專利名稱：表達(dá)抑制小麥SBEIIa的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表達(dá)抑制小麥SBEIIa的發(fā)卡RNA的DNA 分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
直鏈淀粉含量一般占普通小麥淀粉的25%左右，占小麥面粉的12 16%左右。直鏈淀粉特有的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了其特有的理化性質(zhì)、加工性能和應(yīng)用價值如1)由于直鏈淀粉成膜性好，是生產(chǎn)可食用食品包裝材料、膠片等的重要原料；2)由于直鏈淀粉屬于抗消化淀粉(resistant starch)，不易被腸道酶降解消化，食用后人體血糖水平不會有大幅度升高，用于制備對糖尿病人專用食品，解決病人饑餓感；對于肥胖癥、膽結(jié)石病、腸機(jī)能失調(diào)和結(jié)腸癌等具有良好的保健預(yù)防作用；作為低熱量的功能性食品，可促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、降低膽固醇和控制體重；幻還是生產(chǎn)環(huán)保型可降解薄膜、工業(yè)酒精的必要材料，用途十分廣泛。從(小麥、玉米、馬鈴薯等)普通淀粉中提取直鏈淀粉成本很高。因此，我國直鏈淀粉主要依靠進(jìn)口。由于1)我國小麥的90%以上是用來制備傳統(tǒng)面食品，小麥面粉的延展性等加工品質(zhì)優(yōu)于其他作物面粉，這樣，高含量直鏈淀粉的小麥面粉，適于直接制作糖尿病人的各種面食品、保健食品，從而在享受食品原有美味時得到健康和營養(yǎng)；幻調(diào)整小麥品種結(jié)構(gòu)，解決小麥產(chǎn)量相對過剩問題(指優(yōu)質(zhì)、專用小麥不足，而劣質(zhì)、普通小麥過剩)；因此，培育高含量直鏈淀粉的小麥品種具有重要意義。但是國內(nèi)目前尚無篩選到高直鏈淀粉的小麥變異材料，國外僅有日本報道篩選到淀粉合成酶(SGP-I)突變體(其直鏈淀粉含量也只達(dá)到37%左右)，限制了高直鏈淀粉小麥的品種培育。近幾年來，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的飛速發(fā)展為利用遺傳工程的手段開展小麥淀粉的遺傳改良開辟了廣闊的前景。董云洲(1993)、Gerhard等Q000)和Rahman等(1994)、李加瑞等 (2005)分別研究了遺傳操縱改變馬鈴薯和小麥淀粉合成途徑的影響，從而改變淀粉組成和結(jié)構(gòu)。淀粉分支酶(SBE)水解長鏈非還原性末端α ，4_糖苷鍵，切下一寡糖片段，再將該片段轉(zhuǎn)移到淀粉糖鏈中一個葡萄糖殘基上，生成α -1，6-糖苷鍵，形成支鏈淀粉的分支結(jié)構(gòu)，分支可以在淀粉合成酶作用下繼續(xù)延伸。Burton等(1995)將分離得到的豌豆SBfe 和SBKd的cDNA，同玉米、水稻、馬鈴薯等的SBE序列比較后，將SBE分為兩大類SBEI和 SBEIL· SBEI作用的底物是直鏈淀粉，它能使較長的糖苷鍵轉(zhuǎn)移到直鏈淀粉上；而SBEII作用的底物是支鏈淀粉，能使較短的糖苷鍵轉(zhuǎn)移到支鏈淀粉上(Taketa等，1993 ;Morell等， 1997)。在小麥胚乳發(fā)育過程中，SBEII的表達(dá)高峰要早于SBEI，SBEII在花后5d開始表達(dá)， 花后IOd就能達(dá)到最高；而SBEI在花后IOd開始表達(dá)，5d后表達(dá)才達(dá)到最高(Morell等， 1997 ；Kent, 2002) Gao (1997)、Safford(1998) ^P Regina(2004)分別對玉米、馬鈴薯和小麥研究之后發(fā)現(xiàn)中，SBEI酶活降低并不會影響直鏈淀粉的含量。在玉米、水稻、小麥等作物中編碼SBEIIa和SBEUb的cDNA已被克隆、定位。在不同作物中，SbeIIa和Sbenb相對表達(dá)水平在不同組織器官中有所不同。在單子葉植物中，SBEIIa表達(dá)于胚、葉和其他等營養(yǎng)組織中，SBEIIb則專一表達(dá)于胚和胚乳中(Fisher，feio， 1997)。在玉米，SbeIIa在營養(yǎng)組織中表達(dá)水平較高，在胚乳中有少量表達(dá)，SbeIIb只在胚乳中高水平表達(dá)(feio，1997)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種RNA分子。本發(fā)明提供的RNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列4。本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達(dá)所述RNA的DNA分子。本發(fā)明提供的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列5。 