一種提高香港牡蠣天然采苗效率的預(yù)報(bào)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高香港牡蠣天然采苗效率的預(yù)報(bào)方法。本發(fā)明通過幼蟲樣品采集、表型分類、分子識別、綜合評估和適時采苗等環(huán)節(jié)，在天然海區(qū)能夠成功獲取大量香港牡蠣稚貝。不但提高了天然采苗數(shù)量，保證了苗種質(zhì)量，而且解決了以往盲目性采苗存在的數(shù)量不穩(wěn)、種類混雜、多次復(fù)采等問題，這為香港牡蠣資源恢復(fù)及其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了充足的苗種來源。
【專利說明】一種提高香港牡蠣天然采苗效率的預(yù)報(bào)方法【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于海洋農(nóng)業(yè)中貝類苗種繁育領(lǐng)域，具體涉及一種提高香港牡蠣天然采苗效率的預(yù)報(bào)方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]香港牡販Crassostreahongkongensis是我國華南沿海養(yǎng)殖的主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種，喜歡生活在近河口或附近有淡水注入的地方，主要分布在廣東、廣西等地，年產(chǎn)量在130多萬噸，產(chǎn)值在80-100億元(中國漁業(yè)年鑒，2013)。
[0003]香港牡蠣在我國已有近千年的養(yǎng)殖歷史，傳統(tǒng)上蠔民們是以天然采作為苗種的唯一來源。學(xué)者們很早就開始研究牡蠣的天然采苗，包括對近江牡蠣(胡家財(cái)?shù)龋?994;陳振漢&李友，1997 ;莫新，2004,鐘方杰等，2012)、葡萄牙牡蠣(宋傳福，2013)、長牡蠣等采苗技術(shù)研究。但由于采苗預(yù)報(bào)精確度不足，往往會導(dǎo)致采苗失敗，存在穩(wěn)定性差，苗種相對混雜等缺陷。尤其是與香港牡蠣生活在一起近江牡蠣，俗稱紅肉，是一種經(jīng)濟(jì)價值低劣的廢品蠔，在香港牡蠣采苗時，很有可能會有不同比例近江牡蠣苗種混淆，如果混淆比例過高，大大影響了香港牡蠣苗種的經(jīng)濟(jì)價值。為此，采苗預(yù)報(bào)非常重要，傳統(tǒng)的牡蠣采苗主要是靠定期觀測，在牡蠣繁殖季節(jié)到來之前，早早投放附著基，擔(dān)心采不到牡蠣幼蟲。這種做法實(shí)際上存在著一些問題，牡蠣幼蟲是否可以采得到，需要有天時地利人和，更要有科學(xué)的采苗預(yù)報(bào)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004]本發(fā)明的目的是為了打破香港牡蠣苗種長期匱乏局面；提高香港牡蠣天然采苗效率；保證采苗數(shù)量、質(zhì)量；回避多次復(fù)采所帶來的勞動力及其資源浪費(fèi)；來提高采苗效率的一種預(yù)報(bào)方法。`
[0005]本發(fā)明提高香港牡蠣天然采苗效率的預(yù)報(bào)方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]a、幼蟲采集:在天然海區(qū)，當(dāng)香港牡蠣進(jìn)入繁殖季節(jié)時，定期采集牡蠣樣品，觀測是否產(chǎn)卵排精，當(dāng)發(fā)現(xiàn)牡蠣受刺激后消瘦，經(jīng)過10~15天后，受精卵發(fā)育至眼點(diǎn)前期幼蟲，采集海區(qū)表層0.5~Im處的貝類幼蟲作為樣本；
[0007]b、表型分類:對采集的樣品，首先通過顯微鏡觀察分類，將牡蠣幼蟲、其他雙殼貝類幼蟲和藤壺幼蟲進(jìn)行區(qū)分，確定牡蠣幼蟲的占比、牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的占比以及藤壺幼蟲的占比；
[0008]C、分子識別:隨機(jī)提取若干個單個牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的DNA，用4種巨蠣屬牡蠣的復(fù)合COI引物進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增(Wang&Guo，2008)，再經(jīng)過特異性識別，即可得知牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的種類，確定香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲/牡蠣幼蟲的比例，以及其密度；
[0009]所述的4種巨蠣屬牡蠣的復(fù)合COI引物具體為:
[0010]COI 引物 1:AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG (T) G
[0011]COI 引物 2:AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG (C) G[0012]COI 引物 3:GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG
[0013]COI 引物 4:AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC (A) C
[0014]LC01490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
