對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌，本發(fā)明獲得的菌株，現(xiàn)保存在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年11月18日，保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2013575。該鏈霉菌被鑒定為阿南德氏鏈霉菌，命名為阿南德氏鏈霉菌JXNU02，拉丁文學(xué)名為StreptomycesanandiiJXNU02。阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液對(duì)鮮綠青霉具有較強(qiáng)抑制作用，且性能穩(wěn)定，對(duì)開發(fā)成新型的生物防腐劑具有較好的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]鮮綠青霉iPenicillium屬于青霉屬真菌,常在谷物、水果、蔬菜、堅(jiān)果和肉類等食品成熟和貯藏過程中生長(zhǎng)繁殖。鮮綠青霉在生長(zhǎng)繁殖過程中易產(chǎn)生多種真菌毒素，如赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。OTA具有強(qiáng)烈的致癌性和致畸性，同時(shí)對(duì)腎臟和肝臟有嚴(yán)重?fù)p害，是食品主要污染源之一，對(duì)人類健康及動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)有重大危害。因此鮮綠青霉的防治受到學(xué)者廣泛關(guān)注。
[0003]由于食品在加工、貯藏、消費(fèi)的過程中易受到各種有害微生物的侵害而變質(zhì)，食品防腐保鮮便成了食品工業(yè)中的重要問題。隨著人們生活水平的提高，及環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，傳統(tǒng)的化學(xué)保鮮劑已被證實(shí)具有潛在的危害性。因此，開發(fā)高效、無毒、安全的生物保鮮劑勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供具有抗真菌作用，特別是對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌。
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下:本發(fā)明所述的對(duì)鮮綠青霉有有拮抗作用的鏈霉菌，是從江西省南昌市郊區(qū)采集的土樣經(jīng)分離制備獲得，其學(xué)名為阿南德氏鏈霉菌JXNU02iStreptomyces anandii JXNUO2)。
[0006]本發(fā)明所述的對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌的菌株已保存在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；保藏日期為2013年11月18日，保`藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013575。
[0007]阿南德氏鏈霉菌JXNU02菌株的形態(tài)特征:
基內(nèi)菌絲發(fā)育良好，無橫隔、不斷裂；氣生菌絲在ISP2培養(yǎng)基(酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂20 g，蒸餾水I L，pH 7.3 )上生長(zhǎng)良好，多分枝，可形成孢子鏈，孢子絲呈螺旋形，孢子橢圓形、表面光滑(見圖1)。
[0008]阿南德氏鏈霉菌JXNU02菌株的生理生化特征:
阿南德氏鏈霉菌JXNU02能使淀粉水解、能產(chǎn)生硫化氫、能利用酪氨酸產(chǎn)生黑色素、能使明膠液化、能使硝酸鹽還原，不能分解纖維素、不能使牛奶胨化；能夠利用葡萄糖、蔗糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、棉子糖、肌醇和D-甘露醇，但不能利用L-鼠李糖；細(xì)胞壁類型屬于I型，全細(xì)胞水解液中含有核糖，未檢測(cè)出特征性糖。
[0009]對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液抑菌譜的測(cè)定。
[0010]采用瓊脂糖擴(kuò)散法對(duì)阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液抑菌譜進(jìn)行測(cè)定。采用的靶菌分別為鮮綠青霉、桔青霉、酵母菌、白假絲酵母、水稻稻瘟病菌、黑曲霉、毛霉、棉花枯萎病菌、尖孢鐮孢菌、水稻紋枯病菌、米根霉、核盤菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。結(jié)果表明，阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵原液對(duì)上述13種靶菌均有抑制作用。
[0011]阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液對(duì)鮮綠青霉菌絲生長(zhǎng)的影響
阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液能完全抑制鮮綠青霉的菌絲生長(zhǎng)，且抑制率達(dá)到100%，結(jié)果如圖2。
[0012]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明涉及的一株對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行分類鑒定，確定其為阿南德氏鏈霉菌JXNU02 (.Streptomyces anandii JXNU02);對(duì)阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液的抑菌譜進(jìn)行了研究，確定其對(duì)多種真菌及細(xì)菌均有抑制作用；對(duì)阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液對(duì)鮮綠青霉菌絲生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究，確定其發(fā)酵液抑制鮮綠青霉菌絲生長(zhǎng)，且抑制率達(dá)到100%。這些數(shù)據(jù)將為今后食品生物保鮮劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1阿南德氏鏈霉菌JXNU02菌絲及孢子形態(tài)(X10000)。
