一種利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，具體過(guò)程是：利用改造的P450單加氧酶基因和合成的葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）基因來(lái)構(gòu)建二價(jià)基因植物表達(dá)載體，然后將二價(jià)基因表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到植物中。利用本發(fā)明，使獲得的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)多環(huán)芳烴的耐受性和降解能力提高，種植這種轉(zhuǎn)基因植物有利于修復(fù)被多環(huán)芳烴污染的土壤環(huán)境。
【專利說(shuō)明】一種利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳烴(PAHs)及其衍生物是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機(jī)污染物。多環(huán)芳烴含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔?，可分為芳香稠環(huán)和非芳香稠環(huán)型，環(huán)境污染研究中的多環(huán)芳烴一般是指芳香稠環(huán)型，其中16種多環(huán)芳烴化合物已被美國(guó)環(huán)保局列入優(yōu)先控制的污染物黑名單。多環(huán)芳烴大多是石油、煤等化石燃料以及木材、天然氣、有機(jī)高分子化合物、紙張、作物秸桿、煙草等含碳?xì)浠衔锏奈镔|(zhì)經(jīng)不完全燃燒或在還原性氣氛中經(jīng)熱分解而生成的，PAHs環(huán)數(shù)相對(duì)豐度可以反映來(lái)自熱解或石油類污染，通常4環(huán)及4環(huán)以上PAHs主要來(lái)源于化石燃料高溫燃燒，而2環(huán)和3環(huán)PAHs則來(lái)源于石油類污染。一般而言2-3環(huán)的低分子量PAHs具有顯著的急性毒性，而某些高分子量的PAHs則具有潛在的致癌性，有很強(qiáng)的致畸、致癌、致突變作用。多環(huán)芳烴化合物由于水溶性差，辛醇-水分配系數(shù)高，常被吸附于土壤顆粒上。因此，該類化合物易于從水中分配到生物體內(nèi)，沉積層中土壤就成為PAHs的主要載體。多環(huán)芳烴在環(huán)境中不斷積累，其半衰期少則2個(gè)月、多則幾年。多環(huán)芳烴進(jìn)入土壤后，由土壤表面污染進(jìn)一步導(dǎo)致下層土壤污染，甚至地下水污染。
[0003]利用植物治理土壤多環(huán)芳烴污染是一類節(jié)能且對(duì)環(huán)境相對(duì)安全的方法。和微生物修復(fù)相比，植物修復(fù)更適應(yīng)原地修復(fù)，它具有修復(fù)面積大、投資少、不破環(huán)場(chǎng)地結(jié)構(gòu)、不引起地下水二次污染等優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)重金屬和有機(jī)污染物的處理中已顯示明顯的有效性，有的已經(jīng)達(dá)到野外應(yīng)用的水平。但是由于植物對(duì)多環(huán)芳烴的羥化作用較弱，因此對(duì)于多環(huán)芳烴的降解能力較低。
[0004]本發(fā)明通過(guò)將動(dòng)物的細(xì)胞色素氧化酶基因轉(zhuǎn)化到植物中，來(lái)加快被吸收到植物體內(nèi)的多環(huán)芳烴的氧化解環(huán)。同時(shí)將谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶基因轉(zhuǎn)化到植物中，將多環(huán)芳烴的氧化產(chǎn)物安全轉(zhuǎn)移到細(xì)胞器中，進(jìn)一步分解，降低多環(huán)芳烴的氧化產(chǎn)物對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用，通過(guò)培育環(huán)境友好型轉(zhuǎn)基因植物，提高植物對(duì)PAHs的修復(fù)能力。
[0005]細(xì)胞色素P450是一類以血紅素為輔基的B族細(xì)胞色素超家族蛋白酶。P450是一種末端加氧酶，從NAD (P) H獲得電子后，催化單加氧反應(yīng)。P450能夠在生物體內(nèi)催化多種內(nèi)源性物質(zhì)的生物合成，還參與許多外源性難降解有機(jī)物的生物氧化和降解。