[0015]HC02198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0016]LC01490和HC02198是巨蠣屬牡蠣的通用引物，只要是巨蠣屬牡蠣，用COI基因組D NA作為模板的話，都能擴(kuò)增出一條都有的條帶；
[0017]d、綜合評估:當(dāng)香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲/牡蠣幼蟲的比例> 70%，香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的密度> 50個/m3，敵害生物藤壺幼蟲/牡蠣幼蟲的比例≤10%時，即達(dá)到采苗要求；
[0018]e、適時采苗:當(dāng)香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲發(fā)育至眼點(diǎn)后期階段時，發(fā)送采苗預(yù)報(bào)，投放附著基至海區(qū)，即可采收到大量天然香港牡蠣苗種。
[0019]步驟a所述的刺激為臺風(fēng)或者暴雨等刺激。
[0020]所述的采集海區(qū)表層0.5~Im處的貝類幼蟲作為樣本，采用300目篩絹網(wǎng)進(jìn)行優(yōu)選取樣。
[0021]本發(fā)明的4種巨蠣屬牡蠣的復(fù)合COI引物及其鑒定4種巨蠣屬牡蠣的方法公開于Wang, H.，GuojX.，2008a.1dentificationofCrassostreaariakensisandrelatedoystersbymultiple species-specificPCR.JournalofShellfishResearch27，481 - 487。
[0022]本發(fā)明通過幼蟲樣品采集、表型分類、分子識別、綜合評估和適時采苗等環(huán)節(jié)，在天然海區(qū)能夠成功獲取大量香港牡蠣稚貝。不但提高了天然采苗數(shù)量，保證了苗種質(zhì)量，而且解決了以往盲目性采苗存在的數(shù)量不穩(wěn)、種類混雜、多次復(fù)采等問題，這為香港牡蠣資源恢復(fù)及其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供充足的苗種來源。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0023]圖1實(shí)線部分是本發(fā)明的技術(shù)路線圖，虛線部分為傳統(tǒng)采苗工藝。
[0024]圖2是不同發(fā)育時期牡蠣幼蟲示意圖。A:面盤初期幼蟲；B:面盤中期幼蟲；C:面盤后期幼蟲(眼點(diǎn)前期幼蟲)；D:眼點(diǎn)后期幼蟲。
[0025]圖3是參照Wang&Guo方法利用復(fù)合COI識別牡蠣幼蟲種類，A =PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；B:示意圖。注:M是2000bpDNAmarker ;粗線條表示每種牡販的特異性片段；Ar近江牡蠣幼蟲產(chǎn)生183bp特異片段；An葡萄牙牡蠣幼蟲產(chǎn)生222bp特異片段；Hk香港牡蠣幼蟲產(chǎn)生387bp特異片段；Si熊本牡蠣幼蟲產(chǎn)生546bp特異片段。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以香港牡蠣天然采苗為實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0027]實(shí)施例1
[0028]本實(shí)施例提高香港牡蠣天然采苗效率的預(yù)報(bào)方法，其技術(shù)方案如圖1所示，具體步驟為:
[0029](a)、幼蟲采集:于2013年6-7月，香港牡蠣繁殖季節(jié)時，在湛江官渡定期采集牡蠣樣品，觀測是否產(chǎn)卵排精。于6月20日，臺風(fēng)過后，發(fā)現(xiàn)牡蠣消瘦，海區(qū)中就存在牡蠣幼蟲，經(jīng)過15d，幼蟲即發(fā)育至眼點(diǎn)前期幼蟲，利用300目篩絹網(wǎng)在海區(qū)表層0.5-1.0m處收集貝類幼蟲，經(jīng)過濃縮，放置于采樣瓶中作為樣本。
[0030](b)、表型分類:對于采集到的樣品，首先通過顯微鏡觀察進(jìn)行分類。根據(jù)牡蠣幼蟲在殼頂中后期左右殼不等大，而絕大部分其他雙殼貝類幼蟲左右殼大小相等這一特點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該海區(qū)中，大部分牡蠣幼蟲已經(jīng)進(jìn)入眼點(diǎn)前期幼蟲階段，還有部分處于殼頂初期及中期階段(圖2);樣品里面有少部分雙殼類幼蟲及其藤壺幼蟲。應(yīng)用視野法進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，牡蠣幼蟲所占比例為90%，牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲所占比例為75%左右，藤壺幼蟲的占比約為8%。
