專利名稱：一種與amf協(xié)同抗病促生的拮抗菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)，本發(fā)明涉及一種與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌及其在防治蔬菜土傳病害中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在新疆由于其獨(dú)特的地理及氣候條件，設(shè)施農(nóng)業(yè)成為蔬菜種植的主要模式之一， 并且隨著國(guó)家及自治區(qū)對(duì)菜籃子工程的重視，設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展速度及規(guī)模逐年提高和擴(kuò)大，但由于設(shè)施農(nóng)業(yè)病蟲害易發(fā)、難控制的現(xiàn)實(shí)情況，因此對(duì)于病蟲害的防控也提出了更高的要求，尤其是設(shè)施農(nóng)業(yè)中的蔬菜病害尤為嚴(yán)重，而土傳病害是防控的主要目標(biāo)之一；土傳病害是指生活在土壤中的病原體或者土壤中病株殘?bào)w中的病菌，從作物根部或莖部侵害而引起的病害；設(shè)施農(nóng)業(yè)蔬菜土傳病害主要有蔬菜根結(jié)線蟲病、瓜類枯萎病、黃萎病、苗期的立枯、猝倒病等；設(shè)施農(nóng)業(yè)蔬菜栽培，由于受地理?xiàng)l件限制，輪作倒茬困難，連作周期長(zhǎng)，加上溫度、濕度等條件有利于各種病害的發(fā)生、傳播，土傳病害防治難度較大，近年來(lái)，其發(fā)病率高、危害性大，已成為影響設(shè)施農(nóng)業(yè)蔬菜生產(chǎn)效益的主要障礙因素，嚴(yán)重制約著蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展;AM真菌叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal簡(jiǎn)稱AMF, AM真菌，舊稱 VA菌)普遍存在于世界各地的土壤中，其宿主包括苔蘚植物、蕨類植物、裸子植物和被子植物；據(jù)統(tǒng)計(jì)，地球上90%的維管植物和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中大多數(shù)作物都能形成叢枝菌根；叢枝菌根真菌與植物共生可以增加植物根部的吸收面積，增加對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)特別是對(duì)磷素的吸收，因此能促進(jìn)植物地上部和根部的吸收，同時(shí)還能提高植物的抗逆性；針對(duì)單個(gè)AMF對(duì)于作物的生長(zhǎng)、病害的防治，AM真菌與PGPR相互作用的效應(yīng)與機(jī)制等的報(bào)道、研究較多，但是能與AM真菌協(xié)同抗病促生的拮抗菌還未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌的未有報(bào)道及防控土傳病害拮抗菌的研究的現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌 {Bacillus amyloliquefaciens)及其作為防治蔬菜土傳病害拮抗菌中的應(yīng)用，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，采用本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌{Bacillus具有拮抗作用的細(xì)菌對(duì)于番茄枯萎病、黃瓜枯萎病、辣椒疫霉病的解決具有突出的技術(shù)效果，作為防治蔬菜土傳病害拮抗菌具有廣泛而適用的價(jià)值。
本發(fā)明采用主要的技術(shù)方案通過(guò)在新疆阜康郊區(qū)多年種植的農(nóng)田中采取土壤樣品進(jìn)行拮抗菌的篩選，獲得具有較強(qiáng)抑菌活性的的菌株，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選、馴化選育，獲得一株編號(hào)為S-13。通過(guò)對(duì)所獲菌株進(jìn)行形態(tài)特征及16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定了其分類地位；同時(shí)對(duì)該細(xì)菌S-13的發(fā)酵液的抑菌率、穩(wěn)定性等特性進(jìn)行了深入研究，作為防治蔬菜土傳病害拮抗菌提供了新的選擇，其拮抗作用對(duì)于番茄枯萎病、黃瓜枯萎病、辣椒疫霉病和辣椒炭疽病的解決具有突出的技術(shù)效果。
本發(fā)明具體提供的一種與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌芽孢桿菌(Macillus amyloli quefaci ens ),通過(guò)在新疆阜康郊區(qū)多年種植的農(nóng)田土壤中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批作為防治蔬菜土傳病害的微生物菌株，從中篩選出一株編號(hào)為S-13的菌株，防治蔬菜土傳病害具有穩(wěn)定而顯著的效果，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于解淀粉芽孢桿菌 amyloliquefaciens)。
