原始生物學特征和組織學特征，最大程度地保存了腫瘤的微環(huán)境，包括腫瘤細胞、浸潤的淋巴細胞、成纖維細胞、細胞外間質(zhì)和脈管系統(tǒng)；并且人源性移植瘤模型來自于不同的患者且沒有經(jīng)過人工培養(yǎng)，能夠反映患者的遺傳多樣性。因此，人源性移植瘤模型將更為準確地預(yù)測藥物的臨床試驗結(jié)果，為腫瘤個體化治療提供更加合理的方案設(shè)計，是一種較為理想的人腫瘤動物模型。美國著名的杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory)以每只上千美元價格出售腫瘤患者來源異種移植瘤小鼠模型。法國工業(yè)部對此模型計劃資助金額高達540萬歐元。因此，腫瘤患者來源異種移植瘤模型己形成了一個巨大的市場。目前，腫瘤患者來源異種移植瘤小鼠模型作為一種新型腫瘤模型，主要集中在乳腺癌及肺癌研究，其原因為肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型成功率極低。Yan M等2013年在Chin J Cancer Res報道構(gòu)建肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型方法為:將肝癌組織分割成2mm3小塊后直接移植在小鼠的肩胛下方。該方法種植成功率僅為20.83%。
[0005]因此，為了適應(yīng)臨床和科研需要，亟需一種新的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型構(gòu)建方法，該方法可大幅提高模型種植成功率，所構(gòu)建模型適用于藥物篩選及實驗研究，同時還具有制作過程簡單易行，操作所致死亡率低，成功率高、易于推廣的特點。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的第一個目的在于克服現(xiàn)有肝癌模型的不足，提供一種能高度還原人類肝癌遺傳學信息及生物學特性的動物模型，以滿足醫(yī)藥市場對的需求。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供肝癌患者來源異種移植瘤模型的一種構(gòu)建方法，大幅提高模型種植成功率。
[0008]為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型，其特征在于，包括前肢肩背部皮下接種有處理過的肝癌組織塊的小鼠。
[0009]優(yōu)選地，所述的小鼠為非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠。
[0010]本發(fā)明還提供了上述的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，具體步驟包括:取新鮮肝癌組織，對其進行處理，將處理后的肝癌組織塊接種于無瘤小鼠前肢肩背部皮下，常規(guī)飼養(yǎng)，得到肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型。
[0011]優(yōu)選地，所述的新鮮肝癌組織的處理方法包括:將新鮮肝癌組織放入含培養(yǎng)液的試管中移至超凈臺，備用；取出新鮮肝癌組織，用培養(yǎng)液沖洗2-3次，分割成體積為8-32mm3的肝癌組織塊，用無菌孵育液在1-10°C浸沒肝癌組織塊30-90分鐘，得到處理后的肝癌組織塊。
[0012]更優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液，其制備方法為:將90體積份的DMEM與10體積份的胎牛血清混合，加入青霉素和鏈霉素，得到DMEM培養(yǎng)液，其中，青霉素的終濃度為50-200U/ml，鏈霉素的終濃度為50_200U/ml。
[0013]更優(yōu)選地，所述的無菌孵育液的制備方法為:將45體積份的DMEM，5體積份的胎牛血清和50體積份的Matrigel膠混合，加入表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、青霉素和鏈霉素，得到無菌孵育液，其中，表皮生長因子的終濃度為5-20ng/ml，成纖維細胞生長因子的終濃度為5-20ng/ml，青霉素的終濃度為50_200U/ml，鏈霉素的終濃度為 50-200U/mL.[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0015]本發(fā)明將患者肝癌組織直接接種在實驗小鼠的前肢肩背部皮下，保留腫瘤微環(huán)境，忠實地還原它所對應(yīng)的患者中的相關(guān)特征，整個模型建立過程簡單易行，成瘤發(fā)生率達40%-50%，可用于肝癌藥物篩選及肝癌機制研究。通過本發(fā)明建立的肝癌患者來源異種移植瘤模型具有制作過程簡單易行，操作所致死亡率低，成功率高、易于推廣；可大批制作且同步性好的優(yōu)點，適用于藥物篩選及實驗研究。
【具體實施方式】
[0016]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0017]將相同壽命在3-4周、雄性的120只非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠分為A、B、C、D四組，每組數(shù)量為30只。
[0018]實施例1