[0031](C)、分子識別:對這些大個體的牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲，參考包振民等的專利方法(專利號:ZL03112331.7，發(fā)明名稱:貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法)提取單個牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的DNA，之后按照Wang&Guo方法(Wang, H.，Guo, X.，2008a.1dentificationofCrassostrea ariakensisandrelatedoystersbymultipIexspecies-specif icPCR.JournalofShellf ishResearch27, 481 - 487),應(yīng)用 4 種巨販屬牡販的復(fù)合 COI 引物進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，再經(jīng)過特異性片段大小差異，即可得知牡蠣幼蟲的種類，估算香港牡蠣幼蟲所占比例(圖3)以及密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所用的100個牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲中，有87個是香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲、9個是近江牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲、4個為熊本牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲，也就是說，香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲比例為87%，是優(yōu)勢群體，且存在著一些雜蠔幼蟲(圖3)。
[0032]所述的4種巨蠣屬牡蠣的復(fù)合COI引物具體為:
[0033]COI 引物 1:AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G
[0034]COI 引物 2:AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG (C) G
[0035]COI 引物 3:GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG
[0036]COI 引物 4:A`AGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC (A) C
[0037]LCO1490:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
[0038]HC02198:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
[0039]LC01490和HC02198是巨蠣屬牡蠣的通用引物，如圖3所示，靠近750bp附近，Ar、An、Hk、Si都有一個條帶，就是LC01490和HC02198擴(kuò)增出來的。
[0040](d)、綜合評估:經(jīng)過計(jì)算，香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲/牡蠣幼蟲的比例為72.5%，牡蠣幼蟲的密度是107個/m3，香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲密度為93個/m3，敵害生物藤壺幼蟲/牡蠣幼蟲的比例較低< 10%。總體上來講，基本達(dá)到了采苗要求。
[0041](e)、適時采苗:當(dāng)香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲發(fā)育至眼點(diǎn)后期階段，即眼點(diǎn)又黑、又大、又圓時，發(fā)送預(yù)報(bào)，投放附著基至海區(qū)。大約經(jīng)過20-30d，即可看見附著基上采集到的香港牡蠣稚貝，密度約在1.5-3.0個/cm2，比傳統(tǒng)采苗的0.5-1.5個/cm2提高了 2_3倍。
[0042]實(shí)施例2
[0043](a)、幼蟲采集:于2013年7-8月，香港牡蠣繁殖季節(jié)時，在湛江官渡采完實(shí)施例1苗之后，牡蠣性腺逐步恢復(fù)。于7月17日，熱帶風(fēng)暴過后，發(fā)現(xiàn)牡蠣性腺再次消瘦，按照圖1所示，經(jīng)過13d，幼蟲即發(fā)育至眼點(diǎn)前期幼蟲，利用300目篩絹網(wǎng)在海區(qū)表層0.5-1.5m處收集貝類幼蟲，經(jīng)過濃縮，放置于采樣瓶中作為樣本。
[0044](b)、表型分類:按照實(shí)施例1中方法，發(fā)現(xiàn)該海區(qū)中，大部分牡蠣幼蟲已經(jīng)進(jìn)入眼點(diǎn)前期幼蟲，還有少數(shù)處于殼頂初期及中期(圖2);樣品里面有少量藤壺幼蟲。應(yīng)用視野法進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，牡蠣幼蟲所占比例為95%，牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲比例在82%左右，藤壺幼蟲的占比約為5%。
[0045](C)、分子識別:對這些大個體的牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲，參考包振民等的專利方法(專利號:ZL03112331.7，發(fā)明名稱:貝類遺傳圖譜的快速構(gòu)建方法)提取單個牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的DNA，之后按照Wang&Guo方法(Wang, H.，Guo, X.，2008a.1dentificationofCrassostrea ariakensisandrelatedoystersbymultipIexspecies-specif icPCR.JournalofShellf ishResearch27, 481 - 487)，應(yīng)用 5 種巨蠣屬牡蠣的復(fù)合 COI 引物進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，再經(jīng)過特異性片段大小差異，即可得知牡蠣幼蟲的種類，估算香港牡蠣幼蟲所占比例(圖3)以及密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所用的100個牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲中，有35個是香港牡蠣幼蟲、62個是近江牡蠣幼蟲、3個為熊本牡蠣幼蟲，即近江牡蠣幼蟲是優(yōu)勢群體(圖 3)。