[0006]P450在原核和真核生物中廣泛存在。真核生物中的P450為膜結(jié)合狀態(tài)，原核生物中的P450為游離狀態(tài)，為一種可溶性蛋白。Fowler (Journal of the ChemicalSociety, Chemical Communications.1994，2761 - 2762)和 Stevenson (Journal of theAmerican Chemical Society, 1996,118，12846-12847)發(fā)現(xiàn) P450cam 的底物結(jié)合部位中酪氨酸Y96突變可以改變其底物的特異性。Y96A突變體能夠氧化不被天然P450酶氧化的物質(zhì)二苯基甲烷，Y96A突變體的底物結(jié)合部位具有更大的空間，表示它對(duì)底物的要求可能具有更大的可塑性。Y96F突變體使原來(lái)底物樟腦的氧化區(qū)域和立體選擇性發(fā)生了變化，但是提高了多環(huán)芳烴萘和芘氧化區(qū)域?qū)Ｒ恍?，I位和2位萘酚的比例達(dá)到93:3。另一個(gè)位點(diǎn)F87參與了蛋白質(zhì)與底物的結(jié)合，F(xiàn)87A (L)與Y96F雙突變體促使P450cam提高了多環(huán)芳烴菲、芘和苯并芘的氧化效率。P450BM-3在ω?和ω 3位催化C12-C20飽和或不飽和脂肪酸的氧化。對(duì)枯草桿菌(Bacillus megaterium)的P450BM-3中底物結(jié)合位點(diǎn)R47L/Y51F進(jìn)行雙突變，使該區(qū)域疏水性加強(qiáng)后，對(duì)多環(huán)芳烴的氧化活性提高了 40倍；將3個(gè)位點(diǎn)A74G/F87V/L188Q進(jìn)行突變，對(duì)多環(huán)芳烴萘、芴、二氫苊和苊的氧化活性分別提高到160、53、109和287/min,底物的氧化速率比野生型P450BM-3提高了數(shù)百倍(Li等Applied Biochemistry andBiotechnology2008，144，27-36)。P450BM-3能在大腸桿菌中高效表達(dá)，并具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因此，該基因被認(rèn)為最適應(yīng)用于構(gòu)建多環(huán)芳烴氧化的工程菌株。最近，Brezna等又從分枝桿菌(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)中克隆獲得了 3 個(gè) P450 基因 cypl51 (pipA)、cypl50和cyp51，將這些基因在大腸桿菌中表達(dá)后，能夠有效地分解二苯并噻吩、7-甲基苯并[α ]蒽和芘。表明Ρ450在很多細(xì)菌中參與了多環(huán)芳烴的代謝(Applied Microbiologyand Biotechnology2006，71，522-532)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素P450單加氧酶在肝臟解毒中作用巨大，將這些基因轉(zhuǎn)化到植物中能降解很多有機(jī)污染物。研究發(fā)現(xiàn)人P450單加氧酶CYPlAl能夠有效地氧化苯并[a]芘等高分子量PAHs，因此根據(jù)Gleba等人的方法，用分泌性信號(hào)肽使該基因在植物中大量表達(dá)后，分泌到根表面及土壤中，使根系周圍PAHs羥化，從而提高植物對(duì)高分子量PAHs吸收效率(Proceedings of the National Academy ofSciencesl999,96,5973-5977)。[0007]谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GlutathioneS-tranSferaSeS，簡(jiǎn)稱 GSTS，EC2.5.1.18)是廣泛分布于哺乳動(dòng)物、植物、鳥類、昆蟲、寄生蟲及微生物體內(nèi)的一組多功能同工酶，其主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來(lái)有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易于穿越細(xì)胞膜，分解后排出體外，從而達(dá)到解毒的目的。親電子類物質(zhì)包括過(guò)氧化物、不飽和醛酮、烷基或芳香基化合物。GSTS的普遍底物是2，4- 二硝基氯苯(⑶NB )，GSTS的催化機(jī)理是促使GSH與⑶NB結(jié)合生成S-2，4- 二硝基苯谷胱甘肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，該方法通過(guò)將人的P450單加氧酶基因與葡萄GST基因轉(zhuǎn)化到植物中，拓寬植物修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的范圍，加快吸收效率。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010]一種利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法:將改造的P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因構(gòu)建二價(jià)基因植物表達(dá)載體；將所述構(gòu)建的二價(jià)基因植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到植物中。
[0011]優(yōu)選地，所述P450單加氧酶基因來(lái)源于人肝。
[0012]優(yōu)選地，所述P450單加氧酶基因的改造方法是:通過(guò)定點(diǎn)突變方法消除P450單加氧酶(cyplAl)基因的129位NcoI切點(diǎn)和1436位EcoRI切點(diǎn)。
[0013]優(yōu)選地，所述葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因按植物偏愛(ài)密碼通過(guò)合成方法獲得。