[0019]一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接種有處理過的肝癌組織塊的小鼠構(gòu)成，其建立方法為:
[0020](I)配制培養(yǎng)液:將90體積份的DMEM與10體積份的胎牛血清混合，加入青霉素和鏈霉素，得到DMEM培養(yǎng)液，其中，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到培養(yǎng)液。
[0021](2)配制無菌孵育液:將45體積份的DMEM，5體積份的胎牛血清和50體積份的Matrigel膠(BD公司；貨號:356234)混合，加入表皮生長因子(EGF) (Gibco公司；貨號:PHG0314)、成纖維細胞生長因子(bFGF) (Gibco公司；貨號:PHG0264)、青霉素和鏈霉素，得到無菌孵育液，其中，表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細胞生長因子的終濃度為10ng/ml，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到無菌孵育液。
[0022](3)分別將10個患者手術(shù)切除的新鮮肝癌組織(離體5分鐘內(nèi))置入含有步驟(I)中配制的培養(yǎng)液的試管中，放入冰中迅速轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，備用；
[0023](4)在無菌條件下將腫瘤組織用步驟(1)中配制的培養(yǎng)液沖洗2遍；清除壞死組織，選擇血管豐富的肝癌組織分割成2X2X2mm3的小塊，用步驟(2)制備的無菌孵育液在4°C浸潤30分鐘，備用；
[0024](5)選用A組共30只雄性，3周齡，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每個患者的肝癌組織取三個小塊，分別接種在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具體接種方法為:在小鼠腹部備皮，再以碘伏消毒。用20號套管針將總量2 X 2 X 2mm3的肝癌組織于腹部腋中線處刺入，針頭走行于皮膚與腹膜間，最終將組織送入前肢肩背部皮下，壓迫傷口至無出血；
[0025](6) SPF級環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)60天，完成建立肝癌患者來源異種移植瘤模型，并對模型編號為1-10號(每個編號所對應(yīng)3只小鼠中大于等于I只成瘤，即認定該編號模型建模成功)。
[0026]A組小鼠接種移植后觀察小鼠一般活動及營養(yǎng)狀態(tài)等。每三天用游標卡尺測量移植瘤長(L)短(W)徑平均值，按體積公式V = 1/2 (Lff2)計算移植瘤平均體積。移植約4周后肉眼可見局部形成腫瘤結(jié)節(jié)，第10周腫瘤呈半球形，平均瘤體體積約1.59cm3。解剖小鼠，大體移植瘤組織呈魚肉樣，血供豐富，中央可見壞死，H&E染色后確認病理分型為肝細胞癌，與對應(yīng)患者病理分型相一致。經(jīng)過上述步驟，2號模型所對應(yīng)3只小鼠中有2只成瘤，4號模型有2只成瘤，8號及9號模型分別有I只成瘤。最終建立4個模型，小鼠的成瘤率為40%。
[0027]實施例2
[0028]一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接種有處理過的肝癌組織塊的小鼠構(gòu)成，其建立方法為:
[0029](I)配制培養(yǎng)液:將90體積份的DMEM與10體積份的胎牛血清混合，加入青霉素和鏈霉素，得到DMEM培養(yǎng)液，其中，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到培養(yǎng)液。
[0030](2)配制無菌孵育液:將45體積份的DMEM，5體積份的胎牛血清和50體積份的Matrigel膠(BD公司；貨號:356234)混合，加入表皮生長因子(EGF) (Gibco公司；貨號:PHG0314)、成纖維細胞生長因子(bFGF) (Gibco公司；貨號:PHG0264)、青霉素和鏈霉素，得到無菌孵育液，其中，表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細胞生長因子的終濃度為10ng/ml，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到無菌孵育液。
[0031](3)分別將10個患者手術(shù)切除的新鮮肝癌組織(離體5分鐘內(nèi))置入含有步驟(I)中配制的培養(yǎng)液的試管中，放入冰中迅速轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，備用；
[0032](4)在無菌條件下將腫瘤組織用步驟(1)中配制的培養(yǎng)液沖洗3遍；清除壞死組織，選擇血管豐富的肝癌組織分割成2X2X2mm3的小塊，用步驟(2)制備的無菌孵育液在4°C浸潤40分鐘,備用；
[0033](5)選用B組共30只雄性，3周齡，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每個患者的肝癌組織取三個小塊，分別接種在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具體接種方法為:在小鼠腹部備皮，再以碘伏消毒。用20號套管針將總量2 X 2 X 2mm3的肝癌組織于腹部腋中線處刺入，針頭走行于皮膚與腹膜間，最終將組織送入前肢肩背部皮下，壓迫傷口至無出血；
