專利名稱：一種CoCl₂處理提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說，是CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術(shù)：
青蒿素作為一種有效的抗瘧疾藥物已經(jīng)得到全世界的認(rèn)同。目前，青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取。Artemisia annua L.(青蒿)又名黃花蒿,是一年生草本藥用植物。由于青蒿中青蒿素的含量比較低(占干重的0.01%-1%)，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。雖然現(xiàn)在已經(jīng)能夠人工合成青蒿素，但是由于難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具備商業(yè)化生產(chǎn)的可行性。利用組織培養(yǎng)及細(xì)胞工程來生產(chǎn)青蒿素是一種很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0.1%，在芽中，最高含量也只有干重的0.16%，而大多數(shù)研究在根中沒有檢測到青蒿素，因此利用組織培養(yǎng)及細(xì)胞工程技術(shù)來生產(chǎn)青蒿素的可行性不高。另外利用基因工程技術(shù)獲得青蒿素含量較高的青蒿新品種是一種較可行的方法，但是目前利用基因工程來提高青蒿素含量還處于嘗試階段，整個技術(shù)并不成熟。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),Dahua Chen等在《Plant Science》(《植物科學(xué)》，2000 年 155 期 179-185 頁)發(fā)表了題為“Expression of chimeric farnesyl diphosphatesynthase gene in Artemisia annua L.transgenic plants via Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation”(“通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在青蒿植株中表達(dá)法尼基焦磷酸合酶基因”)的論文，報道通過在青蒿植株中過量表達(dá)FPS (法尼基焦磷酸合酶)在原有基礎(chǔ)上提高青蒿素含量2-3倍，但仍只有干重的1%左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服常規(guī)技術(shù)中的不足，提供一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，使其有效地提高了青蒿中青蒿素的含量，且無需很高的前期投入、操作簡單、便于規(guī)?；a(chǎn)。 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:首先將青蒿的種子種植于發(fā)苗培養(yǎng)基中發(fā)苗，然后將青蒿苗移栽于泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)中用普通營養(yǎng)液每周澆灌青蒿苗一次，在開花前期用CoCl2溶液處理，然后進(jìn)行按期采收；所述的發(fā)苗培養(yǎng)基，是通過在MS培養(yǎng)液中另外添加蔗糖和瓊脂而得，蔗糖和瓊脂在發(fā)苗培養(yǎng)基中的濃度分別為30g/L 10g/L ;其中MS培養(yǎng)液為Murashige和Skoog于1962年公布；所述的泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)中泥炭和珍珠巖的質(zhì)量比為1:1。所述青蒿移栽的具體方法是當(dāng)青蒿苗長至5cm時，將其移栽于泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)中。
用CoCl2溶液處理的具體方法是待植物生長至開花前期，用CoCl2溶液噴灑整株植株。所述CoCl2溶液的濃度為ImM-lOOmM。所述的普通營養(yǎng)液，其配方是38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3^8.8mg/L CaCl2.2H20、
7.4mg/L MgSO4.7Η20、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/LNaCl，余量為水。所述采收時間分別在CoCl2處理后的4小時，8小時，16小時，24小時，48小時，72小時或96小時，優(yōu)選72小時。本發(fā)明的原理在于，用CoCl2溶液處理青蒿植株能夠在短時間(4-96小時)內(nèi)提高一些青蒿素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，打破青蒿素合成途徑中的一些限速步驟，從而在短時間內(nèi)積累大量的青蒿素。所 述的一些青蒿素合成關(guān)鍵酶基因，是指3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase, HMGR)基因 hmgr、法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase, FPS)基因fps、紫穗槐二烯合成酶(amorpha-4, 11-diene synthase,ADS)基因ads和紫穗槐二烯氧化酶(amorpha-4，11-dieneC-12oxidase, CYP71AV1)基因 cyp71avl。本發(fā)明建立了通過CoCl2處理提高青蒿素含量的方法，能有效地提高青蒿中青蒿素的含量，處理過的青蒿中青蒿素的含量比對照提高了 100%以上。本發(fā)明的方法不需要利用基因工程方法提高青蒿素含量所要求的相對較高的前期投入，操作簡單，便于規(guī)?；a(chǎn)，對降低青蒿素的生產(chǎn)成本具有非常重要的意義。