[0014]優(yōu)選地，利用口蹄疫病毒2A區(qū)編碼序列將所述P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST )基因串聯(lián)在一起。[0015]所述P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因構(gòu)建二價(jià)基因植物表達(dá)載體的方法為:通過(guò)T4DNA連接酶將兩個(gè)基因與含有雙35S啟動(dòng)子和Nos終止子的PYPX245 (Genbank AY178049.1)質(zhì)粒連接；酶切鑒定和序列測(cè)定表明獲得了 P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因植物表達(dá)單元；將兩個(gè)表達(dá)單元酶切后依次插入PCAMBIA1301植物表達(dá)載體，構(gòu)建二價(jià)基因植物表達(dá)載體pCYPGST。
[0016]所述構(gòu)建的二價(jià)基因植物表達(dá)載體pCYPGST通過(guò)電擊法導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌中，所述根癌農(nóng)桿菌優(yōu)選為EHA105或LBA4404或GV3101。
[0017]優(yōu)選地，通過(guò)所述根癌農(nóng)桿菌將構(gòu)建的二價(jià)基因植物表達(dá)載體pCYPUGT轉(zhuǎn)化到擬南芥和水稻中。
[0018]本發(fā)明的有益效果如下:
[0019]1.當(dāng)植物中轉(zhuǎn)化了 P450單加氧酶基因(cyplAl)和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因的表達(dá)載體后，通過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的P450單加氧酶將多環(huán)芳烴氧化；氧化產(chǎn)物再通過(guò)與谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)結(jié)合，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外或細(xì)胞器中，從而降低了多環(huán)芳烴氧化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害。
[0020]2.通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于菲或芘的耐受性和降解能力有顯著提高。
[0021]3.該套體系能在植物中安全高效表達(dá)，對(duì)環(huán)境影響較小。
[0022]4.利用該套體系獲得的轉(zhuǎn)基因植物能夠有效修復(fù)被多環(huán)芳烴污染的土壤環(huán)境。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中構(gòu)建的P450單加氧酶基因(cyplAl)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因雙價(jià)基因植物表達(dá)載體。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例中涉及的構(gòu)建二價(jià)基因植物表達(dá)載體pCYPGST，其具體的構(gòu)建方法如下:
[0025]1、構(gòu)建改造的P450單加氧酶基因(cyplAl)
[0026]從人肝中克隆P450單加氧酶基因并利用定點(diǎn)突變方法將129位NcoI切點(diǎn)，1436位EcoRI切點(diǎn)消除。
[0027]129 位 NcoI 切點(diǎn)突變引物:129Z:AGGGCCTTGGGG CTGGCCTCTGATTGG (SEQ ID N0.1所示)；129FCCAATCAGAGGCCAGCCCCAAGGCCCT (SEQ ID N0.2 所示)。
[0028]1436 位 EcoRI 切點(diǎn)突變引物:1436Z:ACGGGTGGAGTT CAGCGTGCCACTGG (SEQ IDN0.3 所示)；1436F:CCAGTGGCACGCTGAACTCCACCCGT (SEQ ID N0.4 所示)。
[0029]人肝總RNA，cDNA合成試劑盒為Clontech公司產(chǎn)品；DNA柱回收試劑盒購(gòu)置Amersham公司；試劑RNA抽提試劑盒RNeasy Plant Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶和T4DNA Ligase均購(gòu)自上海Takara公司?？俁NA采用QIAGEN公司的RNeasyPlant Mini Kit 提取。
[0030]取約50 μ I人肝總RNA進(jìn)行cDNA合成，cDNA的合成按Clontech公司SMART cDNALibrary Construction Kit說(shuō)明書操作進(jìn)行第一鏈合成。