[0034](6) SPF級環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)60天，完成建立肝癌患者來源異種移植瘤模型，并對模型編號為1-10號(每個編號所對應(yīng)3只小鼠中大于等于I只成瘤，即認定該編號模型建模成功)。
[0035]B組小鼠接種移植后觀察小鼠一般活動及營養(yǎng)狀態(tài)等。每三天用游標卡尺測量移植瘤長(L)短(W)徑平均值，按體積公式V = 1/2 (Lff2)計算移植瘤平均體積。移植約4周后肉眼可見局部形成腫瘤結(jié)節(jié)，第11周腫瘤呈半球形，平均瘤體體積約1.67cm3。解剖小鼠，大體移植瘤組織呈魚肉樣，血供豐富，中央可見壞死，H&E染色后確認病理分型為肝細胞癌，與對應(yīng)患者病理分型相一致。經(jīng)過上述步驟，I號模型所對應(yīng)3只小鼠中有2只成瘤，2號模型有2只成瘤,6號模型有2只成瘤,9號模型有I只成瘤。最終建立4個模型,小鼠的成瘤率為40%。 [0036]實施例3
[0037]—種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接種有處理過的肝癌組織塊的小鼠構(gòu)成，其建立方法為:
[0038](I)配制培養(yǎng)液:將90體積份的DMEM與10體積份的胎牛血清混合，加入青霉素和鏈霉素，得到DMEM培養(yǎng)液，其中，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到培養(yǎng)液。
[0039](2)配制無菌孵育液:將45體積份的DMEM，5體積份的胎牛血清和50體積份的Matrigel膠(BD公司；貨號:356234)混合，加入表皮生長因子(EGF) (Gibco公司；貨號:PHG0314)、成纖維細胞生長因子(bFGF) (Gibco公司；貨號:PHG0264)、青霉素和鏈霉素，得到無菌孵育液，其中，表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細胞生長因子的終濃度為10ng/ml，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到無菌孵育液。
[0040](3)分別將10個患者手術(shù)切除的新鮮肝癌組織(離體5分鐘內(nèi))置入含有步驟(I)中配制的培養(yǎng)液的試管中，放入冰中迅速轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，備用；
[0041](4)在無菌條件下將腫瘤組織用步驟(1)中配制的培養(yǎng)液沖洗3遍；清除壞死組織，選擇血管豐富的肝癌組織分割成2X3X3mm3的小塊，用步驟(2)制備的無菌孵育液在4°C浸潤60分鐘，備用；
[0042](5)選用C組共30只雄性，3周齡，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每個患者的肝癌組織取三個小塊，分別接種在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具體接種方法為:在小鼠腹部備皮，再以碘伏消毒。用20號套管針將總量2 X 3 X 3mm3的肝癌組織于腹部腋中線處刺入，針頭走行于皮膚與腹膜間，最終將組織送入前肢肩背部皮下，壓迫傷口至無出血；
[0043](6) SPF級環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)60天，完成建立肝癌患者來源異種移植瘤模型，并對模型編號為1-10號(每個編號所對應(yīng)3只小鼠中大于等于I只成瘤，即認定該編號模型建模成功)。
[0044]C組小鼠接種移植后觀察小鼠一般活動及營養(yǎng)狀態(tài)等。每三天用游標卡尺測量移植瘤長(L)短(W)徑平均值，按體積公式V= 1/2 (LW2)計算移植瘤平均體積。移植約5周后肉眼可見局部形成腫瘤結(jié)節(jié)，第10周腫瘤呈半球形，平均瘤體體積約1.36cm3。解剖小鼠，大體移植瘤組織呈魚肉樣，血供豐富，中央可見壞死，H&E染色后確認病理分型為肝細胞癌，與對應(yīng)患者病理分型相一致。經(jīng)過上述步驟，2號模型所對應(yīng)3只小鼠中有2只成瘤，5號模型有3只成瘤,7號模型有I只成瘤，10號模型有2只成瘤。最終建立4個模型,小鼠的成瘤率為40%。
[0045]實施例4
[0046]—種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接種有處理過的肝癌組織塊的小鼠構(gòu)成，其建立方法為:
[0047](I)配制培養(yǎng)液:將90體積份的DMEM與10體積份的胎牛血清混合，加入青霉素和鏈霉素，得到DMEM培養(yǎng)液，其中，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到培養(yǎng)液。
