Cxcl4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種CXCL4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法；所述用途為在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途；所述腫瘤為CXCL4高表達的腫瘤或化療引起的CXCL4高表達的腫瘤；所述抗CXCL4單克隆抗體與化療時采用的化療藥物聯(lián)合用藥，用于抑制化療引起的CXCL4高表達的腫瘤增殖。本發(fā)明通過應用結腸癌荷瘤小鼠5-Fu化療模型，揭示CXCL4表達變化與結腸癌5-Fu化療后“加速再增殖”之間的關系，闡明CXCL4參與化療后腫瘤“加速再增殖”過程中的分子機制，完成拮抗CXCL4協(xié)同5-Fu抑制結腸癌細胞再增殖的藥效藥理研究，為成功開發(fā)CXCL4抗體藥物提供依據(jù)。
【專利說明】CXCL4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種CXCL4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法。

【背景技術】
[0002]腫瘤放化療誘發(fā)的腫瘤“加速再增殖”現(xiàn)象:放化療仍然是腫瘤的最常用治療手段，其主要抗腫瘤機理是產(chǎn)生細胞毒作用，導致大量腫瘤細胞死亡。通常認為這一過程中瀕死的或已經(jīng)死亡的細胞會被周圍存活的細胞或巨噬細胞等清除細胞消化吸收，而如果有少量的腫瘤細胞存活下來，估計會慢慢的增殖、逐漸的導致腫瘤復發(fā)。40年前就開始有文獻報道腫瘤在放療后開啟了被稱為“加速再增殖(accelerated repopulat1n) ”的過程，這一過程中，在放療打擊下逃逸的少量腫瘤細胞存活下來，并能以更加快的增殖速度重建嚴重受損的腫瘤組織(Hermens, A.F.&Barendsen, G.W.Changes of cell proliferat1ncharacteristics in a rat rhabdomyosarcoma before and after x-1rradiat1n.Eur.J.Cancer,5: 173 - 189，1969.)，(Stephens, T.C.，Currie, G.A.&Peacock，J.H.Repopulat1n of gamma-1rradiated Lewis lung carcinoma by malignant cells andhost macrophage progenitors.Br.J.Cancer, 38:573 - 582，1978.)。最近，發(fā)明人課題組在荷瘤小鼠模型上也觀察到了化療后，殘余腫瘤細胞“加速再增殖”的現(xiàn)象。這種本領域技術人員在分子水平知之甚少的“加速再增殖”現(xiàn)象在目前化療和放療過程中發(fā)揮著主要作用。
[0003]治療后腫瘤“加速再增殖”分子機理是亟需解決的腫瘤學重大科學問題:研究人員為了闡明腫瘤放化療后加速再增殖的分子機理已經(jīng)做了大量的研究。最近，我國科學家首次報道在放療條件下死亡腫瘤細胞在凋亡過程中產(chǎn)生生長刺激信號從而刺激殘余腫瘤細胞加速再增殖(Huang Q, Li F，Liu X, et al.Caspase 3-mediated stimulat1 n of tumorcell repopulat1n during during cancer rad1therapy.Nat Med, 17:860-6，2011.)。他們進一步研究顯示caspase 3這一凋亡過程關鍵蛋白參與了腫瘤細胞的生長刺激。caspase 3調節(jié)的下游信號蛋白前列腺素E2 (PGE2)能夠刺激存活腫瘤細胞的增殖。在腫瘤細胞或腫瘤間質細胞中拮抗caspase 3可以提高異種移植腫瘤或小鼠腫瘤對放療的敏感性。臨床上癌癥患者腫瘤組織中高水平活化狀態(tài)的caspase 3與病人腫瘤高復發(fā)率和高死亡率存在顯著相關性。他們的研究揭示了 caspase 3在放療后腫瘤加速再增殖通路中扮演了關鍵角色(Huang Q, Li F，Liu X, et al.Caspase 3_med iated stimulat1n of tumorcell repopulat1n during during cancer rad1ther apy.Nat Med, 17:860-6，2011.)。揭示了放療對腫瘤生長具有細胞毒和加速再生長的雙重作用和作用機理。特別是“加速再增殖”作用，并不是放療的直接作用，而是通過上調了 caspase 3實現(xiàn)的。因此，靶向“加速再增殖”通路的關鍵分子caspase 3提供了抑制放療后“加速再增殖”的作用，從而也提高了腫瘤對放療的敏感性。靶向caSpaSe3有可能成為新的抗腫瘤藥物靶點，而具有社會和經(jīng)濟價值。
