專(zhuān)利名稱(chēng)：一種植物原位再生的方法及其在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一種植物細(xì)胞原位器官再生結(jié)合農(nóng)桿菌侵染的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
植物離體器官再生(organ regeneration)是在細(xì)胞全能性的理論基礎(chǔ)上建立的， 是把植物的器官、組織以至單個(gè)細(xì)胞，在人工控制的無(wú)菌條件下培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)、分化成完整植株的過(guò)程。這種組培技術(shù)經(jīng)過(guò)上百年的完善與發(fā)展，已實(shí)現(xiàn)了上千種植物的培養(yǎng)，在植物無(wú)性系的快速繁殖、無(wú)病毒種苗培育、新品種的選育、人工種子和種質(zhì)保存、藥用植物和次生物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)等方面已廣泛應(yīng)用。在植物基因工程研究領(lǐng)域，植物離體器官再生也是一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。植物基因工程需要將目的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法等操作完成，但無(wú)論哪一種方法，都主要依靠轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生，即組織培養(yǎng)過(guò)程獲得轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)合組培的遺傳轉(zhuǎn)化途徑有很多優(yōu)點(diǎn)，如重復(fù)性較好，基本不受季節(jié)限制，適應(yīng)性較廣， 轉(zhuǎn)化率較高等。但是這種轉(zhuǎn)化途徑也有其局限性，主要是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生受基因型的影響較大，同一物種的某些基因型易于組培，而另外一些基因型很難組培成功。況且有些物種， 目前還難于進(jìn)行組織培養(yǎng)。因此植物再生體系是限制植物遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用的瓶頸。解決這一植物遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)展的瓶頸，可以有兩個(gè)途徑。一個(gè)途徑是進(jìn)行大量的正交試驗(yàn),逐一物種摸索組培條件。但由于組培再生涉及培養(yǎng)基的種類(lèi)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度、溫度、光照等多種復(fù)雜條件，即使是大豆這樣重要的經(jīng)濟(jì)作物，經(jīng)過(guò)多年的探索仍是世界公認(rèn)的組培難，因此這個(gè)途徑短時(shí)間內(nèi)很難有所突破。另一個(gè)途徑就是開(kāi)發(fā)全新的植物再生體系，使植物再生不再依賴組織培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種植物原位再生的方法及其在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，采用農(nóng)桿菌原位轉(zhuǎn)化植物，避免了細(xì)胞再生的組培過(guò)程，應(yīng)用本方法可以快速建立各種植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明提供的植物原位再生的方法，其特征是
A、接穗的獲得
選取發(fā)育飽滿無(wú)病害的遼園多麗番茄種子，作消毒無(wú)菌處理；接種于MS培養(yǎng)基中，于 25°C光照培養(yǎng)箱中日光照16h，培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗；
取子葉完全展開(kāi)、但真葉還未萌發(fā)的無(wú)菌苗，將子葉、下胚軸切小段作為外植體，置于含有l(wèi)mg/L玉米素的MS培養(yǎng)基上，于25°C光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)愈傷組織；獲得新鮮愈傷組織作為接穗；B、嫁接
取長(zhǎng)有5-10片葉子的健壯遼園多麗番茄或盆栽番茄作為砧木，在砧木頂芽下方橫切去頭，再垂直向下切口。將用作接穗的新鮮愈傷切成楔形，插入砧木切口中嫁接；
C、砧木原位再生
嫁接后，愈傷組織接穗誘導(dǎo)砧木傷口產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)再生芽。本發(fā)明提供的植物原位再生的方法在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，特征是
A、接穗的獲得
選取發(fā)育飽滿無(wú)病害的遼園多麗番茄種子，作消毒無(wú)菌處理；接種于MS培養(yǎng)基中，于 25°C光照培養(yǎng)箱中日光照16h，培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗；
取子葉完全展開(kāi)、但真葉還未萌發(fā)的無(wú)菌苗，將子葉、下胚軸切小段作為外植體，置于含有l(wèi)mg/L玉米素的MS培養(yǎng)基上，于25°C光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)愈傷組織；獲得新鮮愈傷組織作為接穗；
