專利名稱：一種堆肥發(fā)酵液提高高羊茅抗Cr和Cd能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種的應(yīng)用。更具體的說是一種采用蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液提高高羊茅對(duì)Cr和Cd抗性的方法。
背景技術(shù)：
堆肥化(Composting)是指在有控制的條件下，使有機(jī)廢棄物在微生物(主要為細(xì)菌)作用下，發(fā)生降解，并同時(shí)使有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)方向轉(zhuǎn)化的過程。堆肥化后的產(chǎn)物稱之為堆肥(Compost)。堆肥過程可以將混合物的體積有效地減少40%-50%，并且可以依靠在高溫階段中代謝產(chǎn)生的熱量殺死垃圾中的病原物質(zhì)。堆肥不是一項(xiàng)新的技術(shù)，但用這種方法處理城市固體垃圾，符合環(huán)境的利益，因?yàn)樵诙逊蔬^程中清除或者減少了城市固體垃圾中的毒性并使得最終的產(chǎn)物可以被用來進(jìn)行再利用。堆肥的程序包括原料的預(yù)處理、原料發(fā)酵和后處理，堆肥過程受水分、氧含量、C/N比、溫度、pH和通風(fēng)情況等因素的影響。堆肥化過程的實(shí)質(zhì)是微生物在適宜條件下的代謝作用，在堆肥化過程中，生活垃圾中的可溶解有機(jī)物質(zhì)透過微生物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜而被微生物所吸收，而微生物通過自身的生命活動(dòng)過程，把吸收的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成無機(jī)物。微生物在堆肥過程中扮演著重要角色， 與堆肥周期和堆肥質(zhì)量密切相關(guān)。因此，堆肥中微生物的研究對(duì)開發(fā)堆肥微生物資源，加速堆肥過程，減短堆肥周期，提高堆肥質(zhì)量都具有重要的意義。微生物種類繁多，自然界中僅有極少數(shù)的微生物得到鑒定，能夠存活、培養(yǎng)的種類更是少之又少，至多為微生物總量的1%。目前，國內(nèi)外對(duì)于堆肥中的微生物進(jìn)行了一系列理論和實(shí)踐的研究。對(duì)于應(yīng)用堆肥可能出現(xiàn)的環(huán)境問題也已經(jīng)引起了人們的重視，但如何解決這些問題還缺少細(xì)致深入的研究，目前，如何提高城市生活垃圾堆肥的質(zhì)量，解決堆肥應(yīng)用過程中可能產(chǎn)生的環(huán)境問題一直是相關(guān)科研人員研究關(guān)注的熱點(diǎn)。對(duì)于堆肥中的微生物組成及堆肥過程中的微生物變化的研究已有諸多報(bào)道，但對(duì)于將堆肥中微生物分離、應(yīng)用于其他基質(zhì)的研究卻少有報(bào)道。將生活垃圾堆肥用作草坪基質(zhì)，不但可以避開食物鏈，同時(shí)又解決了垃圾的出路問題。但垃圾堆肥中含有重金屬等物質(zhì)可能對(duì)環(huán)境造成不利的影響，這一直是堆肥應(yīng)用中的重要問題，從垃圾堆肥中分離和提取有益的微生物菌種，配制成不同的微生物菌劑接種到草坪建植體系中，既可以提高堆肥的利用效率，同時(shí)又解決了堆肥重金屬等可能構(gòu)成的環(huán)境威脅，體現(xiàn)生物制劑的優(yōu)越性，符合可持續(xù)發(fā)展的要求，通過研究不同的堆肥微生物菌劑對(duì)草坪植物抗重金屬能力的影響，目的是為了篩選適合的微生物菌劑，提高草坪植物的質(zhì)量和抗逆性，改善草坪土壤基質(zhì)的質(zhì)量提供理論依據(jù)。蘇云金芽孢桿菌是目前國際上生產(chǎn)量最大并成功地用于防治農(nóng)、林、貯糧害蟲和一些衛(wèi)生害蟲的微生物殺蟲劑，蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的同時(shí)，可以形成一種由殺蟲晶體蛋白組成的伴孢晶體，它的主要?dú)⑾x活性成分是伴孢晶體蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白對(duì)多種農(nóng)林害蟲具有特異性殺傷作用。昆蟲取食芽孢晶體混合物后，晶體在昆蟲體內(nèi)的中腸堿性環(huán)境和蛋白酶的作用下被降解形成殺蟲活性蛋白，研究結(jié)果表明這些毒蛋白單獨(dú)作用或不同蛋白間協(xié)同作用對(duì)昆蟲具有不同程度的毒殺作用，進(jìn)一步加強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌在防治和控制害蟲危害方面的研究，對(duì)于保護(hù)人類生存環(huán)境實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是目前產(chǎn)量最大、使用最廣的生物殺蟲劑。 關(guān)于采用蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵濾液用來提高高羊茅對(duì)Cr和Cd抗性能力的方法尚為見文獻(xiàn)報(bào)道。土壤重金屬污染問題一直是影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，危害人體健康的嚴(yán)重環(huán)境問題，利用微生物的生物活性對(duì)重金屬的親和吸附或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為低毒產(chǎn)物，從而降低重金屬污染程度，是生物修復(fù)重金屬污染的重要途徑。微生物在生長過程中能夠分泌有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，具有溶解重金屬和含重金屬的礦物的能力。本研究將外源重金屬溶液加入到含有不同堆肥微生物菌劑的草坪土壤基質(zhì)中，探討不同堆肥微生物對(duì)緩解外源重金屬對(duì)草坪植物的不良影響，為利用微生物吸附重金屬離子，降低重金屬對(duì)草坪植物的損害提供參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用的蘇云金芽孢桿菌(拉丁名feci77w5· thuringiensis)菌種保藏號(hào)CFCC10206，保藏單位中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，對(duì)外可以提供。生理生化特性細(xì)胞呈革蘭氏陽性，桿狀，大小為I. 0-1. 2X3-5 μ m。形成半孢晶體，對(duì)阿拉伯糖甘露醇不產(chǎn)酸產(chǎn)淀粉酶，硝酸鹽還原到亞硝酸鹽。蘇云金芽孢桿菌毒性對(duì)人、畜低毒，大鼠口服急性LD5tl 852. 7-856. 7毫克/公斤， 對(duì)家禽、鳥類、魚、畜等低毒。本發(fā)明將配制成不同濃度的蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵濾液接種到草坪建植體系中。通過研究堆肥發(fā)酵液提高高羊茅對(duì)Cr和Cd抗性能力的方法，為草坪植物的建植提供依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案
一種堆肥發(fā)酵液提高高羊茅抗Cr和Cd能力的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行 (I)蘇云金芽孢桿菌的分離蘇云金芽孢桿菌本身有市售；也可以分離自天津小淀垃圾堆肥處理廠的生活垃圾堆肥；本發(fā)明從生活垃圾堆肥所得到的蘇云金芽孢桿菌生理生化性質(zhì)與市售的蘇云金芽孢桿菌相同，分離的方法如下