[0004]化療藥物除了直接的細胞毒作用夕卜，還可作用于機體的免疫系統(tǒng)影響其發(fā)揮抗腫瘤活性。最新研究報道(Bruchard Mj Mignot Gj GhiringhelliF，et al.Chemotherapy-triggered cathepsin Brelease in myeloid-derivedsuppressorcells activate s the Nlrp3inflammasome and promotes tumor growth.Nat Med, 19:57-64, 2013.)，臨床常用的兩個化療藥物吉西他濱和5-FU，能夠激活NOD樣受體家族，即髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)中的pyrin結構域蛋白3 (NI rp3)依賴的caspase-1激活復合物(也稱為炎癥體-1nflammasome),導致MDSC高表達白細胞介素-1 (IL-1)。IL-1會進一步誘導⑶4+T細胞釋放白細胞介素-17(IL-17)，IL-17通過促進腫瘤組織血管生成導致化療后腫瘤“加速再增殖”。相應地，當腫瘤建立在Nlrp3-/-、Caspasel-/_小鼠或用白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-lRa，拮抗IL-1)處理的野生型小鼠上時，化療后腫瘤“加速再增殖”作用受到抑制，使得化療能夠發(fā)揮更強的抗腫瘤作用(Bruchard M, Mignot G, Ghiringhelli F，et al.Chemotherapy-triggered cathepsin Brelease in myeloid-derived suppressor cells activates t heNlrp3 inf lammasome and promotes tumor growth.Nat Med，19:57-64，2013.)。石開究結果揭示了化療對抗腫瘤細胞毒和“加速再增殖”的雙重作用，對后者的分子機理研究證實其并不是化療藥物直接對腫瘤的作用，而是通過作用于腫瘤組織中的MDSC間接提高腫瘤血管再生、增加腫瘤組織血液供應實現(xiàn)的。因此，化療后腫瘤“加速再增殖”通路中的關鍵分子為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新靶點和新思路，如文章中提到的IL-1Ra的應用即可抑制化療后腫瘤“加速再增殖”從而提供化療抗腫瘤效果。
[0005]這些研究揭示了放化療后腫瘤“加速再增殖”的一些重要機制。然而，最近研究還表明一些化療藥物反而能夠通過清除免疫抑制細胞增強抗腫瘤免疫應答(Mattarollo，S.R.et al.Pivotal role of innate and adaptive immunity in anthracyclinechemotherapy of established tumors.Cancer Res，71:4809 - 4820，2011.)?；熕幬?5-Fu 能夠選擇性地清除 MDSC (Vincent, J.et al.5-Fluorouracil selectively kiIls tumor-associated myeloid-derived suppressor cells resulting in enhancedT cell - dependent antitumor immunity.Cancer Res，70:3052 - 3061，2010.)，而MDSCs是一類不成熟的骨髓細胞，能夠抑制人類和小鼠T細胞的活化(Gabrilovich，D.1.&Nagaraj，S.Myeloid-derived suppressor cells as regulators of theimmun esystem.Nat.Rev.1mmunol, 9:162 - 174，2009.)。5-FU 介導的 MDSC 清除還不足以避免化療后腫瘤“加速再增殖”。因而，揭示導致腫瘤細胞“加速再增殖”的另外分子通路非常必要。
[0006]CXCL4(PF-4)是最早發(fā)現(xiàn)存在于血小板α -顆粒中的肝素結合蛋白，同時其它多種細胞均能夠表達 CXCL4(Kasper B, Petersen F.Molecular pathways of plateletfactor 4/CXCL4 signaling.Eur J Cell B1l，90:521-26，2011.)。CXCL4 的受體是CXC趨化因子受體3 (CXCR3)，CXCR3是七次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體超家族成員。人CXCR3受體可分為兩種亞型CXCR3-A和CXCR3-B。目前已經(jīng)在T細胞和內皮細胞上發(fā)現(xiàn)了 CXCR3-B的表達，而CXCL4的特異性受體是CXCR3-B。趨化因子CXCL4受體CXCR3在淋巴細胞、內皮細胞和上皮細胞中廣泛表達，能夠通過激活多條信號通路對細胞的增殖、迀移和凋亡進行調節(jié)。多項研究證實，CXCL4及其受體對結直腸癌細胞的浸潤和轉移有著顯著的影響，且CXCL4已作為結直腸癌復發(fā)的生物標記物(Pilatova K，Greplova K，Zdrazilova-Dubska Lj etal.Role of platelet chemokines，PF_4and CTAP-111, in cancer b1logy.J HematolOncol, 6:42，2013.)。


【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種CXCL4單抗治療腫瘤及化療后腫瘤加速再增殖基因篩選法；具體涉及抗CXCL4單克隆抗體的用途及腫瘤化療后加速再增殖基因簇的篩選方法；所述抗CXCL4單克隆抗體用于抑制高表達CXCL4的腫瘤加速再增殖。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