B、農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備
將農(nóng)桿菌在含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)72小時(shí)；在平板上挑取單克隆，接種到含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素2ml液體YEB培養(yǎng)基，28°C，250rpm培養(yǎng)l_2d直至0D600為O. 6 ;按照1:100的稀釋比例將上述少量培養(yǎng)液繼續(xù)擴(kuò)繁培養(yǎng)到0D600為O. 5 ;
C、農(nóng)桿菌侵染
取長(zhǎng)有5-10片葉子的健壯遼園多麗番茄或盆栽番茄作為砧木，在砧木頂芽下方橫切去頭，再垂直向下切口，在傷口上涂抹農(nóng)桿菌菌液，進(jìn)行植物侵染；
D、嫁接
將接穗的新鮮愈傷切成楔形，插入侵染過(guò)的砧木中嫁接，誘導(dǎo)砧木傷口產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)再生芽；
E、轉(zhuǎn)化的砧木原位再生
嫁接后，愈傷組織接穗誘導(dǎo)侵染過(guò)的砧木傷口產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)再生芽。上述農(nóng)桿菌為EHA105、LBA4404、EHA101、KYRT1、GV3101 或 G58，優(yōu)選 EHA105 ;包含的質(zhì)粒為PBI121，PBI121的左右邊界內(nèi)含有卡那霉素抗性基因NPT II。本發(fā)明提供的一種植物原位再生的方法在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征是用于原位再生植物包括番茄、大豆、棉花、桑樹(shù)、花生、向日葵、番薯、馬鈴薯、蘋(píng)果、煙草、薄荷、油菜、黃瓜和擬南芥。本發(fā)明的積極效果通過(guò)非組培的方法，實(shí)現(xiàn)了植物的原位再生，并使之與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了植物的遺傳轉(zhuǎn)化，避免了傳統(tǒng)組培方法的繁瑣組培條件，為實(shí)現(xiàn)各種植物快速、工廠化的再生與轉(zhuǎn)化提供了一條捷徑。


圖I為番茄遼園多麗外植體誘導(dǎo)的愈傷組織。圖2為愈傷組織接穗嫁接于番茄砧木。圖3為遼園多麗砧木傷口生長(zhǎng)愈傷組織。圖4為遼園多麗砧木傷口的再生芽。
4
圖5為盆栽番爺站'木傷口的再生芽。圖6為部分再生芽的PCR檢測(cè)結(jié)果。圖7為部分再生芽的southern blot結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :植物原位再生的方法步驟I、接穗的獲得
選取番爺品種遼園多麗(Solanum lycopersicum L,購(gòu)自遼寧園藝種苗有限公司)作為試驗(yàn)材料。取發(fā)育飽滿無(wú)病害的遼園多麗番茄種子，用洗衣粉水浸泡lh，沖洗干凈；于超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30s ;用10%的NaClO溶液消毒20 min,再用無(wú)菌水沖洗5次；接種于MS培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基配方為通用配方(見(jiàn)表I),于25°C光照培養(yǎng)箱中日光照16h,培養(yǎng)7天獲得無(wú)菌苗。步驟2、嫁接
取長(zhǎng)有6-10片葉子的健壯遼園多麗番茄或盆栽番茄作為砧木，在砧木頂芽下方橫切去頭，再垂直向下切口。將用作接穗的新鮮愈傷切成楔形，插入砧木切口中嫁接。令二者緊密貼合，用塑料膜覆蓋嫁接部位并緊密包扎。去除所有腋芽，以后萌發(fā)的腋芽也要及時(shí)去除。嫁接苗置于溫室中，日溫25°C/夜溫18°C，進(jìn)行正常的苗期管理。避免強(qiáng)光直射。嫁接后，愈傷組織接穗誘導(dǎo)砧木傷口產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)再生芽。再生芽大于I. O cm后，方可逐漸去除包膜。實(shí)施例2 :植物原位再生的方法在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用實(shí)例一步驟I、接穗的獲得
選取番爺品種遼園多麗(Solanum lycopersicum L,購(gòu)自遼寧園藝種苗有限公司)作為試驗(yàn)材料。取發(fā)育飽滿無(wú)病害的遼園多麗番茄種子，用洗衣粉水浸泡lh，沖洗干凈；于超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30s ;用10%的NaClO溶液消毒20 min,再用無(wú)菌水沖洗5次；接種于MS培養(yǎng)基中,MS培養(yǎng)基配方為通用配方(見(jiàn)表I),于25°C光照培養(yǎng)箱中日光照16h,培養(yǎng)7天獲得無(wú)菌苗。取子葉完全展開(kāi)、但真葉還未萌發(fā)的無(wú)菌苗，將子葉、下胚軸切O. 5cm的小段作為外植體，置于含有l(wèi)mg/L玉米素的MS培養(yǎng)基上，于25°C光照培養(yǎng)箱中日光照16h誘導(dǎo)愈傷組織。30d左右獲得淡綠色、菜花狀、結(jié)構(gòu)致密的新鮮愈傷組織作為接穗(圖I)。