具體的，本發(fā)明提供的一種與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌 {Bacillus amyloliquefaciens'),命名為S_13。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2012年9月3日，保藏號(hào)是CGMCC No. 6491。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為芽孢桿菌UaciJAz1S amyloliquefaciens\該菌株最適生長(zhǎng)條件為溫度32° C，培養(yǎng)基為固體LB,培養(yǎng)條件pH 7.0-7. 2，時(shí)間14-16h;菌落中等大小、扁平，表面干燥、有褶皺，邊緣不整齊，不透明；顯微觀察其菌體呈短桿狀，芽孢中生，不膨大；依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》(iBergey, s Manual of Sys tema tic Bac terio -logy)))和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)S-13菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定，生理生化檢測(cè)確定S-13菌株為芽孢桿菌{Bacillus中的成員。通過(guò)BLAST同源比對(duì),菌株S_13的16S rRNA序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，參見(jiàn)附圖2所示，菌株S-13與Bacillus amyloli quefaci ens⑶323369. I處于最小分支，是其近似種；菌株16S rRNA序列提交至GeneBmk中獲得基因登錄號(hào)為JN676212。因而將菌株S-13確定為解淀粉芽孢桿菌 (.Baci Ilus amyloli quefaci ens )。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌芽孢桿菌S-13 {Bacillus amyloli quefaci ens )作為防治蔬菜土傳病害的應(yīng)用。
同時(shí)，本發(fā)明證明，提供的與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌芽孢桿菌S-UiMcillus amyloli quefaci ens )作為番爺枯萎病、黃瓜枯萎病、辣椒疫霉病拮抗菌的應(yīng)用，具有良好的拮抗能力、廣譜拮抗作用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了菌種的保存條件，采用培養(yǎng)基成分蛋白胨1%(W/V)，酵母膏O.5% (W/V)，氯化鈉 1% (W/V)，瓊脂 2% (W/V)，pH 7. 0-7.2,121° C 滅菌 20 分鐘。培養(yǎng)條件在其LB培養(yǎng)基斜面上32° C條件下，培養(yǎng)14-16小時(shí)，后采用無(wú)菌的脫脂牛奶為保護(hù)劑，真空冷凍干燥后低溫保存；平時(shí)使用保存在LB培養(yǎng)基的斜面上，4° C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果。
(I)本發(fā)明提供了分離得到的芽孢桿菌CGMCC No. 6491，是一種解淀粉芽孢桿菌，作為防治蔬菜土傳病害的應(yīng)用具有較高的價(jià)值，尤其是能夠針對(duì)本地生境分離出的適應(yīng)本地氣候及生長(zhǎng)環(huán)境的拮抗菌對(duì)于提高作物產(chǎn)量，減少農(nóng)藥使用量，構(gòu)建良好的生態(tài)環(huán)境具有積極作用。
(2)本發(fā)明針對(duì)設(shè)施農(nóng)業(yè)中幾種常見(jiàn)的蔬菜病害篩選出一株具有較好拮抗能力、 廣譜拮抗作用的芽孢桿菌CGMCC No. 6491，經(jīng)過(guò)16S rRNA序列擴(kuò)增、比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)的建立初步鑒定為芽抱桿菌屬，ifeciJJiAs amyloli quefaci ens⑶323369. I的近似種。拮抗菌S-13具有廣譜抗真菌活性，能夠抑制番茄枯萎病原菌、辣椒疫霉病病原菌、辣椒炭疽病病原菌、黃瓜枯萎病病原菌等真菌，在平板對(duì)峙培養(yǎng)條件下表現(xiàn)良好，對(duì)于病原菌菌絲的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，并且拮抗菌S-13經(jīng)過(guò)抗生素誘導(dǎo)后的定殖研究表明，S-13能夠在植株的根部土壤、根、莖、葉等不同部位都有定殖，是一株優(yōu)良的拮抗菌株。同時(shí)為了能在今后方便、 高效的利用，優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝，使芽孢率與產(chǎn)量得到大幅提高，對(duì)于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有積極作用。該菌種芽孢桿菌S-13與AMF作為協(xié)同抗病促生的拮抗菌，具有良好的效果，作為防治蔬菜土傳病害的應(yīng)用具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，特別是作為番茄枯萎病、黃瓜枯萎病、辣椒疫霉病的應(yīng)用，具有良好的拮抗能力、廣譜拮抗作用。


圖I 顯不為解淀粉芽抱桿菌 Cfeci77w5· amyloli quefaci ens ) CGMCC No. 6491 的菌落形態(tài)圖。