[0009]第一方面，本發(fā)明涉及一種抗CXCL4單克隆抗體在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。
[0010]優(yōu)選的，所述用途具體為在制備抑制化療引起的CXCL4高表達的腫瘤增殖藥物中的用途。
[0011]優(yōu)選的，所述抗CXCL4單克隆抗體與化療時采用的化療藥物聯(lián)合用藥。
[0012]優(yōu)選的，所述抗CXCL4單克隆抗體在化療后CXCL4表達水平達到最高前施用。
[0013]優(yōu)選的，所述化療時采用的化療藥物為細胞周期依賴性化療藥。
[0014]優(yōu)選的，所述化療藥物為5-FU。
[0015]優(yōu)選的，所述抗CXCL4單克隆抗體與5-FU聯(lián)合用藥。
[0016]優(yōu)選的，所述5-FU用藥后4天以內，進行抗CXCL4單克隆抗體給藥。
[0017]優(yōu)選的，所述腫瘤為CXCL4高表達的腫瘤或化療引起的CXCL4高表達的腫瘤。
[0018]優(yōu)選的，所述腫瘤為5-FU敏感型腫瘤。
[0019]優(yōu)選的，所述腫瘤為消化道腫瘤。
[0020]優(yōu)選的，所述腫瘤為胃癌。
[0021 ] 優(yōu)選的，所述腫瘤為結腸癌腫瘤。
[0022]第二方面，本發(fā)明還涉及一種腫瘤化療后加速再增殖基因簇的篩選方法，包括如下步驟:
[0023]A、建立荷瘤動物模型或體外腫瘤細胞培養(yǎng)系統(tǒng)；
[0024]B、給予不同的化療藥物或化療藥物的組合；
[0025]C、化療后，在不同時間點取腫瘤樣本；
[0026]D、用基因表達芯片篩查獲得腫瘤組織基因表達譜；
[0027]E、生物信息學分析獲得有表達規(guī)律的基因作為腫瘤化療后加速再增殖候選基因；
[0028]F、對所述候選基因開展系統(tǒng)的藥效藥理研究，確認影響腫瘤化療后加速再增殖的關鍵基因。
[0029]第三方面，本發(fā)明還涉及一種CXCL4在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。
[0030]優(yōu)選地，所述用途具體為:CXCL4作為腫瘤增殖的靶點在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。
[0031]優(yōu)選地，所述用途包括如下步驟:獲取能夠與CXCL4或CXCL4下游信號中和的結合物，使用所述結合物中和CXCL4靶點或下游信號，實現(xiàn)抑制腫瘤增殖。
[0032]優(yōu)選地，所述結合物為以CXCL4為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。
[0033]優(yōu)選地，所述結合物為以CXCL4受體為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。
[0034]優(yōu)選地，所述CXCL4 受體為 CXCR3，或 CXCR3A，或 CXCR3B。
[0035]優(yōu)選地，所述結合物為CXCL4受體，或CXCL4受體的可溶性受體，或CXCL4受體的受體融合蛋白；
[0036]所述CXCL4 受體為 CXCR3，CXCR3A,或 CXCR3B。
[0037]優(yōu)選地，所述結合物為CXCL4突變體，所述CXCL4突變體能夠競爭結合CXCL4受體，同時不引起受體激活。
[0038]優(yōu)選地，所述結合物為靶向CXCL4，或靶向CXCL4受體，或靶向下游信號成員的mRNA ο
[0039]優(yōu)選地，所述結合物為以CXCL4，或以CXCL4的受體，或以CXCL4下游通路成員為靶標篩選獲得的拮抗劑。
[0040]腫瘤在化療后會開啟被稱為“加速再增殖”的過程，即在化療打擊下逃逸的腫瘤細胞存活下來，并能以更加快的速度增殖?；蛐蜎Q定表型，在腫瘤細胞或組織化療后加速再增殖的過程中，必然存在化療誘導激活的起內在調控驅動作用的加速再增殖基因簇。加速再增殖基因簇可能起正向調控或負向調控作用，所以腫瘤細胞或組織在不同的化療藥物或化療藥物的組合的作用下，在不同的時間點加速再增殖基因簇會發(fā)生與腫瘤細胞或組織生長速度一致或完全相反的規(guī)律性波動，這種基因表達水平的規(guī)律性改變能夠在全基因組表達芯片上顯示出來。根據(jù)基因表達芯片篩查化療后基因在腫瘤組織表達差異，經(jīng)大規(guī)模生物信息學數(shù)據(jù)分析和判斷，對候選基因進行表達確證，從而獲得參與化療后“加速再增殖”候選基因。
[0041]本發(fā)明中涉及的腫瘤化療后加速再增殖基因簇篩選方法能大規(guī)模的篩選出不同腫瘤在不同化療藥物或化療藥物的組合作用下與腫瘤化療后加速再增殖有關的基因簇，從而為臨床針對不同腫瘤不同化療手段提供聯(lián)合化療治療新方案。