[0031]以合成的cDNA 第一鏈為模板，以此 cyplOlZ:AAGGATC CATGCTTTTCCCAATCTCCATG(SEQ ID N0.5 所示)和 cyplOlF:AAGAGCTCCTAAGAGCGC AGCTGCATTTGGAAGTG (SEQ ID N0.6所示)為引物，利用PCR進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱Imin ;94°C，30s，60°C，30s，72°C，3min。共25個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，采用酚:氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。沉淀用30 μ I水溶解，取I μ I為模板，以引物cyplOlZ和129F ；129Z和1436F ；1436Z 和 cyplOlF 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱 Imin ;94°C，30s，60°C，30s，72°C，lmin。共25個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后，DNA片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述3個(gè)回收片斷取IO-1OOng為模板混合，以cyplOlZ和cyplOlF為引物將上述片斷拼接，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱 lmin ;94°C，30s，60°C，30s，72°C，4min。共 25 個(gè)循環(huán)。
[0032]PCR結(jié)束后，酚:氯仿抽提，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀。各加入SacI和BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片斷。將酶切處理好片段進(jìn)行定向克隆，獲得質(zhì)粒Tl，并將質(zhì)粒Tl高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。
[0033]2、合成葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因
[0034]以基因合成方法(Nucleic Acids Research, 2004，32，e98)合成葡萄谷胱;甘妝轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因。
[0035]設(shè)計(jì)的引物為:
[0036]VvGSTl:ATGAACACCTTGACTCTGAAGTTCCCATACAATCTGCATCCAAACTCC CTGAACTACTCC(SEQ ID N0.7 所示)
[0037]VvGST2:AGGAGGAGGACTTGTTTGGGAACTTTGGAGAGATGTTGGTGGAGTAG TTCAGGGAGTTTG(SEQ ID N0.8 所示)
[0038]VvGST3:CCCAAACAAGTCCTCCTCCTTCCACCCACTGTTCTCCAACTCCAAGGG TAACATCTCTCC(SEQ ID N0.9 所示)
[0039]VvGST4:AAGGACCTCTTCAGCAGAGGTGACAGCCATAGATGCCAGTGGAGAGA TGTTACCCTTGGA(SEQ ID N0.10 所示)
[0040]VvGST5:CCTCTGCTGAAGAGGTCCTTCCACCATCTCTGGACTCCACCTCTGAAC CACCACCACTGT(SEQ ID N0.11 所示)
[0041]VvGST6:GGACAGATGTAGGAGGTGTACAGACGAGTAGTACCATCGAAAGGACC TCTTCAGCAGAGG(SEQ ID N0.12 所示)
[0042]VvGST7:CCTCTGCTGAAGAGGTCCTTATACGCACAGCGTGTCTGGATTGCTCGT AACTACAAGGGT(SEQ ID N0.13 所示)
[0043]VvGST8:TACCAAGATCGATTGGAACCAGTTTGATCTTGTCCTGAAGACCCTTGT AGTTACGAGCAA(SEQ ID N0.14 所示)
[0044]VvGST9: GGTTCCAATCGATCTTGGTAATCGTCCTGCTTGGTACAAGGAGAAAGT CTATCCAGAGAA(SEQ ID N0.15 所示)
[0045]VvGST10:ACCAGTGACTTTGTTGTTGTGCTCCAGAGATGGGACCTTGTTCTCTGG ATAGACTTTCTC(SEQ ID N0.16 所示) [0046]VvGST11:ACAACAACAAAGTCACTGGTGAATCCCTGGACCTGATCAAGTACATC GACTCCCACTTCG(SEQ ID N0.17 所示)
[0047]VvGST 12:TGACGCTTGTTTGGATCATCAGGGTACAGAGATGGACCTTCGAAGTG GGAGTCGATGTAC(SEQ ID N0.18 所示)[0048]VvGSTI3:GATGATCCAAACAAGCGTCAGTTCGCTGAAGAGCTGCTGTCCTACAC CTACACCTTCAAT(SEQ ID N0.19 所示)
[0049]VvGST 14:CGTTCTGAGAGTCACCCTTCAGGGAGAAGATGACAGCACGATTGAAG GTGTAGGTGTAGG(SEQ ID N0.20 所示)
[0050]VvGST15:GAAGGGTGACTCTCAGAACGAGATCAATGCTGCCTTCGACTACCTGG AAACTGCACTGTC(SEQ ID N0.21 所示)
