專利名稱：Fbxl15蛋白抑制劑以及它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及FBXL15蛋白抑制劑以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命體內(nèi)細(xì)胞和組織的基本物質(zhì)，幾乎所有的蛋白質(zhì)都處在不斷合成與降解的動態(tài)平衡之中。與蛋白質(zhì)的合成相比，蛋白質(zhì)的降解同樣重要，機(jī)體內(nèi)短壽命的、錯(cuò)誤折疊的以及機(jī)體自身不需要的蛋白都需要通過降解途徑來清除。其中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)⑴biquitin-Proteasome System,UPS)就是真核生物體內(nèi)普遍存在的具有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，主要由蛋白質(zhì)泛素化和蛋白酶體降解兩個(gè)過程組成。該系統(tǒng)的生物學(xué)功能非常廣泛，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)幾乎各個(gè)方面的生命活動，其異常與炎癥、癌癥及神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。泛素化修飾通過由泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，El)、泛素結(jié)合 Sl (ubiquitin conjugating enzyme, E2)禾口泛素連接 Sl (ubi qui tin-protein ligase, E3) 參與介導(dǎo)的酶促級聯(lián)反應(yīng)完成，最后經(jīng)蛋白酶體降解。其中E3決定底物識別的特異性，是蛋白質(zhì)泛素化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。E3可以分為兩大類含有RING(really interesting new gene)鋅指結(jié)構(gòu)和 HECT (homologous to E6AP C-terminus)結(jié)構(gòu)域的 E3(圖 1)。RING類E3中的大多數(shù)是基于Cullins蛋白的多亞基復(fù)合體，其中基于Cullinl所形成的SCF(Skpl-Cullinl-F-box)復(fù)合體是研究最多、最深入的RING類E3復(fù)合體。它以支架蛋白Cullinl為中心，C端結(jié)合RING鋅指蛋白Rocl，N端結(jié)合接頭蛋白Skp 1，Skpl又進(jìn)一步募集不同的F-box蛋白，F(xiàn)-box蛋白擔(dān)當(dāng)?shù)孜镒R別亞基的角色，這樣SCF復(fù)合體就利用不同的F-box蛋白形成不同復(fù)合體，從而結(jié)合不同的底物，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長及腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。F-box蛋白是一個(gè)大的蛋白家族，其家族成員數(shù)量在不同的物種中差別很大，酵母中約有20種，果蠅中有27種，而在人中則有69個(gè)成員。人中的F-box蛋白家族根據(jù)其C端所含結(jié)構(gòu)域的不同，可以分為三類含有WD40結(jié)構(gòu)域的FBXW亞家族，含有LRR區(qū)的FBXL亞家族，以及含有其它結(jié)構(gòu)域的統(tǒng)稱為FBM)亞家族，它們分別通過WD40、LRR及其它結(jié)構(gòu)域與底物蛋白發(fā)生相互作用，介導(dǎo)SCF復(fù)合體對底物的識別及泛素化修飾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供FBXL15蛋白抑制劑以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種核酸(FBXL15蛋白抑制劑)，為如下(1)至(6)中的任意一種(1)序列表的序列3所示的單鏈核酸；(2)序列表的序列4所示的單鏈核酸；(3)序列表的序列5所示的單鏈核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；
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(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸。本發(fā)明還保護(hù)FBXL15蛋白的抑制劑在制備骨質(zhì)疏松動物模型中的應(yīng)用；所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)一種用于制備骨質(zhì)疏松動物模型的產(chǎn)品，它的活性成分為所述 FBXL15蛋白的抑制劑。本發(fā)明還保護(hù)所述FBXL15蛋白的抑制劑在降低所述FBXL15蛋白的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用。以上任一所述FBXL15蛋白的抑制劑均可為所述核酸中的任意一種。以上任一所述骨質(zhì)疏松動物模型的骨小梁密度(BMD)、骨小梁相對骨量(BV/TV)， 骨小梁數(shù)量(Tb. N)和骨小梁厚度(Tb. Th)中的至少一種低于所述骨質(zhì)疏松動物模型的出發(fā)動物。以上任一所述動物具體可為大鼠，如SD大鼠。