[0042]本發(fā)明中涉及的抗CXCL4單克隆抗體的用途即是本發(fā)明中涉及的腫瘤化療后加速再增殖基因簇篩選方法的應用實例，本發(fā)明用小鼠結腸癌模型，對可能參與化療后腫瘤“加速再增殖”基因簇進行了系統(tǒng)篩查。取皮下小鼠CT26結腸癌5-Fu化療后不同時間點的腫瘤組織，制備全基因組表達譜芯片，根據(jù)基因表達芯片篩查化療后基因在腫瘤組織表達差異，經(jīng)大規(guī)模數(shù)據(jù)分析和判斷，對候選基因進行表達確證，從而獲得參與化療后“加速再增殖”候選基因。最終將研究重點聚焦到趨化因子家族，篩選出了趨化因子CXCL4。CXCL4在5-Fu化療后表現(xiàn)出顯著的先上升后下降的表達特點，提示其可能參與結腸癌化療后“加速再增殖”的過程。本發(fā)明闡明了 CXCL4在腫瘤化療后“加速再增殖”的分子機理，并通過干預此機理提供聯(lián)合化療治療結腸癌新方案。
[0043]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果為:本發(fā)明通過應用結腸癌荷瘤小鼠5-Fu化療模型，揭示CXCL4表達變化與結腸癌5-Fu化療后“加速再增殖”之間的關系，闡明CXCL4參與化療后腫瘤“加速再增殖”過程中的分子機制，完成拮抗CXCL4 (使用自主研發(fā)的CXCL4單克隆抗體)協(xié)同5-Fu抑制結腸癌細胞再增殖的藥效藥理研究，為成功開發(fā)CXCL4抗體藥物提供依據(jù)。
[0044]同時，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的CXCL4參與化療后腫瘤“加速再增殖”過程中的分子機制具有開創(chuàng)意義，CXCL4能夠起到腫瘤增殖靶點的作用，進而能夠通過作用該靶點進行腫瘤的相關治療工作；與靶點作用的機制有很多種，這些機制均能應用于本發(fā)明，實現(xiàn)抑制腫瘤增殖的效果；這些機制包括但不限于以下:
[0045]獲能夠與CXCL4或CXCL4下游信號中和的結合物，使用所述結合物中和CXCL4靶點或下游信號，實現(xiàn)抑制腫瘤增殖；
[0046]進一步地，結合本領域常識可知，能夠作用靶點而實現(xiàn)抑制腫瘤的機制還包括:
[0047]獲取能夠與CXCL4或CXCL4下游信號中和的結合物，使用所述結合物中和CXCL4靶點或下游信號，實現(xiàn)抑制腫瘤增殖，所述結合物可為:
[0048]所述結合物為以CXCL4為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。
[0049]所述結合物為以CXCL4受體為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。
[0050]所述CXCL4 受體為 CXCR3，或 CXCR3A，或 CXCR3B。
[0051]所述結合物為CXCL4受體，或CXCL4受體的可溶性受體，或CXCL4受體的受體融合蛋白；所述 CXCL4 受體為 CXCR3，CXCR3A,或 CXCR3B。
[0052]所述結合物為CXCL4突變體，所述CXCL4突變體能夠競爭結合CXCL4受體，同時不引起受體激活。
[0053]所述結合物為靶向CXCL4，或靶向CXCL4受體，或靶向下游信號成員的mRNA。
[0054]所述結合物為以CXCL4，或以CXCL4的受體，或以CXCL4下游通路成員為靶標篩選獲得的拮抗劑。
[0055]顯然，能夠與本發(fā)明要求保護的CXCL4靶點作用的機制，相關物質都應在本發(fā)明的保護范圍之內，并不限于以上列舉的內容，這是本領域技術人員顯然可以確定的。
[0056]本發(fā)明的成功實施，為結直腸癌新藥研發(fā)提供新靶點和新抗體藥物，為結直腸癌藥物治療提供新思路；因而，具有重大的社會意義和經(jīng)濟價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0057]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯:
[0058]圖1為對CT26荷瘤小鼠一次性注射5-FU(200mg/kg)，化療后第0、2、4、6、8天皮下腫瘤體積的測量結果圖；
[0059]圖2為5-FU(200mg/kg)化療后第0、2、4、6、8天CT26腫瘤組織切片HE染色結果示意圖；
[0060]圖3為對CT26荷瘤小鼠一次性注射5-FU (200mg/kg)，化療后皮下腫瘤組織的檢測結果示意圖；其中，A為基因芯片結果顯示的腫瘤組織中CXCL4 mRNA水平在5-Fu化療后的趨勢圖，B為RT-PCR檢測CT26腫瘤化療后第4天組織中CXCL4在基因水平的表達變化示意圖(n = 3) (**ρ〈0.0lvs 第 O 天)；
[0061]圖4為對體外培養(yǎng)CT26細胞和MFC細胞5-FU(200mg/kg)或L-OHP (30ug/ml)孵育后，RT-PCR 檢測 CXCL4 mRNA 表達量變化示意圖(η = 3，*ρ〈0.05，**ρ〈0.01);其中，A.5-FU孵育CT26細胞，B.L-OHP孵育CT26細胞，C.5-FU孵育MFC細胞，D.L-OHP孵育MFC細胞；
[0062]圖5為MTT法檢測rhCXCL4對CT26細胞和IEC-6細胞的增殖作用示意圖(**ρ〈0.01，_ρ〈0.001);其中，A 為不同濃度的 rhCXCL4(0-3ug/ml)對 IEC-6 細胞的增殖作用示意圖，B為不同濃度的rhCXCL4(0-3ug/ml)對CT26細胞的增殖作用示意圖；