[0051]VvGSTI6:AGAGAACTGACCCAGGAAGAATGGACCATCGTTGAACTTGGACAGTG CAGTTTCCAGGTA(SEQ ID N0.22 所示)
[0052]VvGSTI7:TCTTCCTGGGTCAGTTCTCTCTGGTTGACATCGCATTCGCACCATTCAT CGAACGTTTCC(SEQ ID N0.23 所示)
[0053]VvGSTI8:GAGGTGATGTCACACTTCTTGACATCCAGCAGCAGTGGATGGAAACG TTCGATGAATGGT(SEQ ID N0.24 所示)
[0054]VvGST19: AAGAAGTGTGACATCACCTCTGGACGTCCAAAGCTGGTCTCTTGGATCGAGGAGATGAAC (SEQ ID N0.25 所示)
[0055]VvGST20:CCTGTGGATCACGTTTGGTCTGTTTGTATGCCTCGATCTTGTTCATCTC CTCGATCCAAG(SEQ ID N0.26 所示)
[0056]VvGST21:GACCAAACGTGATCCACAGGAGCTTGTTGATGCACTGAAGAAGCGTT TCATGGCAAACGA(SEQ ID N0.27 所示)
[0057]VvGST22:GAGCTCT TAGAATTCGTTTGCCATGAAACGCTTCTTC (SEQ ID N0.28 所示)
[0058]利用PCR進(jìn)行葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因合成，在100 μ I反應(yīng)體系中，VvGST2-VvGST21共20個(gè)引物的添加量為2ng，外側(cè)引物VvGSTl和VvGST22添加量為30ng，擴(kuò)增條件為:94°C，預(yù)熱 lmin ；94°C，30s, 50°C，30s, 72°C，IOmin,使用的 Taq DNA 聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖膠回收，取10μ I直接與Τ/Α克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過(guò)夜，獲得質(zhì)粒T2，將質(zhì)粒T2高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞中。獲得陽(yáng)性克隆，測(cè)定葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的基因序列(SEQ ID N0.29 所示)。
[0059]3、構(gòu)建P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因二價(jià)基因植物表達(dá)載體
[0060]構(gòu)建含有改造過(guò)的人P450單加氧酶基因片段和合成葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因的融合基因CYPGST，在兩個(gè)基因的連接處引入了口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus, FMDV)的由20個(gè)氨基酸組成的2A寡肽序列(2A oligopeptide)的編碼基因:CAACTTCTCAACTTCGACCTTCTCAAACTTGCTGGTGATGTCGAATCC AACCCTGGTCCTA (SEQ IDN0.30 所示)。兩個(gè)基因拼接的引物為:CYPGST1:ATCACCAGCAAGTTTGAGAAGGTCGAAGTTGAGAAGTTGCTAAGAGC GCAGCTGCATTTG (SEQ ID N0.31 所示)；CYPGST2:TTCTCAAACTTGCTGGTGATGTCGAATCCAACCCTGGTCCTAATGAAC ACCTTGACTCTG (SEQ ID N0.32 所示)。利用 PCR 進(jìn)行 P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶基因的融合，先用cyplOlZ和CYPGST1 ；CYPGST2和VvGST22兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱lmin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，lOmin，使用的Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物通過(guò)10%聚丙烯酰胺膠回收，各取I μ I的PCR回收產(chǎn)物作為模板，以cyplOlZ和VvGST22引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖電泳回收，回收產(chǎn)物直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過(guò)夜，獲得質(zhì)粒T3，將質(zhì)粒T3高效轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽(yáng)性克隆。