[0048](2)配制無菌孵育液:將45體積份的DMEM，5體積份的胎牛血清和50體積份的Matrigel膠(BD公司；貨號:356234)混合，加入表皮生長因子(EGF) (Gibco公司；貨號:PHG0314)、成纖維細胞生長因子(bFGF) (Gibco公司；貨號:PHG0264)、青霉素和鏈霉素，得到無菌孵育液，其中，表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細胞生長因子的終濃度為10ng/ml，青霉素的終濃度為100U/ml，鏈霉素的終濃度為100U/ml，得到無菌孵育液。
[0049](3)分別將10個患者手術(shù)切除的新鮮肝癌組織(離體5分鐘內(nèi))置入含有步驟
(I)中配制的培養(yǎng)液的試管中，放入冰中迅速轉(zhuǎn)移到超凈臺內(nèi)，備用；
[0050](4)在無菌條件下將腫瘤組織用步驟(1)中配制的培養(yǎng)液沖洗3遍；清除壞死組織，選擇血管豐富的肝癌組織分割成2X4X4mm3的小塊，用步驟(2)制備的無菌孵育液在4°C浸潤90分鐘，備用；
[0051](5)選用D組共30只雄性，3周齡，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每個患者的肝癌組織取三個小塊，分別接種在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具體接種方法為:在小鼠腹部備皮，再以碘伏消毒。用20號套管針將總量2 X 4 X 4mm3的肝癌組織于腹部腋中線處刺入，針頭走行于皮膚與腹膜間，最終將組織送入前肢肩背部皮下，壓迫傷口至無出血；
[0052](6) SPF級環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)60天，完成建立肝癌患者來源異種移植瘤模型，并對模型編號為1-10號(每個編號所對應(yīng)3只小鼠中大于等于I只成瘤，即認定該編號模型建模成功)。
[0053]D組小鼠接種移植后觀察小鼠一般活動及營養(yǎng)狀態(tài)等。每三天用游標卡尺測量移植瘤長(L)短(W)徑平均值，按體積公式V = 1/2 (Lff2)計算移植瘤平均體積。移植約4周后肉眼可見局部形成腫瘤結(jié)節(jié)，第10周腫瘤呈半球形，平均瘤體體積約1.71cm3。解剖小鼠，大體移植瘤組織呈魚肉樣，血供豐富，中央壞死明顯，H&E染色后確認病理分型為肝細胞癌，與對應(yīng)患者病理分型相一致。經(jīng)過上述步驟，I號模型所對應(yīng)3只小鼠中有3只成瘤，3號、4號及5號模型有2只成瘤，10號模型有3只成瘤。最終建立5個模型,小鼠的成瘤率為 50%。
【權(quán)利要求】
1.一種肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型，其特征在于，包括前肢肩背部皮下接種有處理過的肝癌組織塊的小鼠。
2.如權(quán)利要求1所述的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型，其特征在于，所述的小鼠為非肥胖型糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠。
3.權(quán)利要求1所述的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，具體步驟包括:取新鮮肝癌組織，對其進行處理，將處理后的肝癌組織塊接種于無瘤小鼠前肢肩背部皮下，常規(guī)飼養(yǎng)，得到肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型。
4.如權(quán)利要求3所述的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的新鮮肝癌組織的處理方法包括:將新鮮肝癌組織放入含培養(yǎng)液的試管中移至超凈臺，備用；取出新鮮肝癌組織，用培養(yǎng)液沖洗2-3次，分割成體積為8-32mm3的肝癌組織塊，用無菌孵育液在1-10°C浸沒肝癌組織塊30-90分鐘，得到處理后的肝癌組織塊。
5.如權(quán)利要求4所述的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液，其制備方法為:將90體積份的DMEM與10體積份的胎牛血清混合，加入青霉素和鏈霉素，得到DMEM培養(yǎng)液，其中，青霉素的終濃度為50-200U/ml，鏈霉素的終濃度為50-200U/ml。
6.如權(quán)利要求4所述的肝癌患者來源異種移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的無菌孵育液的制備方法為:將45體積份的DMEM，5體積份的胎牛血清和50體積份的Matrigel膠混合，加入表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、青霉素和鏈霉素，得到無菌孵育液，其中，表皮生長因子的終濃度為5-20ng/ml，成纖維細胞生長因子的終濃度為5-20ng/ml，青 霉素的終濃度為50_200U/ml，鏈霉素的終濃度為50_200U/ml。
【文檔編號】A01K67/02GK103828763SQ201410100264
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】樊嘉, 楊欣榮, 胡博, 徐泱, 周儉 申請人:復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院