[0046](d)、綜合評估:經(jīng)過計(jì)算，香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲/牡蠣幼蟲的比例為30.2%，牡蠣幼蟲密度是96個/m3，香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲密度為34個/m3，敵害生物藤壺幼蟲/牡蠣幼蟲的比例為5.3%。由于香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的密度較低，且牡蠣幼蟲中近江牡蠣占據(jù)比例較大，而近江牡蠣被蠔民們成為廢品蠔(紅肉)，經(jīng)濟(jì)價值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于香港牡蠣，養(yǎng)殖效益差，未達(dá)到采苗要求，所以不能投放附著基采苗。由于近江牡蠣與香港牡蠣常常生活在一起，通常會帶來近江牡蠣被當(dāng)做香港牡蠣來采苗，結(jié)果當(dāng)蠔民們發(fā)現(xiàn)了附著基上采到是近江牡蠣的時候，已經(jīng)過了采香港牡蠣苗種時節(jié)，給蠔民的采苗工作帶來了很大麻煩。
[0047]為此，等到下一批次牡蠣產(chǎn)卵排精以后，重復(fù)實(shí)施例1中步驟，進(jìn)行綜合評估，如果達(dá)到采苗標(biāo)準(zhǔn)，及時投放附著基。如果尚未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，就暫時不投放附著基，免得還的將附著基拿上來，曬干，重下`，浪費(fèi)人力、物力、財(cái)力等資源。
【權(quán)利要求】
1.一種提高香港牡蠣天然采苗效率的預(yù)報(bào)方法，其特征在于，包括以下步驟: a、幼蟲采集:在天然海區(qū)，當(dāng)香港牡蠣進(jìn)入繁殖季節(jié)時，定期采集牡蠣樣品，觀測是否產(chǎn)卵排精，當(dāng)發(fā)現(xiàn)牡蠣受刺激后消瘦，經(jīng)過10~15天后，受精卵發(fā)育至眼點(diǎn)前期幼蟲，采集海區(qū)表層0.5~Im處的貝類幼蟲作為樣本； b、表型分類:對采集的樣品，首先通過顯微鏡觀察分類，將牡蠣幼蟲、其他雙殼貝類幼蟲和藤壺幼蟲進(jìn)行區(qū)分，確定牡蠣幼蟲的占比、牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的占比以及藤壺幼蟲的[tTt 匕 5 C、分子識別:隨機(jī)提取若干個單個牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的DNA，用4種巨蠣屬牡蠣的復(fù)合COI引物進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，再經(jīng)過特異性識別，即可得知牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的種類，確定香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲/牡蠣幼蟲的比例，以及其密度； 所述的4種巨蠣屬牡蠣的復(fù)合COI引物具體為:
COI 引物 1:AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCG(T)G ；
COI 引物 2:AGTTACCAAACCCCCCAATTATCAG(C)G ；
COI 引物 3:GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG ；
COI 引物 4:AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAAC(A) C ； d、綜合評估:當(dāng)香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲/牡蠣幼蟲的比例≥70%，香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲的密度≥50個/m3，敵害生物藤壺幼蟲/牡蠣幼蟲的比例≤10%時，達(dá)到采苗要求； e、適時采苗:當(dāng)香港牡蠣眼點(diǎn)前期幼蟲發(fā)育至眼點(diǎn)后期階段時，發(fā)送采苗預(yù)報(bào)，投放附著基至海區(qū)，即可采收到大量天然香港牡蠣苗種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)報(bào)方法，其特征在于，步驟a所述的刺激為臺風(fēng)或者暴雨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)報(bào)方法，其特征在于，所述的采集海區(qū)表層0.5~Im處的貝類幼蟲作為樣本是采用300目篩絹網(wǎng)進(jìn)行取樣。
【文檔編號】A01K61/00GK103766256SQ201410015071
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】肖述, 張躍環(huán), 張揚(yáng), 喻子牛 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所