[0063]圖6為Ant1-CXCL4 mAb特性的鑒定示意圖；其中，A為SDS/PAGE (8 % ) (a)與Western blotting(b)方法分析純化的anti_CXCL4 mAb,B為BIAcore方法分析anti_CXCL4mAb的親和力，C為rhCXCL4對ACHN細胞的生長抑制作用示意圖，D為Anti_CXCL4 mAb拮抗rhCXCL4(72.6ug/ml)對ACHN細胞的抑制作用示意圖；
[0064]圖7為抗CXCL4單抗聯(lián)合5_FU對腫瘤生長的抑制作用示意圖；其中，A為各組小鼠腫瘤體積大小變化示意圖，B為各組小鼠死亡變化情況示意圖，C為化療對照組與化療加單抗給藥組小鼠化療后第4天和第6天腫瘤組織切片BrdU染色示意圖，D為BrdU免疫組化切片腫瘤細胞增殖指數(shù)統(tǒng)計示意圖，(n = 3)，**p < 0.01 ;
[0065]圖8為抗CXCL4單抗聯(lián)合5_FU對T淋巴細胞移植裸鼠接種腫瘤生長的抑制作用示意圖；其中，A為皮下接種CT26腫瘤的BALB/C nu/nu裸小鼠，5_FU (150mg/kg)化療后加單抗給藥組皮下注射抗CXCL4單抗(lmg/kg)，腫瘤體積隨時間的變化示意圖，B為尾靜脈移植健康BALB/C小鼠淋巴細胞的BALB/C nu/nu CT26荷瘤裸小鼠，5_FU (150mg/kg)化療后加單抗給藥組皮下注射抗CXCL4單抗(lmg/kg),腫瘤體積隨時間的變化示意圖。
[0066]圖9為RT-PCR檢測CT26腫瘤組織中IFN_r和GRAN_b mRNA表達量變化示意圖；其中，A為RT-PCR檢測IFN- y mRNA的表達量，B為RT-PCR檢測GRAN_b mRNA的表達量；(η=3) (*ρ〈0.05vs PBS control 組)。

【具體實施方式】
[0067]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0068]實施例中涉及的雜交瘤細胞16D6-3已于2012年11月29日遞交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:C2012186o
[0069]實施例
[0070]1.1結腸癌荷瘤小鼠化療模型的建立
[0071]臨床治療結直腸癌的化療方案是以5-FU為基礎的單藥化療或聯(lián)合化療方案(5-FU+L-0HP或CPT-1I)。為貼近臨床，選擇5-FU單次化療構建結腸癌皮下荷瘤小鼠化療模型。合適的化療劑量對于模型的穩(wěn)定性也有重要意義。若化療藥劑量過低，則化療對腫瘤的殺傷作用不明顯；若化療藥劑量過高，則會導致過高的小鼠死亡率。經(jīng)過劑量摸索，在后續(xù)的動物實驗研究中，5-FU的單藥化療劑量均控制在150-200mg/kg。
[0072]在Balb/c小鼠右側腋下皮下接種小鼠結直腸癌腫瘤細胞CT261 X 16個，待腫瘤體積長至400-500mm3時，一次性尾靜脈注射化療藥物5_FU (200mg/kg)，化療后每兩天用游標卡尺量取腫瘤體積大小，這樣得到了小鼠結腸癌腫瘤經(jīng)5-FU化療后其生長變化情況；圖I即對CT26荷瘤小鼠一次性注射5-FU(200mg/kg)，化療后第0、2、4、6、8天皮下腫瘤體積的測量結果示意圖，由圖1可知,CT26腫瘤在5-FU化療后，腫瘤體積先減小，第4天達到最低點，然后反彈增大，表現(xiàn)為典型的“加速再增殖”現(xiàn)象。這表明單次化療對結腸癌腫瘤的生長抑制作用有限，腫瘤存在化療后復發(fā)增殖的情況，與臨床觀察現(xiàn)象一致。
[0073]對5-FU化療后第0、2、4、6、8天的CT26腫瘤組織進行H&E染色切片，圖2即5-FU(200mg/kg)化療后第0、2、4、6、8天CT26腫瘤組織切片HE染色結果示意圖，由圖2可知，結果顯示腫瘤組織在化療后出現(xiàn)大面積壞死，以第4天最為嚴重，但從第6天后壞死急劇減少乃至消失，與腫瘤生長體積在化療后的變化情況一致。
[0074]1.2 5-FU誘導結腸癌細胞表達CXCL4
[0075]取5-氟尿嘧啶(5-FU)化療后0、2、4、6、8天共5個時間點的新鮮CT26小鼠結腸癌組織，抽取RNA，送樣制作高密度寡核苷酸微陣列，得到結腸癌腫瘤化療后耐藥生長過程中的基因表達動態(tài)圖譜。通過分析高密度寡核苷酸微陣列中mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL4在5-FU化療后CT26腫瘤組織的表達量上調，而在單次化療后期腫瘤恢復生長時期表達量下降。由圖3A可知，與化療前相比，5-FU化療后CXCL4的表達在第2天達到了最高值，隨后開始下降。為了進一步驗證芯片結果，采用real-time PCR(RT-PCT)的方法檢測了 CT26腫瘤組織中CXCL4在5-FU化療后第4天的表達變化，如圖3B (η = 3，**ρ〈0.01)所示，結果驗證了與未化療的第O天對照組相比，CXCL4基因表達顯著上調。
[0076]1.3 5-FU特異性介導結腸癌細胞CXCL4激活表達
[0077]5-FU誘導腫瘤組織CXCL4的表達激活，而腫瘤組織的異質性使得研究CXCL4是由腫瘤組織中的哪類細胞表達顯得極為必要。在體外培養(yǎng)小鼠結腸癌細胞CT26，以200ug/ml5-FU孵育3小時后換液，收集換液后4小時、24小時和48小時的細胞，抽提RNA，利用RT-PCR技術研究CXCL4 mRNA的表達量變化。由圖4A(n = 3，*ρ〈0.05，**ρ〈0.01)可知，從5-FU化療后4小時起，與未經(jīng)化療的對照相比，CT26細胞顯著激活上調CXCL4mRNA。