所述DNA分子，由A、B和C三個片段依次連接組成，所述A片段的核苷酸序列為序列表中的序列1，所述C片段與所述A片段反向互補(bǔ)；所述B片段的核苷酸序列為序列表中的序列2。含有所述DNA分子的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組表達(dá)載體為將所述DNA分子插入pBAC47P載體的XmaI酶切位點(diǎn)得到的載體擴(kuò)增所述DNA分子全長及其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，其中所述 DNA分子中的A片段的引物對中的一條引物為序列表中的序列4，另一條引物為序列表中的序列5。所述的RNA或所述DNA分子在改良小麥淀粉的品質(zhì)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述小麥淀粉的品質(zhì)為通過小麥籽粒直鏈淀粉含量體現(xiàn)。本發(fā)明的第三個目的是提供一種培育高直鏈淀粉含量的轉(zhuǎn)基因植物方法。本發(fā)明提供的方法，是將目的植物中的SBEIIa基因功能喪失，得到轉(zhuǎn)基因植物， 所述轉(zhuǎn)基因植物的籽粒中的直鏈淀粉含量高于所述目的植物。所述將目的植物中的SBEIIa基因功能喪失是通過將權(quán)利要求2所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的。所述DNA分子通過所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入；所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為小麥；所述SBEIIa基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，利用RNAi技術(shù)得到插入小麥籽粒SbeIIa基因片段正向和反向的RNA干擾載體，轉(zhuǎn)入小麥中，在不影響小麥營養(yǎng)生長和抗逆性的前提下提高小麥籽粒淀粉的直鏈淀粉含量，改良小麥淀粉的品質(zhì)。因此，對擴(kuò)大小麥淀粉在食品和非食品工業(yè)中的應(yīng)用，具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究將為小麥淀粉改良、品質(zhì)育種提供理論依據(jù)、 實(shí)驗(yàn)方法和育種材料，對我國小麥品質(zhì)改良和優(yōu)質(zhì)品種選育具有重要意義。


圖1為小麥灌漿中期籽粒總RNA圖2 為 RT-PCR 獲得 SbeIIa 片段(約 Ikb)圖3為表達(dá)載體pBAC47P+sbeIR結(jié)構(gòu)示意圖
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圖4為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株htron引物PCR檢測結(jié)果圖5為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株SBEIIa引物PCR檢測結(jié)果圖6為Ttl代轉(zhuǎn)SbeIIa基因植株P(guān)CR-Southern分析圖7為T1代轉(zhuǎn)基因小麥半定量RT-PCR分析圖8為T1代轉(zhuǎn)基因小麥株系半定量RT-PCR分析結(jié)果圖9為T5代轉(zhuǎn)基因小麥株系面粉中直鏈淀粉的百分含量
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、RNA干擾載體的獲得1、SbeIIa基因片段獲得通過比較小麥SBE編碼基因mRNA同源性，在GenBank查找小麥SbeIIa基因mRNA 序列(GenBank NO. :Y1U82，AF338431)，使用 Primer5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物為SBEIIa-s2 :5，-CGAGATGGTGGCTTGAAGAA-3，(序列 4)SBEIIa-a2 :5，-ATGATCAAGCCTGCTGAATCC-3，(序列 5)采用Trizol RNA提取試劑盒(天根公司)提取授粉15d的“農(nóng)大152”小麥 (Triticum aestivum L，該材料在文獻(xiàn)“常成，張海萍，尤明山，李保云，李衛(wèi)華，劉廣田?？箟难釋π←溍嫫珴捎绊懙难芯?。中國糧油學(xué)報，2006，21 (6) :27-30”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)籽粒的總RNA(圖1，其中1、2、3、4均為提取的RNA)，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)按說明書的兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)，得到980bp左右的PCR產(chǎn)物(圖2，其中1、2均為PCR產(chǎn)物)?