1)將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基上，每一稀釋度重復(fù)三次，無菌水為空白對(duì)照；用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天；
2)蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液的制備
A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養(yǎng)2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)；選用600nm波長進(jìn)行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長曲線；根據(jù)生長曲線獲得微生物生長至穩(wěn)定期的時(shí)間，取穩(wěn)定期的菌種采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每mL菌液中的活菌數(shù)；B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)8 12 h至穩(wěn)定期，取穩(wěn)定期的菌種采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每 mL菌液中的活菌數(shù)，將穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行抽濾，抽濾后將菌液通過孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過濾液則為微生物發(fā)酵后的過濾液；其中蘇云金芽孢桿菌的菌落數(shù)(個(gè))
權(quán)利要求
1.一種堆肥發(fā)酵液提高高羊茅抗Cr和Cd能力的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)(1)蘇云金芽孢桿菌的分離1)將新鮮堆肥樣品稱取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml無菌水三角瓶中，振蕩，使樣品中的微生物充分且均勻分布于液體中，用移液槍在三角瓶中取Iml母液，加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，此為10—1濃度的稀釋溶液，按此方法分別稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、 10_5、10_6幾種濃度的堆肥稀釋液；分別用移液槍吸取O. I毫升濃度為10_2、10_3、10_4、10_5、 10_6稀釋液，注入到牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基上，每一稀釋度重復(fù)三次，無菌水為空白對(duì)照；用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻涂抹在整牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，使微生物均勻分布，將含有牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天；2)蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液的制備A.將分離出的蘇云金芽孢桿菌菌種純化培養(yǎng)2代；然后接入裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)，選用600nm波長進(jìn)行比濁測定，以菌懸液的OD值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長曲線，根據(jù)生長曲線獲得蘇云金芽孢桿菌生長至穩(wěn)定期的時(shí)間；B.取純化蘇云金芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，180 r/min37°C培養(yǎng)8 12 h至穩(wěn)定期，取穩(wěn)定期的菌種采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算每 mL菌液中的活菌數(shù)，將穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行抽濾，抽濾后將菌液通過孔徑為O. 22um的微孔濾膜，獲得的過濾液則為微生物發(fā)酵后的過濾液；3)稀釋蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液取一部分過濾液分別稀釋至4倍濾液和8倍濾液，備用；4)堆肥發(fā)酵液提高高羊茅抗Cr和Cd能力的方法將直徑為7cm的一次性塑料杯的杯身用報(bào)紙包住避光，向每個(gè)塑料杯中加入250g 土壤，播種高羊茅草種O. Sg,實(shí)驗(yàn)為3次重復(fù)；待草坪植物生長5cm時(shí)，向土中加入Iml發(fā)酵濾液，未避免液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)干擾，對(duì)照組采用無菌液體培養(yǎng)基(蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)基均為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，顧設(shè)對(duì)照分別比較)，室溫種植，草坪培植60天后，測定草坪草的生長指標(biāo)地上生物量，地下生物量，株高，葉綠素，草坪植物重金屬含量；其中的純化培養(yǎng)2代培養(yǎng)指的是用接菌環(huán)直接挑起待純化的菌落，接種到事先準(zhǔn)備好的高氏一號(hào)平板固體培養(yǎng)基中，在平板上自左向右輕輕劃線，將培養(yǎng)皿倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I天，此過程為純化一代，從純化一代的菌種中挑取菌落再重復(fù)此過程為純化二代。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種堆肥發(fā)酵液提高高羊茅抗Cr和Cd能力的方法，它是在直徑為7cm的一次性塑料杯中加入200g烘干土壤，播種高羊茅種子0.8g，待播種10d后，分別向草坪植物上加入菌劑，加菌劑生長5d后，向土壤中分別加入氯化鎘和重鉻酸鉀溶液，實(shí)驗(yàn)為3次重復(fù)，共60個(gè)樣品，室內(nèi)適溫繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間每天定量給水，保證各個(gè)處理間環(huán)境一致，待其生長30天后測定各項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加入蘇云金芽孢桿菌菌劑后高羊茅的地下干重和根冠比與對(duì)照相比分別提高了137.5%、102.9%，促進(jìn)草坪植物的生長；高羊茅耐Cr和Cd能力明顯增加。
文檔編號(hào)A01G7/00GK102598978SQ20121005198
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月2日
發(fā)明者多立安, 程田, 趙樹蘭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)