[0078]接下來進一步研究了腫瘤細胞CXCL4表達激活是否為化療藥特異性或為腫瘤細胞特異性。體外培養(yǎng)小鼠結腸癌細胞CT26和小鼠胃癌細胞MFC，以200ug/ml5-FU或30ug/ml奧沙利鉬(L-OHP)孵育3小時后換液，收集換液后4小時、24小時和48小時的細胞，抽提RNA，利用RT-PCR技術研究CXCL4 mRNA的表達量變化。由圖4C(n = 3，p〈0.05)可知，結果表明，相比于CT26細胞，MFC細胞在5-FU后48小時，CXCL4 mRNA才有顯著激活上調。而L-OHP不能激活CT26 (圖4B)或MFC細胞(圖4D)上調CXCL4表達。以上結果說明結腸癌細胞CXCL4激活表達是由5-FU特異性介導的。
[0079]1.4 rhCXCL4體外對CT26結腸癌細胞增殖不起作用
[0080]前面研究表明5-FU化療能特異性誘導結腸癌細胞激活表達CXCL4，接下來研究CXCL4是否對結腸癌細胞有直接作用。在體外用不同濃度的rhCXCL4(0-3ug/ml)對小鼠結腸癌細胞CT26和大鼠未分化小腸隱窩上皮細胞IEC-6 (陽性對照)進行細胞培養(yǎng)，48h后用MTT顯色法檢測活細胞相對數(shù)量，計算CT26細胞和IEC-6細胞在不同濃度rhCXCL4培養(yǎng)條件下的存活率。圖5A為不同濃度的rhCXCL4(0-3ug/ml)對IEC-6細胞的增殖作用示意圖，圖5B為不同濃度的rhCXCL4(0-3ug/ml)對CT26細胞的增殖作用示意圖；圖5A、5B的結果顯示，在體外rhCXCL4在0.33ug/ml的濃度下就對IEC-6細胞的生長有顯著的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性，而rhCXCL4體外對CT26細胞的增殖無影響。
[0081]1.5抗CXCL4單抗的制備及其理化性質的鑒定
[0082]多克隆抗體由于其血清來源成分較為復雜，本實施例制備和純化了具有中和人源及鼠源CXCL4的單克隆抗體。經(jīng)純度檢測、內毒素檢測和生物學活性檢測(圖6)，證明了單抗的質量都已達到動物實驗標準。
[0083]以純化的人CXCL4重組蛋白免疫SD大鼠，經(jīng)細胞融合以及3次克隆篩選得到了一株分泌抗重組人和小鼠CXCL4單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為16D6-3。16D6-3細胞株體外連續(xù)培養(yǎng)I個月，經(jīng)ELISA方法滴度檢測證明，抗體分泌能力穩(wěn)定。用該細胞株腹腔注射裸鼠收集腹水后，以親和柱HiTrap protein G HP(GE Healthcare)純化腹水中的單克隆抗體 anti_CXCL4 mAb,經(jīng) SDS-PAGE 檢測抗體純度達到 98% (圖 6A_a),并用 Western blot方法檢測單克隆抗體與重組人CXCL4蛋白的結合活性(圖6A-b)。用BIAcore檢測純化得到的ant1-CXCL4 mAb與重組人CXCL4的親和力，經(jīng)Biaevaluat1n分析軟件處理數(shù)據(jù),采用一對一 Langmuir結合模型計算結合率(k on)和解離率(k off),平衡解離常數(shù)(k d)為k on與k off的比值；計算得到的結合率(k on)和解離率(k off)分別為1.79X10^(1/s)和97.8(1/Ms)，平衡解離常數(shù)(kd)為1.83 X KT8M (圖6B)。進一步檢測了抗CXCL4單抗的生物學活性，根據(jù)文獻報道將ACHN細胞用10ug/ml-100ug/ml的rhCXCL4蛋白孵育，72小時后MTT檢測發(fā)現(xiàn)rhCXCL4 (IC50 = 72.6ug/ml)有效抑制了 ACHN細胞的增殖，與文獻報道一致(圖6C)，而抗CXCL4單抗有效阻斷了 CXCL4 (72.6ug/ml)對ACHN細胞的生長抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(圖6D)。
[0084]1.6抗CXCL4單抗協(xié)同5_FU化療抑制結腸癌腫瘤細胞生長
[0085]在體外細胞實驗確證CXCL4對結腸癌腫瘤細胞沒有直接作用的基礎上，接下來研究CXCL4在體內對CT26腫瘤細胞的作用。利用實驗室自己制備和純化的抗CXCL4單克隆抗體(申請?zhí)?201310066089.7的中國發(fā)明專利《抗趨化因子4單克隆抗體、雜交瘤細胞系及應用》)從反面驗證了 CXCL4在CT26腫瘤5-FU化療中的作用。
[0086]在Balb/c小鼠右側腋下皮下接種小鼠結直腸癌腫瘤細胞CT261 X 16個，待腫瘤體積長至200-300mm3時，隨機分組，包括陰性對照組，化療對照組，化療加單抗給藥組?；煼桨笧橐淮涡晕察o脈注射化療藥物5-FU(150mg/kg)?？笴XCL4單抗給藥方案為化療當天皮下給藥，給藥劑量lmg/kg。PBS對照組僅皮下注射同體積PBS，化療對照組注射同體積PBS。給藥后每2天用游標卡尺量取皮下腫瘤大小。圖7為抗CXCL4單抗聯(lián)合5-FU對腫瘤生長的抑制作用示意圖，結果顯示，與單獨5-FU化療相比，抗CXCL4單抗能夠協(xié)同5-FU顯著提高化療對腫瘤生長的抑制作用(圖7A) (η = 10，ρ〈0.01)。
