專(zhuān)利名稱(chēng)：一種堆肥發(fā)酵濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)多樣性的防控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種的應(yīng)用。更具體的說(shuō)是一種堆肥發(fā)酵濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)多樣性的防控方法。
背景技術(shù)：
堆肥化(Composting)是指在有控制的條件下，使有機(jī)廢棄物在微生物(主要為細(xì)菌)作用下，發(fā)生降解，并同時(shí)使有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)方向轉(zhuǎn)化的過(guò)程。堆肥化后的產(chǎn)物稱(chēng)之為堆肥(Compost)。堆肥過(guò)程可以將混合物的體積有效地減少40%-50%，并且可以依靠在高溫階段中代謝產(chǎn)生的熱量殺死垃圾中的病原物質(zhì)。堆肥不是一項(xiàng)新的技術(shù)，但用這種方法處理城市固體垃圾，符合環(huán)境的利益，因?yàn)樵诙逊蔬^(guò)程中清除或者減少了城市固體垃圾中的毒性并使得最終的產(chǎn)物可以被用來(lái)進(jìn)行再利用。堆肥的程序包括原料的預(yù)處理、原料發(fā)酵和后處理，堆肥過(guò)程受水分、氧含量、C/N比、溫度、pH和通風(fēng)情況等因素的影響。微生物種類(lèi)繁多，自然界中僅有極少數(shù)的微生物得到鑒定，能夠存活、培養(yǎng)的種類(lèi)更是少之又少，至多為微生物總量的1%。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于堆肥中的微生物進(jìn)行了一系列理論和實(shí)踐的研究。對(duì)于應(yīng)用堆肥可能出現(xiàn)的環(huán)境問(wèn)題也已經(jīng)引起了人們的重視，但如何解決這些問(wèn)題還缺少細(xì)致深入的研究，目前，如何提高城市生活垃圾堆肥的質(zhì)量，解決堆肥應(yīng)用過(guò)程中可能產(chǎn)生的環(huán)境問(wèn)題一直是相關(guān)科研人員研究關(guān)注的熱點(diǎn)。對(duì)于堆肥中的微生物組成及堆肥過(guò)程中的微生物變化的研究已有諸多報(bào)道，但對(duì)于將堆肥中微生物分離、應(yīng)用于其他基質(zhì)的研究卻少有報(bào)道。蘇云金芽孢桿菌是目前國(guó)際上生產(chǎn)量最大并成功地用于防治農(nóng)、林、貯糧害蟲(chóng)和一些衛(wèi)生害蟲(chóng)的微生物殺蟲(chóng)劑，蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的同時(shí)，可以形成一種由殺蟲(chóng)晶體蛋白組成的伴孢晶體，它的主要?dú)⑾x(chóng)活性成分是伴孢晶體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白對(duì)多種農(nóng)林害蟲(chóng)具有特異性殺傷作用。昆蟲(chóng)取食芽孢晶體混合物后，晶體在昆蟲(chóng)體內(nèi)的中腸堿性環(huán)境和蛋白酶的作用下被降解形成殺蟲(chóng)活性蛋白，研究結(jié)果表明這些毒蛋白單獨(dú)作用或不同蛋白間協(xié)同作用對(duì)昆蟲(chóng)具有不同程度的毒殺作用，進(jìn)一步加強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌在防治和控制害蟲(chóng)危害方面的研究，對(duì)于保護(hù)人類(lèi)生存環(huán)境實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是目前產(chǎn)量最大、使用最廣的生物殺蟲(chóng)劑。 關(guān)于采用蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵濾液用來(lái)調(diào)節(jié)草坪基質(zhì)線(xiàn)蟲(chóng)的方法尚為見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。線(xiàn)蟲(chóng)是一類(lèi)世界性分布的重要植物病原物，其寄生范圍廣，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，幾乎每種作物都受到線(xiàn)蟲(chóng)的侵害。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，利用殺線(xiàn)蟲(chóng)微生物開(kāi)發(fā)生物殺線(xiàn)蟲(chóng)劑，具有十分巨大的經(jīng)濟(jì)效益與環(huán)境效益。目前國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道說(shuō)明不同的微生物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的活動(dòng)有抑制作用。黃福常等研究發(fā)現(xiàn)不同濃度，不同PH值的黑曲霉發(fā)酵濾液均具有殺線(xiàn)作用，其中以發(fā)酵原液PH為3. O時(shí)殺線(xiàn)效果最佳，其殺線(xiàn)作用為100%。Neidig等研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物對(duì)食細(xì)菌類(lèi)線(xiàn)蟲(chóng)有強(qiáng)烈的抑制作用，從而減少土壤中細(xì)菌的天敵數(shù)量。徐華潮等(2010)在室內(nèi)條件下測(cè)定了 17株蘇云金芽孢桿菌伴胞晶體蛋白對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)的殺線(xiàn)活性，發(fā)現(xiàn)菌株020、RBT-200701的伴胞晶體蛋白對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)有明顯的毒殺作用，其校正死亡率分別大于80%和70%。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向草坪土壤基質(zhì)中加入蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)濾液，研究了不同堆肥微生物過(guò)濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)的影響，為土壤線(xiàn)蟲(chóng)的生物防治提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用的蘇云金芽孢桿菌(拉丁名feci77w5·菌種保藏號(hào)CFCC10206，保藏單位中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，對(duì)外可以提供。生理生化特性細(xì)胞呈革蘭氏陽(yáng)性，桿狀，大小為I. 0-1. 2X3-5 μ m。形成半孢晶體，對(duì)阿拉伯糖甘露醇不產(chǎn)酸產(chǎn)淀粉酶，硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。蘇云金芽孢桿菌毒性對(duì)人、畜低毒，大鼠口服急性L(fǎng)D5tl 852. 7-856. 7毫克/公斤， 對(duì)家禽、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)、畜等低毒。本發(fā)明將配制成不同濃度的蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵濾液接種到草坪建植體系中。通過(guò)研究不同濃度的蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)的防治方法，為草坪植物的建植提供依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案
