專利名稱：一種鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法；這種方法不受季節(jié)、時間的限制，通過此方法獲得的植株后代變異小，為鹽膚木生態(tài)能源林的快速發(fā)展及分子遺傳改良提供了支持。
背景技術(shù)：
鹽膚木為漆樹科鹽膚木屬落葉小喬木，是一種廣泛分布的重要木本能源植物，也是我國主要經(jīng)濟樹種，其種子含油率高達25%，不飽和脂肪酸含量達90%，相當(dāng)于油茶中的含量，其中亞油酸含量在70. 4%-75. 3%，遠高于油茶中的含量，作為高級食用油具有很高的保健價值。同時鹽膚木具有很高的藥用價值，根、莖、葉均可入藥，且寄生在其葉片上的蚜蟲蟲癭所形成的五倍子是重要的中藥材和工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、印染冶金等行 業(yè)，是我國重要林特產(chǎn)品，已成為世界各國研究的重點。隨著五倍子需求量的不斷增大，擴建鹽膚木林、提高五倍子產(chǎn)量、質(zhì)量、培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的鹽膚木品種已成為一種必然趨勢。播種移栽育苗是目前鹽膚木的主要育苗方法，由于鹽膚木屬深休眠類型，必須進行低溫沙藏和脫蠟處理等，出苗后還需移栽，過程繁瑣，費時費力，且播種受時間的限制；再者種子是榨取食用油和提取各種次生代謝物的部位，利用種子發(fā)芽不僅浪費、繁殖效率較低，而且對一些優(yōu)良種質(zhì)無法進行快速繁殖和推廣，遠不能滿足對種苗的需求及鹽膚木產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展；另外，由于沒有一個高效穩(wěn)定的再生體系，使得鹽膚木在分子遺傳改良方面的研究處于一片空白。因此，急需開發(fā)一種鹽膚木高效再生的方法，以滿足當(dāng)前鹽膚木種苗快速繁殖和品種改良的需要。迄今為止尚未見國內(nèi)外有涉及鹽膚木離體培養(yǎng)的報道，更未見有通過不定芽誘導(dǎo)的高頻率鹽膚木植株再生技術(shù)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明運用生物技術(shù)手段，提供一種鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法，從而建立一種高效穩(wěn)定、快速的鹽膚木叢生芽再生方法。為了實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法，其特征在于首先取成熟鹽膚木種子經(jīng)表面消毒后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，經(jīng)過1-2周培養(yǎng)，長出完整的鹽膚木植株；在無菌條件下，獲得鹽膚木子葉、子葉節(jié)及下胚軸節(jié)段，將它們分別接種于子葉、子葉節(jié)和下胚軸不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25-30d后獲得嫩綠色不定芽叢；將嫩綠色不定芽叢移入相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，生長15-20d后，長出2-3cm高的完全展開2-4片真葉的健壯幼苗；再將幼苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，25-30d長成根系發(fā)達的健壯試管植株，最后進行開蓋煉苗后移栽，獲得健壯的鹽膚木再生苗。所述的表面消毒是指種子用98%的濃硫酸處理30min后用75%的乙醇表面消毒Imin,之后用O. I %的升萊消毒3min,最后用無菌水沖洗5遍,消毒期間不停地搖動。所述的子葉不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0. 5-8. Omg/L 6-BA或O. 1-3. Omg/L TDZ+ O. o-l. Omg/L IBA+30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂；所述的子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0. 05-3. O mg/L TDZ+0. 0-0. 5mg/L IBA+30g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂；所述的下胚軸不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0. 25-8. Omg/L 6-BA 或0. 05-3. 0 mg/L TDZ+0. 0-1. Omg/L IBA+30g/L蔗糖+7. 5g/L 瓊脂。所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5-2. Omg/L IBA+30g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂。本發(fā)明有益效果在于
1、鹽膚木播種移栽育苗過程繁瑣，費時費力且受季節(jié)限制，不能滿足鹽膚木經(jīng)濟林建設(shè)的需求，嚴(yán)重制約著再生能源產(chǎn)業(yè)和以五倍子為代表的藥用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，目前有關(guān)鹽膚木叢生芽高效再生的方法尚未見報道，鹽膚木叢生芽高效再生技術(shù)將為我國主要經(jīng)濟樹種鹽膚木的快速繁殖和分子遺傳改良提供重要的技術(shù)支持，以打破有關(guān)該研究目前尚屬空白的局面；
2、本發(fā)明證實進行鹽膚木種苗的快繁可以不必通過種子育苗法和根壓法，從而節(jié)約了時間，解除了時間限制而且繁殖效率大大提高，可以快速為鹽膚木經(jīng)濟林的建設(shè)提供充足的種苗；同時，這種高效的再生方法為鹽膚木的分子改良特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了很好的基礎(chǔ)。


圖I為完整種子苗。圖2為子葉、子葉節(jié)和下胚軸不定芽叢，其中(a)為子葉不定芽叢，(b)為子葉節(jié)不定芽叢，(C)為下胚軸不定芽叢。圖3為叢生芽生根及獲得的健壯植株苗,其中(a)為叢生芽生根，(b)為健壯植株苗。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