所述FBXL15蛋白的編碼基因可為如下(1)或⑵或(3)所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA 分子；(3)與⑴限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)所述FBXL15蛋白或所述FBXL15蛋白的編碼基因在參與大鼠體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)平衡中的應(yīng)用。大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在骨組織中導(dǎo)入所述FBXL15蛋白抑制劑后，可以敲低FBXL15蛋白的編碼基因的表達(dá)量，大鼠絕大多數(shù)骨指標(biāo)明顯下降，呈現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松表型。


圖1為E3泛素連接酶的組成類型；根據(jù)結(jié)構(gòu)組成及泛素轉(zhuǎn)移方式的不同，E3可分為單體RING類E3，HECT類E3和多亞基RING類E3。圖2為FBXL15蛋白的結(jié)構(gòu)域組成示意圖。圖3為小鼠FBXL15基因的組織表達(dá)譜。圖4為各個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過相應(yīng)處理后，細(xì)胞內(nèi)FBXL15基因mRNA的相對水平。圖5為大鼠脛骨骨小梁MicroCT參數(shù)分析；*表示P < 0. 05 ；BMD的單位為“mg/
ccm，，，BV/TV的單位為“ % ”，Tb. Th的單位為“mm”，Tb. N的單位為“ 1/mm”，Tb. sp的單位為 “_”。圖6為大鼠脛骨骨小梁MicroCT三維重建圖像。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。SD大鼠(健康6月齡雌性Sprague-Dawley大鼠)購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。UMR106細(xì)胞(大鼠成骨樣細(xì)胞系)購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(ATCC)，目錄號為 CRL-1661。實(shí)施例1、FBXL15蛋白的基本特征描述FBXL15蛋白由F-box結(jié)構(gòu)域和6個(gè)亮氨酸富含區(qū)(LRR)所組成(結(jié)構(gòu)示意圖見圖 2)。LRR是一大類介導(dǎo)蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)長度及序列特征可以分為6類，F(xiàn)BXL15 蛋白及Skp2蛋白等F-box蛋白屬于其中的CC(cysteine-containing)亞類。FBXL15蛋白在進(jìn)化上較為保守，在果蠅、瘧蚊等無脊椎動物及魚類、鳥類等脊椎動物以及哺乳動物中都存在FBXL15蛋白的同源基因，其中哺乳動物中FBXL15蛋白高度保守，人與其它哺乳動物的同源性高達(dá)95%以上，與魚類、鳥類的同源性在60%左右，與無脊椎動物的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)， 只有30%左右。從FBXL15蛋白與其它FBXL亞類的蛋白的進(jìn)化樹關(guān)系分析，F(xiàn)BXL15蛋白分支獨(dú)立于大多數(shù)FBXL亞類蛋白，提示FBXL15蛋白的功能可能比較保守。在獲得FBXL15抗體后，對FBXL15蛋白的組織和細(xì)胞表達(dá)譜進(jìn)行了分析。組織器官來自小鼠，分別為心、肝、脾、肺、腎、腦、骨、肌肉。結(jié)果顯示，抗體可以識別鼠源FBXL15蛋白，F(xiàn)BXL15蛋白的組織表達(dá)譜比較廣泛，在心、腦組織中呈高表達(dá)，在肝、脾、腎、骨、肌肉中表達(dá)中等，在肺中表達(dá)很弱(在各器官中的表達(dá)譜見圖3)。實(shí)施例2、SiRNA的設(shè)計(jì)和合成大鼠FBXL15蛋白如序列表的序列1所示，其編碼基因如序列表的序列2所示。設(shè)計(jì)如下三條靶向大鼠中FBXL15蛋白的siRNA 1#(序列表的序列；3) :5，-CACCCUUU⑶CAACCUACATT-3，；2#(序列表的序列 4) :5，-CACCCUGGAAUUUCAAAUATT-3，；3#(序列表的序列幻5，-GGCCAAAGCUAGUAAAGCUTT-3，。設(shè)計(jì)如下陰性對照siRNA :5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3，。以上各條siRNA由上海吉瑪公司負(fù)責(zé)合成。實(shí)施例3、siRNA的應(yīng)用一、siRNA的敲低效率借助Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將實(shí)施例2合成的l#siRNA(si_l組)、 2#siRNA (si-2 組)、3#siRNA (si_3 組)、陰性對照 siRNA (NC 組)轉(zhuǎn)染 M 孔板中的 UMR106 細(xì)胞(按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書操作；對孔板細(xì)胞生長匯合度為70%時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，2 μ 1 20 μ M siRNA與1 μ 1轉(zhuǎn)染試劑混合，siRNA和細(xì)胞個(gè)數(shù)比例約為80nM siRNA 8X104個(gè)細(xì)胞)；同時(shí)設(shè)置僅轉(zhuǎn)染不含有siRNA的轉(zhuǎn)染試劑的平行處理，作為空白對照(VC 組)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收取細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測siRNA對FBXL15基因的敲低效率(借助GAPDH基因調(diào)整各組細(xì)胞至濃度)。