；厥誔CR產(chǎn)物，使用pGEM-T Easy Vector System(Promega公司)按照說明書將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接到pGEM-TCasy載體上，將連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)EcoliDH5 α，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為將序列表中的序列 1插入pGEM-T Easy中得到的載體，序列表中的序列1與GenBank的Y11282mRNA同源性達(dá)到98. 9%，說明該P(yáng)CR產(chǎn)物為小麥的SbeIIa基因，將該質(zhì)粒命名為pTE-sbe。2、SbeIIa片段反向插入FAD2Intronl的下游用內(nèi)切酶EcoRI同時酶切上述獲得的pTE-sbe和pBSK_FAD2Intl，瓊脂糖凝膠電泳后分別回收前者約11Λ片段和后者的大片段，用T4DNA連接試劑盒(TakaRa公司)將這兩片段連接得到連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliDH5 α菌株，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用引物 SBEIIa-s2 和 AtFAD2IntlF(5’ -AGCAGATCTATCGTGAGCGG-3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， 擴(kuò)增出約1. OKB (含有反向的SbeIIa基因片段和FAD2Intr0nl下游約IOObp片段)的片段的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將該質(zhì)粒送去測序，結(jié)果為將序列表中的序列KSbeIIa基因片段)插入pBSK-FAD2Intl的EcoRI酶切位點(diǎn)得到的載體，且為反向插入pBSK_FAD2Intl的 FAD2Intronl (FAD2Intronl的核苷酸序列為序列表中的序列2，與GenBank NO :AJ271841. 1 序列反向互補(bǔ))下游，將該質(zhì)粒命名為PBSK-FAD2IΙ-sbe。pBSK-FAD2Intl按照如下方法制備根據(jù)GenBank中的AJ271841. 1序列設(shè)計(jì)引物 FADI-5 :5，-GGTA |CCCGGG| AATTCAGATC GTCCGTCGCTTCTCTTCCAT -3，(5，依次添加 KpnI、Xma I 和 EcoR I 酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基 AGATC)禾Π FAD1-3 :5，- GAGCT|CCCGGG CGGCCGCAAGCTTCTGCAGAAAACCAAAAGCAA-3，(5，依次添加 Sac I、Xma I 和Not I 酶切位點(diǎn)，
保護(hù)堿基AAGCTT)，以擬南芥Columbia生態(tài)型(Arabidopsis thaliana(L.)，該材料在文獻(xiàn) “Zhongfu Ni,Eun-Deok Kim,Misook Ha,Erika Lackey,Jianxin Liu,Yirong Zhang,Qixin Sun,Ζ. Jeffrey Chen. Altered circadian rhythms regulate growth vigour in hybrids and allopolyploids. Nature, 457 (7227) :327-331 (15January2009)中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物通過Kpn I和Mc I 雙酶切后克隆到德國 Mratagene 公司的pBluescript II XR Predigested Vector，得到 pBSK-FAD2Intl。3、SbeIIa片段正向插入FAD2 Intronl的上游用內(nèi)切酶NotI同時酶切pTE-sbe和pBSK-FAD2Il-sbe，瓊脂糖凝膠電泳后分別回收前者約11Λ片段和后者的大片段，用T4DNA酶(TakaRa公司)將這兩片段連接得到連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5 α，得到轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用EcoRV酶切(由于該sbella片段的0. 