[0061]將前述獲得的質(zhì)粒Τ3分別用BamHI和SacI進(jìn)行雙酶切，回收DNA片段，通過(guò)T4DNA連接酶將兩個(gè)目的片段與含有雙35S啟動(dòng)子和NOS終止子的pYPX245 (GenbankAY178049.1)質(zhì)粒連接，酶切鑒定和序列測(cè)定表明獲得了含有P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶基因的植物表達(dá)單元。將兩個(gè)表達(dá)單元酶切后依次插入PCAMBIA1301植物表達(dá)載體，構(gòu)建二價(jià)基因植物表達(dá)載體pCYPGST。該表達(dá)載體還包含⑶S報(bào)告基因和帶內(nèi)含子卡那霉素抗性標(biāo)記基因。
[0062]實(shí)施例1，轉(zhuǎn)基因的擬南芥對(duì)菲和芘耐受性和降解能力的影響
[0063]I)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
[0064]農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌EHA105，或LBA4404，或GV3101菌株(BiovectorC0.，LTD)。挑取單菌在25ml YEB培養(yǎng)基(添加50mg/l利福平)培養(yǎng)過(guò)夜，取5ml菌液轉(zhuǎn)接到IOOml YEB培養(yǎng)基(添加50mg/l利福平)，培養(yǎng)至0D600=0.7-0.8，菌液冰上放置10分鐘，5000rpm離心lOmin, 4°C,收集菌體,加入IOOml無(wú)菌雙蒸水清洗兩次。加入4mll0%甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到50ml離心管。5500rpm離心lOmin, 4°C。收集菌體，加入500 μ 110%甘油懸浮菌體，轉(zhuǎn)到1.5ml離心管。
[0065]2) 二價(jià)基因植物表達(dá)載體pCYPGST經(jīng)電擊法導(dǎo)人農(nóng)桿菌中
[0066]取70 μ I農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入1μ I表達(dá)載體pCYPGST。混勻，轉(zhuǎn)到0.1cm電擊杯中。電擊參數(shù):200 Ω，1.7KV，2.5F，電擊后立即加入800 μ I SOC培養(yǎng)液。培養(yǎng)I小時(shí)后，取100 μ I涂50 μ g/L卡那霉素抗性板篩選轉(zhuǎn)化子，28°C培養(yǎng)。
[0067]3)擬南芥粘花法轉(zhuǎn)化
[0068]將前述步驟2 )獲得的含有表達(dá)載體pCYPGST的農(nóng)桿菌菌株單菌落接菌在5毫升含對(duì)應(yīng)卡那霉素抗生素的LB培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)2天。將5毫升菌液轉(zhuǎn)到500毫升的液體LB培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)16-24小時(shí)(OD=L 5-2.0)。液體可以在4°C保存30天。室溫下離心收集菌體，4000g離心10分鐘。用等體積5%的新鮮蔗糖溶液懸浮。加入0.02%的Silwet-77混勻后轉(zhuǎn)移到燒杯中。每個(gè)菌株用300毫升轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)2-3缽。隔7天后再轉(zhuǎn)化I次。轉(zhuǎn)化操作中將擬南芥倒置后浸入菌液中10秒鐘。蓮座和花序都要侵染。侵染后將轉(zhuǎn)化植株菌液空干3-5秒。用保鮮膜將轉(zhuǎn)化植株圈好，平放16-24小時(shí)。轉(zhuǎn)化后不要放置在高溫和強(qiáng)光下。揭開保鮮膜，保持一定濕度，再生長(zhǎng)I個(gè)月后收種子。利用50 μ g/mL潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株篩選。
[0069]4)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因擬南芥具有P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0070]抽提轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA，將擬南芥幼苗液氮冷凍后抽提總RNA，RNA抽提試劑盒RNeasy Plant Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品；利用Clontech公司cDNA合成試劑盒合成cDNA第一鏈；DNA柱回收試劑盒購(gòu)置Amersham公司；各種限制性內(nèi)切酶和T4DNA Ligase均購(gòu)自上海Takara公司。總RNA采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit提取。