一種堆肥發(fā)酵濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)多樣性防控方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行
(I)蘇云金芽孢桿菌的分離蘇云金芽孢桿菌本身有市售；也可以分離自天津小淀垃圾堆肥處理廠(chǎng)的生活垃圾堆肥；本發(fā)明從生活垃圾堆肥所得到的蘇云金芽孢桿菌生理生化性質(zhì)與市售的蘇云金芽孢桿菌相同，分離的方法如下
1)將新鮮堆肥樣品稱(chēng)取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無(wú)菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基上，每一稀釋度重復(fù)三次，無(wú)菌水為空白對(duì)照；用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天；
2)蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液的制備
A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養(yǎng)2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)；選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的OD值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)；根據(jù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)獲得微生物生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的時(shí)間，取穩(wěn)定期的菌種采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每mL菌液中的活菌數(shù)；
B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)8 12 h至穩(wěn)定期，取穩(wěn)定期的菌種采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每 mL菌液中的活菌數(shù)，將穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行抽濾，抽濾后將菌液通過(guò)孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過(guò)濾液則為微生物發(fā)酵后的過(guò)濾液；其中蘇云金芽孢桿菌的菌落數(shù)(個(gè))
權(quán)利要求
1.一種堆肥發(fā)酵濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)多樣性的防控方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行(I)蘇云金芽孢桿菌的分離1)將新鮮堆肥樣品稱(chēng)取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無(wú)菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基上，每一稀釋度重復(fù)三次，無(wú)菌水為空白對(duì)照；用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天；2)蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液的制備A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養(yǎng)2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行比濁測(cè)定，以菌懸液的OD值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，根據(jù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)獲得蘇云金芽孢桿菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的時(shí)間；B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)8 12 h至穩(wěn)定期，取穩(wěn)定期的菌種采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每 mL菌液中的活菌數(shù)，將穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行抽濾，抽濾后將菌液通過(guò)孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過(guò)濾液則為微生物發(fā)酵后的過(guò)濾液；3)稀釋蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液取一部分過(guò)濾液分別稀釋至4倍濾液和8倍濾液，備用；4)堆肥發(fā)酵濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)防控以高14cm直徑20cm塑料花盆為容器構(gòu)建草坪建植體系，每個(gè)花盆中分別加入2kg草坪土壤,播種飽滿(mǎn)的高羊茅草種3g，待草坪植物生長(zhǎng)5cm時(shí)，分別向花盆中加入IOml蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液，草坪培植75d后，分離鑒定各處理線(xiàn)蟲(chóng)的種類(lèi)及數(shù)量，分析線(xiàn)蟲(chóng)多樣性特征；其中的純化培養(yǎng)2代培養(yǎng)指的是用接菌環(huán)直接挑起待純化的菌落，接種到事先準(zhǔn)備好的高氏一號(hào)平板固體培養(yǎng)基中，在平板上自左向右輕輕劃線(xiàn)，將培養(yǎng)皿倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天，此過(guò)程為純化一代，從純化一代的菌種中挑取菌落再重復(fù)此過(guò)程為純化二代。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種堆肥發(fā)酵濾液對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)防控的方法，它是在直徑為6.5cm的培養(yǎng)皿中加入30g草坪土壤，分別向土中加入150μl不同濃度的含有蘇云金芽孢桿菌的堆肥微生物發(fā)酵濾液，對(duì)照組加入無(wú)菌液體培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻的撒入50粒飽滿(mǎn)的高羊茅種子，室溫種植，待種子萌發(fā)后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明向草坪土壤基質(zhì)中加入蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液不僅可以抑制土壤線(xiàn)蟲(chóng)的總量，抑制植物寄生類(lèi)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)，改變土壤線(xiàn)蟲(chóng)的群落組成，同時(shí)可以增強(qiáng)草坪植物的抗逆性，促進(jìn)草坪植物的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102599195SQ20121005198
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者多立安, 程田, 趙樹(shù)蘭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)