檢測GAPDH基因的引物對如下 5’ -CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’ ；5，-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3，。
檢測FBXL15基因的引物對如下(靶序列約109bp)5，-GCTCAGGTGGGTCCACAGA-3，；5，-CGTCCAACAGCCATTCG-3，。對于各組處理，將FBXL15基因與GAPDH基因的表達(dá)量的比值作為FBXL15基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量。以NC組細(xì)胞內(nèi)FBXL15基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量(FBXL15mRNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量)為 100%，計(jì)算其它幾組細(xì)胞內(nèi)FBXL15mRNA的相對水平(相對表達(dá)量)，見圖4。敲低效率= 1-相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，3條siRNA的敲低效率均超過了 90%，l#siRNA的敲低效率為 96.4%, 2#siRNA的敲低效率為92. 3%，3#siRNA的敲低效率為93. 5%，l#siRNA敲低效率最尚。二、FBXL15參與體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)控目前已知Smurfl最重要的生理功能是參與調(diào)控骨平衡，Smurfl-/"小鼠呈現(xiàn)年齡依賴的骨量增加，成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。那么FBXL15對Smurfl的調(diào)控是否會影響骨形成呢？特異靶向骨組織的遞送系統(tǒng)(BTDQ中的脂質(zhì)體的制備方法具體方法如下將脂質(zhì)體 DOTAP (Avanti America,目錄號 890890)，脂質(zhì)體 DOPE (Avanti America, 850725)，膽固醇(Chol)， DSPE_mPEG2000(Avanti America,880128) ^P DSPE-mPEG2000-MAL(Avanti America,880126)按照摩爾比42 15 38 3 2的比例共同溶解在氯仿中，然后使之揮發(fā)干縮至薄膜上，用IOmM PBS(pH 7.4)使之水合，50°C水浴預(yù)孵育形成多室脂質(zhì)體小泡 (MLV)；用Lipoi^ast擠壓器(Lipofast，Avestin，多倫多，加拿大)使MLV依次透過兩層直徑0. 2 μ m和0. 1 μ m的聚碳酸酯膜(分別重復(fù)5次)，形成大的單室脂質(zhì)體小泡(LUV) ；LUV 與N末端為乙酰半胱氨酸殘基的(DSS)6 (ChinaPeptides CO.，LTD, China)室溫孵育2h(N 末端為乙酰半胱氨酸殘基的(DSS)與DSPE-PEG2000-MAL的摩爾比為3 1)，然后用瓊脂糖 CL-4B柱子通過篩析色譜法去掉未結(jié)合的(DSQ6，得到脂質(zhì)體懸液；將脂質(zhì)體懸液每0. 5ml 分裝成一管，與等體積的含有甘露醇的去離子水混合(甘露醇與脂質(zhì)體的摩爾比為5 1)， 凍干機(jī)(Labconco, Freezezone，美國)處理48小時(shí)。尾靜脈注射前，將15 μ mol上述方法得到的脂質(zhì)體與0. 5ml含有375 μ g siRNA的 DEPC水再水合，室溫孵育20min，然后通過0. 22 μ m的濾器過濾，然后尾靜脈注射SD大鼠。 siRNA利用特異靶向骨組織的遞送系統(tǒng)(BTDQ傳送到大鼠的骨組織。將30只6月齡大雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只；利用特異靶向骨組織的遞送系統(tǒng)(BTDQ將siRNA傳送到大鼠的骨組織，各組大鼠每次的注射體積相同，分組處理情況如下(各組同時(shí)處理)第一組(si-L15組)借助BTDS將實(shí)施例2合成的l#siRNA尾靜脈注射大鼠，每次劑量為細(xì)g siRNA/kg大鼠；注射6次，每次間隔1周；第六次注射完成后取右側(cè)脛骨進(jìn)行 MicroCT掃描分析；第二組(NC組)借助BTDS將實(shí)施例2合成的陰性對照siRNA尾靜脈注射大鼠， 每次劑量為細(xì)g siRNA/kg大鼠；注射6次，每次間隔1周；第六次注射完成后取右側(cè)脛骨進(jìn)行MicroCT掃描分析；第三組(VC組)用BTDS尾靜脈注射大鼠；注射6次，每次間隔1周；第六次注射完成后取右側(cè)脛骨進(jìn)行MicroCT掃描分析；第四組(AM組)大鼠不進(jìn)行任何處理；與其它組同時(shí)取右側(cè)脛骨進(jìn)行MicroCT掃描分析；第五組(BL組)大鼠不進(jìn)行任何處理，實(shí)驗(yàn)起始時(shí)(即比其它組少飼養(yǎng)5周)；取右側(cè)脛骨進(jìn)行MicroCT掃描分析。