實施例一種鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法具體操作如下
1、種子首先用98%的濃硫酸處理30min后用75%的乙醇表面消毒lmin，之后用O.1%的升汞消毒3min，最后用無菌水沖洗5遍，消毒期間不停的搖動；
2、將消毒好的種子放在萌發(fā)培養(yǎng)基上進行生長，經(jīng)過1-2周左右的培養(yǎng)，形成2片子葉完全展開，3-5cm左右長的下胚軸的完整種子苗(圖I);種子苗的子葉、子葉節(jié)、下胚軸均作為本發(fā)明中誘導(dǎo)不定芽的外植體材料；
3、獲得的無菌鹽膚木子葉、子葉節(jié)及下胚軸接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30d后即獲得嫩綠不定芽叢(圖2)，誘導(dǎo)率可達95%。子葉誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基為MS+0. 5-8. Omg/L 6-BA或 O. 1-3. Omg/L TDZ + O. 0-1. Omg/L IBA+30g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂；子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0. 05-3. O mg/L TDZ+0. 0-0. 5mg/L IBA+30g/L 蔗糖 +7. 5g/ 瓊脂 L ;下胚軸不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0. 25-8. Omg/L 6-BA 或 O. 05-3. Omg/L TDZ+0. 0-1. Omg/L IBA+30g/L 蔗糖+7. 5g/L 瓊脂；4、將獲得的具有2-3cm高的健壯幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，在光照下培養(yǎng)生長25-30d，即可獲得根系發(fā)達的再生植株苗(圖3)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+0. 5-2. Omg/L IBA+30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂；最后開蓋煉苗移栽，獲得健壯的再生苗?！ぁ?br> 權(quán)利要求
1.一種鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法，其特征在于首先取成熟鹽膚木種子經(jīng)表面消毒后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，經(jīng)過1-2周培養(yǎng)，長出完整的鹽膚木植株；在無菌條件下，獲得鹽膚木子葉、子葉節(jié)及下胚軸節(jié)段，將它們分別接種于子葉、子葉節(jié)和下胚軸不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25-30d后獲得嫩綠色不定芽叢；將嫩綠色不定芽叢移入相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，生長15-20d后，長出2-3cm高的完全展開2_4片真葉的健壯幼苗；再將幼苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，25-30d長成根系發(fā)達的健壯試管植株，最后進行開蓋煉苗后移栽，獲得健壯的鹽膚木再生苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法，其特征在于所述的表面消毒是指種子用98%的濃硫酸處理30min后用75%的乙醇表面消毒lmin，之后用O.I %的升汞消毒3min，最后用無菌水沖洗5遍,消毒期間不停地搖動。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法，其特征在于所述的子葉不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0. 5-8. Omg/L 6-BA 或 O. 1-3. Omg/L TDZ + 0. 0-1. Omg/L IBA+30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂；所述的子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0. 05-3. O mg/L TDZ+0. 0-0. 5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂；所述的下胚軸不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0. 25-8. Omg/L 6-BA 或 O. 05-3. O mg/L TDZ+ O. 0-1. Omg/L IBA+30g/L 蔗糖+7. 5g/L 瓊脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基為l/2MS+0. 5-2. 0mg/L IBA+30g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂。
全文摘要
本發(fā)明公開一種鹽膚木不定芽高頻率植株再生的方法，此方法再生效率高，繁殖速度快，平均出芽率較高，最高可達95%；獲得的芽苗生根率較好，平均每株產(chǎn)生4-8條左右的健壯根系。本發(fā)明證實進行鹽膚木種苗的快繁可以不必通過種子育苗法和根壓法，從而節(jié)約了時間，解除了時間限制而且繁殖效率大大提高，可以快速為鹽膚木經(jīng)濟林的建設(shè)提供充足的種苗；同時，這種高效的再生方法為鹽膚木的分子改良特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供了很好的基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK102893864SQ20121034962
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者吳麗芳, 侯金艷, 李明浩, 毛穎基 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院