[0014]圖2阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液對(duì)鮮綠青霉菌絲生長(zhǎng)的影響(A為發(fā)酵液，B為空白對(duì)照)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明
實(shí)施例1從江西省南昌 市郊區(qū)采集的土樣，按照下述方法進(jìn)行分離、培養(yǎng)即可獲得阿南德氏鏈霉菌JXNU02，采用搖床液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法即可獲得對(duì)鮮綠青霉菌有抑制作用發(fā)酵液。
[0016](I)鏈霉菌的篩選、保藏
從江西省南昌市郊區(qū)采集的土樣，土樣自然風(fēng)干，研磨過篩，121°C干熱處理I h，稱取
2g 土壤于18 ml無菌生理水中,在150 r/min條件下振蕩15 min,再進(jìn)行梯度稀釋,將10_2、10_3 土壤懸液分別涂布于含75 mg/L K2Cr2O7高氏一號(hào)培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g，KNO3I g, NaCl 0.5 g，K2HPO4.3H20 0.5 g，MgSO4.7Η200.5 g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.01g，瓊脂粉 20g,蒸餾水I L，pH 7.4~7.6)平板上，28°〇培養(yǎng)7-14 d，挑取菌落形態(tài)不同的菌落于髙氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上分離純化，將純化培養(yǎng)物接種于高氏一號(hào)斜面，并于4°C保藏備用。
[0017]采用平板對(duì)峙法初篩拮抗放線菌，以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水I L)平板中心為原點(diǎn)，劃“十”，將直徑為5 mm放線菌菌塊放置于距平板中心2.5 cm處，28°C培養(yǎng)2 d后，再將直徑為5 mm的鮮綠青霉菌塊接種于平板中央，28°C培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果。
[0018]采用管碟法復(fù)篩拮抗放線菌，以鮮綠青霉為靶菌，能產(chǎn)生抑菌圈的菌株即為拮抗放線菌，并用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。
[0019](2)阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液的制備
阿南德氏鏈霉菌接種至髙氏一號(hào)平板上培養(yǎng)7 d后，取4塊直徑5 _放線菌菌餅置于種子培養(yǎng)基(蔗糖 22.5 g，黃豆餅粉 12.5 g，K2HPO4.3H20 0.2 g，NaCl I g, Na2SO4 0.1 g,FeSO4.7H20 0.01 g , CaCO3 2 g，蒸餾水 I L，pH 7.2)，裝液量 50 mL/ 250 mL 三角瓶，在200 r/min、28°C條件下培養(yǎng)48 h，即種子液。以6 % (v/v)的接種量于50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(可溶性淀粉10 g，黃豆餅粉15 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4.7H20 0.3 g，蒸餾水I L，pH 7.2),在200 r/min、28°C條件下培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液在10000 r/min條件下離心20 min,收集上清液，并采用0.22 Mffl濾膜過濾除菌，無菌發(fā)酵液置于4°C保藏備用。
[0020](3)阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液抗菌譜的測(cè)定
以適量無菌生理鹽水將靶菌的斜面活化培養(yǎng)物懸浮，得細(xì)胞懸浮液，控制細(xì)胞濃度為IXlO6 CFU/mL。取該菌懸浮液15 μ I加入到7 mL預(yù)冷至50°C左右的培養(yǎng)基中，充分混勻后，平鋪在倒有20 mL 2%的瓊脂底層平板(直徑15 mm)上。凝結(jié)后放置無菌牛津杯，再加入200 μ I發(fā)酵液，37°C培養(yǎng)24 h (細(xì)菌)或28°C培養(yǎng)48 h (真菌)，測(cè)抑菌圈直徑即抗生素的活性。
[0021](4)阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液對(duì)鮮綠青霉菌絲生長(zhǎng)的影響
分別量取I mL阿南德氏鏈霉菌JXNU02發(fā)酵液和生理鹽水(空白對(duì)照)，加入10 mL預(yù)冷至50°C左右的馬鈴薯葡 萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，充分混勻后，倒入培養(yǎng)皿中，再將直徑為5 mm的鮮綠青霉菌塊接種于平板中央，28°C培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果。
[0022]
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌，其特征在于，其命名為阿南德氏鏈霉菌JXNUO2 (.Streptomyces anandii JXNU02),該菌株已保存在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年11月18日，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013575。
2.如權(quán)利要求1所述的對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌菌株，其特征在于，其16SrRNA基因序列為:
3.如權(quán)利要求1所述的對(duì)鮮綠青霉有拮抗作用的鏈霉菌菌株，其特征在于，其用于鮮綠青霉的防治。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK103865837SQ201310712781
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】龍中兒, 李鹿鳴, 黃運(yùn)紅, 李素珍 申請(qǐng)人:江西師范大學(xué)