735kb附近有一個EcoRV酶切位點(diǎn)，所以可用EcoRV酶切檢測正義臂的插入方向 若正義臂與反義臂插入方向相同，則能得到2. Ikb片段；若正義臂與反義臂插入方向相反， 則能得到1.631Λ片段)，其中，EcoRV酶切得到1. 631Λ片段的質(zhì)粒為將序列表中的序列 l(SbeIIa基因)插入pBSK-FAD2IΙ-sbe的NotI處得到的載體，且SbeIIa基因?yàn)檎虿迦雙BSK-FAD2IΙ-sbe的FAD2Intronl上游，該質(zhì)粒命名為pBSK-sbdR。其中的正向插入的 SbeIIa基因(序列1)、FAD2htronl (序列2)和反向插入SbeIIa基因(序列1的反向互補(bǔ)鏈)組成了 SbeIIa片段的發(fā)夾RNA的線性DNA(該DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列6，其表達(dá)的RNA的核苷酸序列為序列表中的序列6)。4、插入到1DX5啟動子及其增強(qiáng)子下游用內(nèi)切酶XmaI同時酶切pBAC47P和pBSK-sbdR(pBSK_sbdR原來沒有啟動子)， 瓊脂糖凝膠電泳后分別回收前者3. 5KB的大片段(含有1Dx5啟動子及其增強(qiáng)子的片段的載體大片段，1Dx5啟動子及其增強(qiáng)子得大小約為0. 9KB，其核苷酸序列為序列幻和后者 3. Okb (SbeIIa片段的發(fā)夾RNA的線性DNA)片段，用T4DNA連接酶將這兩片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coli DH5a菌株，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為將序列表中的序列1、序列2和序列1的反向互補(bǔ)序列組成的序列(SbeIIa片段的發(fā)夾RNA的線性DNA)插入pBAC47P的XmaI酶切位點(diǎn)得到的載體，將該載體命名為pBAC47P+sbeIR(圖 3)，該載體含有由1Dx5啟動子及其增強(qiáng)子(序列3)、正向插入的SbeIIa(序列1)、 FAD2htronl (序列2)和反向插入的SbeIIa(序列1的反向互補(bǔ)序列)組成的抑制發(fā)卡RNA 的DNA分子，該DNA分子命名為sbeIR。pBAC47P通過如下方法獲得以Promega公司的pSP72載體為出發(fā)載體，在 HindIII和Ml I之間插入小麥高分子量谷蛋白亞基1Dx5的啟動子及其含增強(qiáng)子序列(序列 3)，在 Kpn I 和 EcoR I 之間插入 NOS 終止子(GenBank NO :AF485783. 1)。pBAC47P 質(zhì)粒大小約3. 5KB。NOS終止子來自于美國Clontech公司的pBI121載體。1Dx5啟動子及其含增強(qiáng)子序列來源于植物表達(dá)載體PBPC30。植物表達(dá)載體PBPC30在文獻(xiàn)“張曉東，梁榮奇， 陳緒清，楊鳳萍，張立全。優(yōu)質(zhì)HMW谷蛋白亞基轉(zhuǎn)基因小麥的獲得及其遺傳穩(wěn)定性和品質(zhì)性
6狀分析?？茖W(xué)通報，2003，48 (5) :474-479”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)sbeIR小麥獲得及功能鑒定一、轉(zhuǎn)sbeIR小麥獲得及鑒定受體普通小麥品種保豐104 (Triticum aestivum L)是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所白粉病組培育的天津?qū)彾ǖ男←溚茝V品種，在文獻(xiàn)“周益林，段霞瑜，盛寶欽，司權(quán)民。高產(chǎn)抗病冬小麥新品種——保豐104。麥類作物學(xué)報，2003，23 ) :147”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，以下簡稱野生型小麥。外植體小麥幼胚誘導(dǎo)得到的愈傷組織；菌株大腸桿菌(Escherichia coli)菌株 DH5 α ；載體由實(shí)施例1 得到的 pBAC47P+sbeIR，pBAC35SIH3(以 Promega 公司的 pSP72 載體為出發(fā)載體，在HindIII和Ml I之間插入CaMV 35S啟動子(GenBank NO :AF485783. 1)， 在 Kpn I 和 EcoR I 之間插入 NOS 終止子(GenBank NO :AF485783. 1)，在 BamHI 和 Sac I 酶切位點(diǎn)插入bar基因(GenBank NO :AF013602. 1)。CaMV 35S啟動子和NOS終止子來自于美國Clontech公司的pBI121載體?？钩輨㏄PT的編碼基因bar來源于植物表達(dá)載體 PBPC30。培養(yǎng)基(a)幼胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4_D 2mg/L ρΗ5· 8(b)篩選培養(yǎng)基 MS+Basta 0. 