MicroCT掃描分析采用21 μ m分辨率，選擇8個(gè)橫斷面來進(jìn)行，并對核心直徑約 2. 2mm 的骨小梁進(jìn)行三維重建(viva CT40, SCANCO MEDICAL, Sigma =1.2，Supports = 2and Threshold = 190)，并定量分析以下參數(shù)骨小梁密度(BMD)、骨小梁相對骨量(BV/TV)，骨小梁數(shù)量(Tb. N)，骨小梁厚度(Tb. Th)和骨小梁間距(Tb.sp)。各個(gè)參數(shù)的檢測結(jié)果見表 1和圖5。大鼠脛骨骨小梁三維重建圖像見圖6。表1各個(gè)參數(shù)的分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.核酸，為如下(1)至(6)中的任意一種(1)序列表的序列3所示的單鏈核酸；(2)序列表的序列4所示的單鏈核酸；(3)序列表的序列5所示的單鏈核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸。
2.FBXL15蛋白的抑制劑在制備骨質(zhì)疏松動物模型中的應(yīng)用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
3.用于制備骨質(zhì)疏松動物模型的產(chǎn)品，它的活性成分為FBXL15蛋白的抑制劑； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
4.FBXL15蛋白的抑制劑在降低FBXL15蛋白的編碼基因的表達(dá)量中的應(yīng)用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，或，如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，或，如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述FBXL15蛋白的抑制劑為權(quán)利要求1所述的核酸。
6.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，或，如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于所述骨質(zhì)疏松動物模型的骨小梁密度、骨小梁相對骨量，骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度中的至少一種低于所述骨質(zhì)疏松動物模型的出發(fā)動物。
7.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，或，如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于所述動物為大鼠。
8.如權(quán)利要求2至7中任一所述的應(yīng)用或產(chǎn)品，其特征在于所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下⑴或⑵或⑶所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
9.FBXL15蛋白或其編碼基因在參與大鼠體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)平衡中的應(yīng)用； 所述FBXL15蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述FBXL15蛋白的編碼基因是如下(1)或 ⑵或⑶所述的DNA分子(1)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的 DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了FBXL15蛋白抑制劑以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的FBXL15蛋白的抑制劑為如下(1)至(6)中的任意一種(1)序列表的序列3所示的單鏈核酸；(2)序列表的序列4所示的單鏈核酸；(3)序列表的序列5所示的單鏈核酸；(4)序列表的序列3自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(5)序列表的序列4自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸；(6)序列表的序列5自5’末端第1至19位核苷酸所示的單鏈核酸。所述FBXL15蛋白的抑制劑可用于制備骨質(zhì)疏松動物模型。大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在骨組織中導(dǎo)入FBXL15蛋白抑制劑后，可以敲低FBXL15蛋白的編碼基因的表達(dá)量，大鼠絕大多數(shù)骨指標(biāo)明顯下降，呈現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松表型。
文檔編號A01K67/027GK102382829SQ20111035148
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月3日
發(fā)明者何珊, 崔宇, 張令強(qiáng), 梁超, 賀福初, 邢桂春 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所