[0087]圖7Β(η = 10，ρ〈0.05)為抗CXCL4單抗對荷瘤小鼠化療后死亡率的影響，實驗結果表明抗CXCL4單抗亦能夠協(xié)同5-FU顯著提高荷瘤小鼠化療后的存活時間。
[0088]對化療對照組和化療加單抗給藥組的腫瘤組織進行切片，BrdU免疫組化染色檢測腫瘤組織中細胞的增殖情況，如圖7C、7D ;結果顯示，相較于對5-FU化療對照組，抗CXCL4單抗與5-FU聯(lián)用減少了腫瘤在化療后第2、4、6天的BrdU陽性細胞數(shù)(切片中呈棕色著色)(圖7C)，增殖指數(shù)統(tǒng)計差異顯著(P < 0.01)(圖7D)。增殖指數(shù)統(tǒng)計:顯微鏡400視野下隨機選取3個視野，計數(shù)每個視野下BrdU陽性細胞個數(shù)(η = 3)。
[0089]以上結果表明，與單獨5-FU化療相比，抗CXCL4單抗顯著抑制5_FU后的“加速再增殖”，表現(xiàn)為協(xié)同5-FU抑制腫瘤細胞增殖，同時單抗與5-FU聯(lián)用還能顯著延長荷瘤小鼠化療后的存活時間。這也從反面證明了化療后腫瘤細胞可以通過激活表達CXCL4來獲得化療后的“加速再增殖”優(yōu)勢。
[0090]1.7抗CXCL4單抗通過作用于T淋巴細胞協(xié)同5_FU化療抑制結腸癌細胞再增殖
[0091]抗CXCL4單抗協(xié)同5-FU提高化療對腫瘤生長的抑制作用，這表明化療后腫瘤細胞可以通過激活表達CXCL4獲得了自身的增殖優(yōu)勢。而體外細胞實驗證實CXCL4對腫瘤細胞沒有直接作用，這預示CXCL4可能通過間接作用于腫瘤組織中的間質細胞來幫助結腸癌細胞獲得增殖優(yōu)勢。
[0092]首先以先天性無胸腺T淋巴細胞發(fā)育缺陷的BALB/C nu/nu裸小鼠為對象建立CT26荷瘤小鼠模型，在裸鼠右側腋下皮下接種小鼠結直腸癌腫瘤細胞CT261X 16個，待腫瘤體積長至200-300mm3，一次性注射化療藥物5_FU (150mg/kg)后隨機分組，實驗組化療當天皮下注射抗CXCL4單抗lmg/kg，對照組注射同體積PBS，給藥后每2天用游標卡尺量取皮下腫瘤大小。圖8為抗CXCL4單抗聯(lián)合5-FU對T淋巴細胞移植裸鼠接種腫瘤生長的抑制作用示意圖；結果顯示，與單獨5-FU化療相比，抗CXCL4單抗不能協(xié)同5-FU化療提高對腫瘤生長的抑制作用(圖8A) (η = 6)。
[0093]接下來對BALB/C nu/nu裸鼠每周尾靜脈移植健康BALB/C小鼠脾臟分離的淋巴細胞I X 17個，首次淋巴細胞移植3天后皮下接種CT26細胞I X 16個，待腫瘤體積長至200-300mm3, 一次性注射化療藥物5_FU (150mg/kg)。隨機分組，實驗組化療當天皮下注射抗CXCL4單抗lmg/kg，對照組注射同體積PBS，給藥后每2天用游標卡尺量取皮下腫瘤大小。結果顯示，抗CXCL4單抗能夠協(xié)同5-FU顯著提高化療對腫瘤生長的抑制作用(圖SB) (η =
8,ρ〈0.05)。
[0094]以上實驗結果都表明，抗CXCL4抗體是通過作用于T淋巴免疫系統(tǒng)來協(xié)同5_FU抑制結腸癌細胞再增殖，也即是說5-FU化療誘導腫瘤細胞激活表達CXCL4可以作用于T淋巴細胞使得腫瘤細胞能夠逃避免疫監(jiān)視而獲得增殖優(yōu)勢。
[0095]1.8抗CXCL4單抗增強腫瘤組織中T淋巴細胞的抗腫瘤作用
[0096]腫瘤組織中浸潤淋巴細胞具有抗腫瘤作用，例如細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)可以通過分泌干擾素(IFN-Y)、顆粒酶A(GRAN-a)和顆粒酶B等(GRAN_b)來抑制腫瘤生長。已有文獻表明臨床癌癥病人腫瘤組織中的浸潤淋巴細胞與病人預后及存活時間有顯著相關。前期實驗已經(jīng)證明抗CXCL4單抗是通過作用于T淋巴細胞來協(xié)同5-FU化療抑制結腸癌腫瘤生長，假設抗CXCL4單抗的協(xié)同機制是抗CXCL4單抗能增強腫瘤浸潤淋巴細胞的抗腫瘤作用。
[0097]在Balb/c小鼠右側腋下皮下接種CT26細胞I X 16個，待腫瘤體積長至200-300mm3時，隨機分組，包括陰性對照組，化療對照組，化療加單抗給藥組。PBS對照組僅皮下注射同體積PBS，化療對照組一次性注射化療藥物5-FU(150mg/kg)?；熂訂慰菇o藥組在5-FU化療當天頸部皮下注射抗CXCL4單抗lmg/kg?；熀蟮?天處死小鼠，剝取新鮮腫瘤組織，抽提RNA，利用RT-PCR技術比較各組小鼠腫瘤組織中IFN-Y和GRAN_b mRNA的表達量。圖9為RT-PCR檢測CT26腫瘤組織中IFN_r和GRAN_b mRNA表達量變化示意圖；結果表明，5-FU化療能抑制IFN- Y和GRAN-b的表達，而抗CXCL4單抗能顯著提高化療腫瘤組織中IFN- Y (圖9A)和GRAN-b (圖9B)的表達(η = 3，ρ〈0.05)。以上實驗結果表明，抗CXCL4單抗能顯著增強腫瘤組織中T淋巴細胞的抗腫瘤作用。
[0098]綜上所述，本發(fā)明通過應用結腸癌荷瘤小鼠5-Fu化療模型，揭示CXCL4表達變化與結腸癌5-Fu化療后“加速再增殖”之間的關系，闡明CXCL4參與化療后腫瘤“加速再增殖”過程中的分子機制，完成拮抗CXCL4協(xié)同5-Fu抑制結腸癌細胞再增殖的藥效藥理研究，本發(fā)明的成功實施，為結直腸癌新藥研發(fā)提供新靶點和新抗體藥物，為結直腸癌藥物治療提供新思路；因而，具有重大的社會意義和經(jīng)濟價值。