權(quán)利要求
1.一種植物原位再生的方法，其特征是A、接穗的獲得選取發(fā)育飽滿無(wú)病害的遼園多麗番茄種子，作消毒無(wú)菌處理；接種于MS培養(yǎng)基中，于 25°C光照培養(yǎng)箱中日光照16h，培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗；取子葉完全展開(kāi)、但真葉還未萌發(fā)的無(wú)菌苗，將子葉、下胚軸切小段作為外植體，置于含有l(wèi)mg/L玉米素的MS培養(yǎng)基上，于25°C光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)愈傷組織；獲得新鮮愈傷組織作為接穗；B、嫁接取長(zhǎng)有5-10片葉子的健壯遼園多麗番茄或盆栽番茄作為砧木，在砧木頂芽下方橫切去頭，再垂直向下切口，將用作接穗的新鮮愈傷切成楔形，插入砧木切口中嫁接；C、砧木原位再生嫁接后，愈傷組織接穗誘導(dǎo)砧木傷口產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)再生芽。
2.一種如權(quán)利要求I所述的植物原位再生的方法在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，特征是A、接穗的獲得選取發(fā)育飽滿無(wú)病害的遼園多麗番茄種子，作消毒無(wú)菌處理；接種于MS培養(yǎng)基中，于 25°C光照培養(yǎng)箱中日光照16h，培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗；取子葉完全展開(kāi)、但真葉還未萌發(fā)的無(wú)菌苗，將子葉、下胚軸切小段作為外植體，置于含有l(wèi)mg/L玉米素的MS培養(yǎng)基上，于25°C光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)愈傷組織；獲得新鮮愈傷組織作為接穗；B、農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備將農(nóng)桿菌在含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)72小時(shí)；在平板上挑取單克隆，接種到含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素2ml液體YEB培養(yǎng)基，28°C，250rpm培養(yǎng)l_2d直至0D600為O. 6 ;按照1:100的稀釋比例將上述少量培養(yǎng)液繼續(xù)擴(kuò)繁培養(yǎng)到0D600為O. 5 ;C、農(nóng)桿菌侵染取長(zhǎng)有5-10片葉子的健壯遼園多麗番茄或盆栽番茄作為砧木，在砧木頂芽下方橫切去頭，再垂直向下切口，在傷口上涂抹農(nóng)桿菌菌液，進(jìn)行植物侵染；D、嫁接將接穗的新鮮愈傷切成楔形，插入侵染過(guò)的砧木中嫁接，誘導(dǎo)砧木傷口產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)再生芽；E、轉(zhuǎn)化的砧木原位再生嫁接后，愈傷組織接穗誘導(dǎo)侵染過(guò)的砧木傷口產(chǎn)生愈傷組織并萌發(fā)再生芽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物原位再生的方法在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征是農(nóng)桿菌為 EHAIO 5, LBA4404, EHAIO K KYRT K GV3101 或 G58，優(yōu)選 EHA105 ;包含的質(zhì)粒為 PBI121， PBI121的左右邊界內(nèi)含有卡那霉素抗性基因NPT II。
4.一種如權(quán)利要求2所述的一種植物原位再生的方法在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征是用于原位再生植物包括番茄、大豆、棉花、桑樹(shù)、花生、向日葵、番薯、馬鈴薯、蘋(píng)果、煙草、 薄荷、油菜、黃瓜和擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種植物原位再生及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法。本方法是將農(nóng)桿菌涂抹在植物砧木傷口上，再將植物離體組織在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織作為接穗，劈接法嫁接到砧木上。砧木傷口細(xì)胞在外源愈傷組織的誘導(dǎo)下，可以實(shí)現(xiàn)原位器官再生，從而得到轉(zhuǎn)基因再生芽。與傳統(tǒng)的結(jié)合組培的植物遺傳轉(zhuǎn)化相比，本發(fā)明避免了逐一基因型摸索組培條件，為植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)本發(fā)明也建立了一種新的植物再生體系，為植物發(fā)育生物學(xué)研究提供了研究系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A01G1/06GK102599052SQ20111040811
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者呂淑霞, 夏潤(rùn)璽, 崔振海, 張寧, 張少斌, 張立軍, 曹慧穎 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)