圖1為用CoCl2溶液處理青蒿植株后不同時期采收的青蒿中青蒿素含量變化示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例將青蒿種子(來源于重慶酉陽青蒿素含量較高的青蒿品種)種植于發(fā)苗培養(yǎng)基上發(fā)苗，發(fā)苗培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)液，其中添加30g/L的蔗糖和10g/L的瓊脂而得。待青蒿苗長至5cm左右移栽于泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)(泥炭和珍珠巖的比例為1:1)中，用普通營養(yǎng)液每周澆灌一次。其中普通培養(yǎng)液的配方為38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3^8.8mg/LCaCl2.2H20、7.4mg/L MgSO4.7Η20、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/L NaCl，余量為水。待植株生長到40cm左右(植株開花前期)，用CoCl2溶液處理青蒿植株，同時用水處理的青蒿植株作為對照。分別采收處理4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時后的整株青蒿的葉片以及水處理的整株青蒿的葉片，用高效液相色譜測定青蒿素含量。結(jié)果如圖1所示，水處理的青蒿中青蒿素的含量6.172mg/g DW，在CoCl2溶液處理后，青蒿素的含量有了顯著的提高。在CoCl2溶液處理4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時后青蒿素的含量分別為6.491mg/g Dff,7.503mg/g DW、8.969mg/g DW、10.210mg/gDW、ll.140mg/g DW、13.984mg/g Dff,10.104mg/g DW，其中在處理72小時后青蒿
素的含量達(dá)到最高，是對照組的2倍多。應(yīng)用本發(fā)明方法，在開花前期用CoC12溶液噴灑青蒿植株進(jìn)行處理，可以顯著的提高青蒿植株中青蒿素的含量，同時不影響青蒿植株的生物量，從而顯著地提高了青蒿素的產(chǎn)量。由于本方法采用的CoCl2濃度低，因此具有投資少、效果顯著、方便易行的特點(diǎn)，對于降低青蒿素的生產(chǎn)成本、滿足青蒿素的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的意義。
以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:首先將青蒿的種子種植于發(fā)苗培養(yǎng)基中發(fā)苗，然后將青蒿苗移栽于泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)中用普通營養(yǎng)液每周澆灌青蒿苗一次，在開花前期用CoCl2溶液處理，然后進(jìn)行按期采收； 所述的發(fā)苗培養(yǎng)基，是通過在MS培養(yǎng)液中添加蔗糖和瓊脂而得，蔗糖和瓊脂在發(fā)苗培養(yǎng)基中的濃度分別為30g/L和10g/L ； 所述的泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)中泥炭和珍珠巖的質(zhì)量比為1:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:所述青蒿移栽的具體方法是當(dāng)青蒿苗長至5cm時，將其移栽于泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:用CoCl2溶液處理的具體方法是待植物生長至開花前期，用CoCl2溶液噴灑整株植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:所述CoCl2溶液的濃度為ImM-lOOmM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于: 所述的普通營養(yǎng)液，其配方是 38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3、8.8mg/L CaCl2.2H20、7.4mg/L MgSO4.7H2 0、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/LNaCl，余量為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:采收時間在CoCl2處理后的4小時，8小時，16小時，24小時，48小時，72小時或96小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:采收時間在CoCl2處理后的72小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于首先將青蒿的種子種植于發(fā)苗培養(yǎng)基中發(fā)苗，然后將青蒿苗移栽于泥炭珍珠巖培養(yǎng)基質(zhì)中用普通營養(yǎng)液每周澆灌青蒿苗一次，在開花前期用CoCl2溶液處理，然后進(jìn)行按期采收。本發(fā)明能有效地提高青蒿中青蒿素含量，操作簡單，不需要基因工程方法所要求的較高的前期投入，有效降低了青蒿素生產(chǎn)成本，對滿足青蒿素醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。
文檔編號A01G31/00GK103168669SQ20131009341
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者開國銀, 李青青 申請人:上海師范大學(xué)