[0071]取約50 μ I擬南芥總RNA進(jìn)行cDNA合成，按Clontech公司cDNA合成說(shuō)明書操作進(jìn)行第一鏈合成。[0072]取Ιμ? cDNA合成產(chǎn)物檢測(cè)Ρ450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因的表達(dá)。P450單加氧酶基因表達(dá)檢測(cè)引物為:CYPl:ACCAGTGGCAGATCAACCATG (SEQID N0.33 所示)；CYP2:CTAAGAGCGCAGCTGCATTTG (SEQ ID N0.34 所示)。葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因檢測(cè)引物為:GST1:GAAGACCAGGAGGCTGCTA (SEQ ID N0.35 所示)；GST2:GATACCGAACTTCTTACGCA (SEQ ID N0.36 所示)。PCR 擴(kuò)增條件為:94°C，預(yù)熱 lmin ;94°C，30s，50°C，30s，72°C，30s，擴(kuò)增25循環(huán)，能在轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)到約300bp條帶，而野生型擬南芥沒(méi)有，表明兩個(gè)基因能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
[0073]5)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)多環(huán)芳烴的耐受性和降解
[0074]將轉(zhuǎn)基因擬南芥自交純合3代，獲得純合轉(zhuǎn)化株，收取種子。播種后，移栽到含有0.2mM芘或0.5mM菲的基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3周，觀察植物的生長(zhǎng)情況。收集所有的培養(yǎng)基，用60mLl:1的丙酮和正己烷溶液分3次萃取，每次20mL并在超聲水浴中超聲萃取30分鐘，然后將萃取液收集，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入2mL甲醇溶解。將抽提液進(jìn)行HPLC分析，流動(dòng)相為甲醇-水，流速為lmL/min，柱溫30°C，進(jìn)樣量為40 μ L，在此條件下所得菲和芘的色譜圖清晰。
[0075]色譜圖結(jié)果表明:
[0076]轉(zhuǎn)基因擬南芥培養(yǎng)3周后降解培養(yǎng)基中的菲為35.4-42.9%，而野生型擬南芥對(duì)照只有11.2%。轉(zhuǎn)基因擬南芥培養(yǎng)3周后降解培養(yǎng)基中的芘為33.5-39.8%，而野生型擬南芥對(duì)照只有20%。
[0077]
【權(quán)利要求】
1.一種利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，包括如下步驟: 步驟1，將改造的P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因構(gòu)建二價(jià)基因植物表達(dá)載體； 步驟2，將所述構(gòu)建的二價(jià)基因植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到植物中。
2.如權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，其特征在于:所述P450單加氧酶基因來(lái)源于人肝。
3.如權(quán)利要求1或2所述的利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，其特征在于:所述P450單加氧酶基因的改造方法是，消除P450單加氧酶(cyplAl)基因的129位NcoI切點(diǎn)和1436位EcoRI切點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，其特征在于:所述葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因按植物偏愛(ài)密碼通過(guò)合成方法獲得。
5.如權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，其特征在于:利用口蹄疫病毒2A區(qū)編碼序列將所述P450單加氧酶基因和葡萄谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)基因串聯(lián)。
6.如權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)基因 植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，其特征在于:所述農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105或根癌農(nóng)桿菌LBA4404或根癌農(nóng)桿菌GV3101。
7.如權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，其特征在于:所述多環(huán)芳烴為菲、芘。
8.如權(quán)利要求1所述的利用轉(zhuǎn)基因植物提高對(duì)多環(huán)芳烴降解能力的方法，其特征在于:所述植物為擬南芥、水稻。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103468738SQ201310408166
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】彭日荷, 姚泉洪, 王榮談, 付曉燕, 田永生, 趙偉, 嚴(yán)培蘭, 臧曉韻, 王波, 王麗娟 申請(qǐng)人:上海瑞豐農(nóng)業(yè)科技有限公司, 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院