專利名稱：轉(zhuǎn)基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥用植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到在丹參中轉(zhuǎn)化金魚(yú)草Roseal基因提高迷迭香酸含量的方法。
背景技術(shù)：
丹參是我國(guó)常用大宗道地藥材，為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salviamiltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖,對(duì)心腦血管疾病、癌癥及各種炎癥具有顯著的臨床治療作用。隨著丹參有效成分及其藥理活性的深入研究，近年來(lái)以丹參為主要原料的藥品、制劑、化妝品和系列保健產(chǎn)品層出不窮，丹參資源供不應(yīng)求。伴隨著丹參藥材需求的日益擴(kuò)大和野生資源的逐漸減少，人工種植面積逐年增大。然而作為常異交植物，丹參種內(nèi)變異較大，性狀復(fù)雜。栽培丹參只種不選的狀況使得各產(chǎn)地丹參質(zhì)量參差不齊，品種退化嚴(yán)重，有效成分含量不穩(wěn)定，成為丹參作為高品質(zhì)植物藥大規(guī)模進(jìn)軍國(guó)際市場(chǎng)的最大障礙之一。因 此，提高丹參中有效成分的含量，尤其是迷迭香酸的含量，對(duì)培育優(yōu)異的丹參資源具有重要意義。為了提高品質(zhì)、滿足市場(chǎng)需求，近年來(lái)利用基因工程、細(xì)胞工程等現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)丹參進(jìn)行改良以提高其藥材有效成分的含量愈來(lái)愈受到人們的重視。在諸多方法之中，利用基因工程技術(shù)對(duì)藥用植物次生代謝途徑的遺傳特性進(jìn)行改造，提高藥用植物有效成分含量，培育能夠大量積累目標(biāo)次生代謝物的新品種，愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注。以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的現(xiàn)代分子育種技術(shù)在改良藥用植物、豐富中藥資源、提高抗病性和抗逆性、培育高天然藥物含量的新型轉(zhuǎn)基因藥材中有著誘人的應(yīng)用前景。但目前利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高丹參中丹參酚酸類成分的含量，特別是迷迭香酸含量的方法尚無(wú)報(bào)道。植物代謝途徑是由多種酶參與的多步反應(yīng)，受發(fā)育、環(huán)境等因素的影響，而對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行修飾有時(shí)難以奏效。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可調(diào)控植物次生代謝物合成途徑中多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，有效地激活或抑制整條代謝途徑，從而調(diào)節(jié)特定次生代謝物質(zhì)的合成與否以及積累量的多少。改變轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)往往可導(dǎo)致植物中該轉(zhuǎn)錄因子所控制性狀發(fā)生較大改變，因此，利用基因工程的方法調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子是具有應(yīng)用價(jià)值的植物遺傳操作手段。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)載體，將金魚(yú)草Roseal基因?qū)氲⒅?，提高丹參中迷迭香酸的含量，可以填補(bǔ)該領(lǐng)域研究的空白，因而該技術(shù)路線具有較強(qiáng)的創(chuàng)新性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述技術(shù)中的不足，提供一種提高丹參中迷迭香酸含量的新方法。解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案包括下述步驟I、金魚(yú)草Roseal基因的克隆提取金魚(yú)草總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，設(shè)計(jì)金魚(yú)草Roseal基因編碼框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制件酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基CAGGGTCACC,上游引物的序列為5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3'下游引物的序列為 5’-CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’，以金魚(yú)草cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，回收擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD19-T Simple載體用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，連接產(chǎn)物與大腸桿菌DH5a的體積比為I : 10，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100 μ L大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選所得陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)、測(cè)序驗(yàn)證得到所述基因的編碼序列如下
權(quán)利要求
1.ー種轉(zhuǎn)基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，其特征在于該方法包括下述步驟 (1)金魚(yú)草Roseal基因的克隆 提取金魚(yú)草總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，設(shè)計(jì)金魚(yú)草Roseal基因編碼框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制件酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿某CAGGGTCACC，卜.