圖2 顯不為解淀粉芽抱桿菌 Cfeci77w5· amyloli quefaci ens ) CGMCC No. 6491 的生長(zhǎng)曲線圖。
圖3 顯不為解淀粉芽抱桿菌amyloli quefaci ens )CGMCC No. 6491—的 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。
圖4顯示為黃瓜枯萎病發(fā)病率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。
圖5顯示為平板對(duì)峙培養(yǎng)與番茄育苗實(shí)驗(yàn)圖。
圖6顯示為番茄發(fā)病率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。
圖7顯示為辣椒疫霉病植株死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設(shè)備本發(fā)明采用的植物病原菌番爺枯萎病菌株黃瓜枯萎病原菌 iFusarium oxysporium f. sp. cucumerinum)、敕椒良霉病盾、舊 iPhytophthora cap-sici Leonian )都由ACCC (中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)提供，本發(fā)明選用的AM真菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員都可以通過(guò)公眾渠道獲得。
培養(yǎng)基及其它材料培養(yǎng)基選用LB固體、液體培養(yǎng)基；作物種子采用番茄、黃瓜、辣椒作為蔬菜類中代表性試驗(yàn)種類。
主要儀器與試劑MSSPX-250型生化培養(yǎng)箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，Sff-CJ-IF B型單人雙面凈化工作臺(tái)，E360K離心機(jī)，恒溫?fù)u床HWY-IOOt5PCR儀Eppendorf No:5345,電泳儀 Bio-Rad Mode 200/2. 0，凝膠成像儀 United-Bio, GK-330C plus, PCR 預(yù)混液{TaKaRa Biotechnology),其余試劑均為分析純。
本發(fā)明中選用的所有菌種和原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)條件和方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。
實(shí)施例一解淀粉芽抱桿菌Cfeci77w5· amyloli quefaci ens )CGMCC No. 6491 的分離、篩選及鑒定(I)拮抗菌的分離和篩選從農(nóng)田土樣中通過(guò)梯度稀釋法分離出多株細(xì)菌，采用平板對(duì)峙法，根據(jù)有無(wú)抑菌圈判斷其是否具有拮抗作用，初步篩選出對(duì)番茄枯萎病原菌、黃瓜枯萎病原菌、辣椒疫霉病原菌具有一定拮抗能力的菌株。對(duì)具有拮抗作用的菌株進(jìn)行二次對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，篩選出拮抗能力較強(qiáng)的囷株以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
復(fù)篩獲得一株具有良好拮抗番茄枯萎病原菌、黃瓜枯萎病原菌、辣椒疫霉病原菌作用的細(xì)菌分離物，命名為S-13，培養(yǎng)72小時(shí)其能夠明顯的抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其抑菌效果較為穩(wěn)定。
參見(jiàn)附圖1，獲得的S-13菌在培養(yǎng)基培養(yǎng)，該菌株最適生長(zhǎng)條件為溫度32 ° C，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件pH7. O,溫度32° C條件下培養(yǎng)14_16h;菌落中等大小、扁平，表面干燥、有褶皺，邊緣不整齊，不透明；顯微觀察其菌體呈短桿狀，芽孢中生，不膨大；依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》(《汝'/ 1 % 5 Manual of Systematic ifecierio-yo#》)和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)S-13菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定,生理生化檢測(cè)確定S-13菌株為芽抱桿菌^Bacillus中的成員。通過(guò)上述對(duì)S-13菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定，并對(duì)菌株S-13的形狀、大小、生理生化反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明的S-13菌株生物學(xué)特性如表I所示。
(2) PCR擴(kuò)增拮抗菌16S rRNA序列及其測(cè)序挑取少量單菌落，放入盛有25 μ L無(wú)菌水的EP管中，100° C煮沸8-10 min，后迅速放入冰水混合物中5 min。離心10000 r/min、5 min,4° C保存,用時(shí)取上清。PCR擴(kuò)增16S rRNA序列。