[0099]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質內容。
【權利要求】
1.一種抗CXCL4單克隆抗體在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途具體為在制備抑制化療引起的CXCL4高表達的腫瘤增殖藥物中的用途。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗CXCL4單克隆抗體與化療時采用的化療藥物聯(lián)合用藥。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗CXCL4單克隆抗體在化療后CXCL4表達水平達到最高前施用。
5.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述化療時采用的化療藥物為細胞周期依賴性化療藥。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述化療藥物為5-FU。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗CXCL4單克隆抗體與5-FU聯(lián)合用藥。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述5-FU用藥后4天以內，進行抗CXCL4單克隆抗體給藥。
9.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為CXCL4高表達的腫瘤或化療引起的CXCL4高表達的腫瘤。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為5-FU敏感型腫瘤。
11.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為消化道腫瘤。
12.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為胃癌。
13.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為結腸癌腫瘤。
14.一種腫瘤化療后加速再增殖基因簇的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟: A、建立荷瘤動物模型或體外腫瘤細胞培養(yǎng)系統(tǒng)； B、給予不同的化療藥物或化療藥物的組合； C、化療后，在不同時間點取腫瘤樣本； D、用基因表達芯片篩查獲得腫瘤組織基因表達譜； E、生物信息學分析獲得有表達規(guī)律的基因作為腫瘤化療后加速再增殖候選基因； F、對所述候選基因開展系統(tǒng)的藥效藥理研究，確認影響腫瘤化療后加速再增殖的關鍵基因。
15.一種CXCL4在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。
16.如權利要求15所述的用途，其特征在于，所述用途具體為:CXCL4作為腫瘤增殖的靶點在制備抑制腫瘤增殖藥物中的用途。
17.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步驟:獲取能夠與CXCL4或CXCL4下游信號中和的結合物，使用所述結合物中和CXCL4靶點或下游信號，實現(xiàn)抑制腫瘤增殖。
18.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述結合物為以CXCL4為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。
19.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述結合物為以CXCL4受體為抗原制備的抗體，或所述抗體的片段，或所述抗體的融合蛋白。
20.如權利要求19所述的用途，其特征在于，所述CXCL4受體為CXCR3，或CXCR3A，或CXCR3B。
21.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述結合物為CXCL4受體，或CXCL4受體的可溶性受體，或CXCL4受體的受體融合蛋白； 所述 CXCL4 受體為 CXCR3，CXCR3A,或 CXCR3B。
22.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述結合物為CXCL4突變體，所述CXCL4突變體能夠競爭結合CXCL4受體，同時不引起受體激活。
23.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述結合物為靶向CXCL4，或靶向CXCL4受體，或靶向下游信號成員的mRNA。
24.如權利要求16所述的用途，其特征在于，所述結合物為以CXCL4，或以CXCL4的受體，或以CXCL4下游通路成員為靶標篩選獲得的拮抗劑。
【文檔編號】A61P35/00GK104127871SQ201410289048
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權日:2014年4月9日
【發(fā)明者】韓偉, 俞雁, 張揚 申請人:上海交通大學