游引物的序列為5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3’，下游引物的序列為 5’ -CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’，以金魚(yú)草cDNA為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，回收擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD19-T Simple載體用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，連接產(chǎn)物與大腸桿菌DH5 α的體積比為I : 10，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100 μ L大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選所得陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)、測(cè)序驗(yàn)證得到所述基因的編碼序列如下atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa66^ (2)構(gòu)建含有金魚(yú)草Roseal基因的植物表達(dá)載體 用BglII和BstEII雙酶切含有金魚(yú)草Roseal基因的pMD 19-T Simple載體和pCAMBIA-1302植物表達(dá)載體，回收的酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物采用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取單克隆，進(jìn)行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)和提取質(zhì)粒酶切篩選陽(yáng)性克隆，得到含有金魚(yú)草Roseal基因的植物表達(dá)載體,該表達(dá)載體序列如核苷酸序列表<210>2 ； (3)制備含有金魚(yú)草Roseal基因的植物表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌菌株 將含有金魚(yú)草Roseal基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞，采用液氮凍融法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物于28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 36小吋，挑取抗性單菌落進(jìn)行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選，獲得含有金魚(yú)草Roseal基因植物表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌菌株； (4)制備轉(zhuǎn)基因丹參植株 采用常規(guī)組織培養(yǎng)方法獲得無(wú)菌丹參試管苗，根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系采用葉盤(pán)法，即將繼代培養(yǎng)15天的丹參無(wú)菌苗葉片切成小塊，轉(zhuǎn)入每IL培養(yǎng)基中含有IOmL濃度為I. Omg/mL的6-芐氨基腺嘌呤、ImL濃度為I. Omg/mL的a_萘こ酸的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)I天，用含有金魚(yú)草Roseal基因植物表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌菌株浸染預(yù)培養(yǎng)過(guò)的丹參葉片，浸染方法為28°C恒溫100轉(zhuǎn)/分鐘浸染25 30分鐘，浸染過(guò)的葉片置于每IL培養(yǎng)基中含有IOmL濃度為I. Omg/mL的6-芐氨基腺嘌呤、ImL濃度為I. Omg/mL的a_萘こ酸的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 3天至葉片邊緣有農(nóng)桿菌長(zhǎng)出，葉片從培養(yǎng)基上取出，轉(zhuǎn)接到每IL培養(yǎng)基中含有IOmL濃度為3mg/mL的潮霉素和IOmL濃度為200mg/mL的頭孢霉素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，長(zhǎng)出抗性芽后將其轉(zhuǎn)入到每IL培養(yǎng)基中含有IOmL濃度為3mg/mL的潮霉素和IOmL濃度為200mg/mL的頭孢霉素的1/2MS培養(yǎng)基上生根，獲得潮霉素抗性的再生丹參植株，用金魚(yú)草Roseal基因的特異性檢測(cè)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增再生丹參植株的DNA，波長(zhǎng)為302nm的紫外線下觀察到663bp目的條帶的陽(yáng)性株系即為轉(zhuǎn)基因丹參植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，其特征在于在構(gòu)建含有金魚(yú)草Roseal基因的植物表達(dá)載體步驟(2)中，所述的用BglII和BstEII雙酶切為取含有金魚(yú)草Roseal基因的pMD19_T Simple載體、IOXH Buffer、二次蒸懼水、限制性內(nèi)切酶BglII于37°C反應(yīng)I小時(shí)20分鐘，再加入限制性內(nèi)切酶BstEII，60°C反應(yīng)I小時(shí)，限制性內(nèi)切酶BglII與限制性內(nèi)切酶BstEII、含有金魚(yú)草Roseal基因的pMD19-TSimple載體、二次蒸餾水、IOXHBuffer的體積比為3 3 20 19 5 ； ?。?41^從-1302植物表達(dá)載體、10父!1 Buffer、二次蒸餾水、限制性內(nèi)切酶BglII于37°C反應(yīng)I小時(shí)20分鐘，再加入限制性內(nèi)切酶BstEII，60°C反應(yīng)I小時(shí)，限制性內(nèi)切酶BglII與限制性內(nèi)切酶BstEII、pCAMBIA-1302植物表達(dá)載體、二次蒸餾水、IOXH Buffer的體積比為3 3 20 19 :5。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，該方法包括金魚(yú)草Rosea1基因的克隆、構(gòu)建含有金魚(yú)草Rosea1基因的植物表達(dá)載體、制備含有金魚(yú)草Rosea1基因的植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株、制備轉(zhuǎn)基因丹參植株4個(gè)步驟。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因丹參中金魚(yú)草Rosea1基因的表達(dá)；對(duì)表達(dá)金魚(yú)草Rosea1基因的轉(zhuǎn)基因丹參中迷迭香酸含量進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，篩選得到迷迭香酸含量提高的轉(zhuǎn)基因丹參植株。采用本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因丹參植株，生長(zhǎng)90天的干燥根中，迷迭香酸的含量高達(dá)129.37±3.47mg/g，是非轉(zhuǎn)化普通丹參干燥根中迷迭香酸含量的2.16倍。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102827866SQ201210351718
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者王喆之, 陳玉芹, 宋銀, 姚偉, 王東浩 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)