引物I (27F) :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；引物 2 (1492R) 5/ -CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3'。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，含有24 μ L premix Taq,引物I I μ L，引物2 I μ L， 模板 2 μ L，無(wú)菌水 22 μ L。擴(kuò)增條件94° C 4 min, 94° C 55 s，53° C 30 s，72° C 90 s，30個(gè)循環(huán)；72° C 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物(約1500 bp)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR 產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測(cè)序。
(3) 16S rRNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析將測(cè)序得到的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST分析，從中獲取相近的16S rRNA序列,用Clustal X軟件和MEGA 4. INeighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，參見(jiàn)附圖3。菌株16S rRNA序列提交利用GeneBank中的BankIt軟件進(jìn)行在線提交，獲得基因登錄號(hào)。
結(jié)合S-13的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生理生化特性，確定其為解淀粉芽孢桿菌OfeciJAz1S amyloli quefaci ens ) CGMCC No. 6491。
將S-13的16S rRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。 參見(jiàn)附圖3所不，菌株S-13與amyloli quefaci ens GU323369. I之間進(jìn)化距離 ^mBacillus amyloli quefaci ens的近似種。結(jié)合S_13的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生理生化特性，確定其為解淀粉芽孢桿菌iBacillus amyloliquefaciens\
表I :菌株S-13的生理生化特性
權(quán)利要求
1.一種與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌，其特征在于，拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌{Bacillus amyloliquefaciens^) CGMCC No. 6491。
2.如權(quán)利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌amyloliquefaciens)CGMCCNo. 6491作為防治蔬菜土傳病害中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌amyloliquefaci ens )CGMCCNo. 6491作為番茄枯萎病拮抗菌的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌amyloliquefaci ens )CGMCCNo. 6491作為黃瓜枯萎病拮抗菌的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求I所述的拮抗菌解淀粉芽孢桿菌amyloliquefaci ens )CGMCCNo. 6491作為辣椒疫霉病拮抗菌的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種與AMF協(xié)同抗病促生的拮抗菌及其應(yīng)用，該拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No. 6491。通過(guò)在新疆阜康郊區(qū)多年種植的農(nóng)田中采取土壤樣品進(jìn)行拮抗菌的篩選，獲得具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選、馴化選育，并通過(guò)對(duì)所獲菌株進(jìn)行形態(tài)特征及16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定了其分類地位；同時(shí)對(duì)該細(xì)菌的發(fā)酵液的抑菌率、穩(wěn)定性等特性進(jìn)行了深入研究，作為防治蔬菜土傳病害拮抗菌提供了新的選擇，其拮抗作用對(duì)于番茄枯萎病、黃瓜枯萎病、辣椒疫霉病和辣椒炭疽病的解決具有突出的技術(shù)效果，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102978128SQ20121043025
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者詹發(fā)強(qiáng), 侯敏, 崔衛(wèi)東, 楊蓉, 龍宣杞, 張慧濤, 侯新強(qiáng) 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所