2mL/L ρΗ5· 8(c)分化培養(yǎng)基 MS+IAA lmg/L+ 反玉米素 10mg/L+Basta 0. 05mL/L ρΗ5· 8(d)壯苗生根培養(yǎng)基 MS+IAA 10mg/L+PBA 5mg/L,蔗糖 80g/L，瓊脂粉 6g/L，pH5. 81、轉(zhuǎn)sbeIR小麥獲得選取開花后12 15d的野生型小麥幼穗剝?nèi)》N子，消毒后剝?nèi)∮着?，盾片向上置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25士 1°C暗培養(yǎng)3 5d誘導(dǎo)小麥愈傷組織，獲得顏色鮮黃的愈傷組織。選擇生長狀態(tài)良好的愈傷組織塊進(jìn)行基因槍共轉(zhuǎn)化(pBAC47P+sbdR pBAC35SIH3 =3 1(摩爾比，也即分子個數(shù)比))；轉(zhuǎn)化后的愈傷25 士 1°C暗培養(yǎng)2 3d后移至篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行bar抗性篩選；篩選期間有抗性的愈傷組織塊會長出新的愈傷，而無抗性的愈傷則變褐死掉；觀察篩選1 2周之后，將生長狀態(tài)良好、顏色鮮黃的的愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上使其分化，IOd左右可見愈傷塊上有分化的跡象，大約4 5周后可分化出幼苗，分單株轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行生根壯苗(5 7d可以觀察到有根系長出，繼續(xù)培養(yǎng)3 4周，直到根系生長繁茂、小麥綠苗足夠壯實(shí)；煉苗2 3d后移栽至土壤中，獲得166株Ttl 代轉(zhuǎn)sbeIR小麥苗。2、轉(zhuǎn)sbeIR小麥的鑒定1) PCR 鑒定A、提取Ttl代轉(zhuǎn)sbdR小麥苗的基因組DNA，以FAD2Intronl片段上游引物IntronF 和下游引物 htronR為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物IntronF :5，-CCGCTCACGATAGATCTGCT_3，， IntronR :5，-GGTAACGATTCAAGAGAGTCTTC-3，，結(jié)果如圖 4 所示，M :15000bp Marker ；+ 陽性對照pBAC47P+sbeIR ；-陰性對照(野生型小麥)；0 水對照；泳道1-11 為T0代轉(zhuǎn)sbeIR 小麥，若得到1. OKB片段則為陽性Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥。B、提取Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥的基因組DNA，以SBEIIa_s2和SBEIIa_a2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示，其中，M :DL2000bp Marker ；陽性對照pBAC47P+sbeIR ；-陰性對照 (野生型小麥)；0 水對照；泳道1-6 為T0代轉(zhuǎn)sbeIR小麥，若得到980bp左右片段則為陽性T0代轉(zhuǎn)sbeIR小麥。因此將經(jīng)過上述FAD2 Intronl PCR(A)和SBEIIa PCR(B)鑒定均為陽性的記作 PCR鑒定陽性Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥。2)轉(zhuǎn)基因植株的 PCR-Southern blotting提取PCR鑒定陽性Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥的基因組DNA，使用dNTP (其中放射性同位素標(biāo)記dGTP)和上述A中的引物得到的1. OKB PCR產(chǎn)物為探針，結(jié)果如圖6所示，+ 陽性對照pBAC47P+sbeIR ；O 水對照；泳道1-20 為PCR鑒定陽性T0代轉(zhuǎn)sbeIR小麥，從圖中看出，在1. OKB處出現(xiàn)雜交信號的為Southern鑒定陽性Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥，陰性對照沒有雜交帶，進(jìn)一步證明在部分轉(zhuǎn)基因小麥植株的基因組中已經(jīng)整合RNAi載體上的FAD2Intr0nl 外源片段。將上述兩種鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株記作陽性Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥，共得到M株陽性Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥。從陽性Ttl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥?zhǔn)斋@種子，播種，獲得Tl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥，采用上述1) 和2)的鑒定方法，得到30株陽性Tl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥。3)轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR鑒定提取30株陽性Tl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到RNA，根據(jù)SbeIIa基因的 cDNA序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，進(jìn)行RT-PCR，引物序列如下Sbe-2a-a2 :5， -CGAGATGGTGGCTTGAAGAA-3，Sbe-2a-s2 :5’ -ATGATCAAGCCTGCTGAATCC-3，同時，采用β-Actin為半定量PCR的內(nèi)標(biāo)基因，其引物序列如下β -Actin-F :5，-CAGCAACTGGGATGATATGG-3，β-Actin-R :5，-ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT-3，結(jié)果如圖7所示，其中，泳道1-6 為陽性Tl代轉(zhuǎn)sbeIR小麥株系4-4-1、4_4_2、 4-4-3、4-4-8、4-4-11、4-4-19 ；泳道7 野生型小麥，可以看出，陽性Tl代轉(zhuǎn)sbdR小麥株系和野生型均得到1.0KB的產(chǎn)物，說明SbeIIa基因均有表達(dá)，但豐度不同。用Alphalmager 5500圖像分析軟件分析半定量電泳的膠圖，分別提取軟件分析結(jié)果中的內(nèi)參β -Actin和目的基因SbeIIa的Area值，然后兩者相比，得到轉(zhuǎn)基因株系和陰性對照(野生型小麥保豐104)之間SbeIIa基因的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值，結(jié)果如圖8所示4-4-1、4-4-2、4-4-3、4-4-8、4-4-11、4-4-19分別為陽性T1代轉(zhuǎn) sbeIR小麥，CK為野生型小麥保豐104 (將其SbeIIa基因表達(dá)量定為1. 00)，可以看出，4-4-1 的 SbeIIa 基因相對表達(dá)量為 0. 97士0. 105 ；4-4-2 的 SbeIIa 基因相對表達(dá)量為 1. 02士0. 298 ；4-4-3 的 SbeIIa 基因相對表達(dá)量為 1. 11 士0. 581 ；4-4-8 的 SbeIIa 基因相對表達(dá)量為 0. 83士0. 347 ；4-4-11 的 SbeIIa 基因相對表達(dá)量為 0. 47士0. 313 ；4-4-19 的 SbeIIa 基因相對表達(dá)量為 0. 77士0. 383 ；從圖中可看出，4-4-2、4-4_3的SbeIIa基因表達(dá)微高于對照非轉(zhuǎn)基因(野生型小麥保豐104),4-4-1的SbeIIa表達(dá)略微低于對照，4-4-8、4-4-11、4-4-19的SbeIIa基因表達(dá)明顯低于對照非轉(zhuǎn)基因植株，可以說明RNAi表達(dá)構(gòu)件對轉(zhuǎn)基因植株4-4-1、4-4-8、 4-4-11,4-4-19的SbeIIa基因有不同程度的抑制作用。從陽性T1代轉(zhuǎn)sbdR小麥上收獲種子，播種，繼續(xù)傳代，直到得到T5代轉(zhuǎn)sbdR小麥株系。采用上述方法進(jìn)行鑒定，得到2M個陽性T5代轉(zhuǎn)sbeIR小麥株系。二、轉(zhuǎn)sbeIR小麥的功能鑒定1、直鏈淀粉含量測定的原理淀粉與碘形成碘-淀粉復(fù)合物，并具有特殊的顏色反應(yīng)。支鏈淀粉與碘形成棕紅色復(fù)合物，支鏈淀粉與碘形成深藍(lán)色復(fù)合物。在淀粉總量不變的條件下，將這兩種淀粉分散液按不同比例混合，在一定波長和酸度下與碘作用，生成由紫紅到深藍(lán)一系列顏色，代表其不同直連淀粉與支鏈淀粉含量比例，根據(jù)吸光度與直鏈淀粉含量成線性關(guān)系，測定直鏈淀粉的含量。2、儀器、設(shè)備1)粉碎機(jī)(實(shí)驗(yàn)用旋風(fēng)磨)。2)DPCZ-II型直鏈淀粉測定儀。3)分析天平(感量為0. OOOlg)。4)玻璃儀器IOOmL容量瓶，玻璃棒，吸管，移液管(10mL，5mL，ImL)。3、試劑配制1)氫氧化鈉(GB629-77)分析純，準(zhǔn)確標(biāo)定的lmol/L的NaOH溶液；稱取4g氫氧化鈉固體，溶入IOOmL的蒸餾水中，放入塑料瓶中。2)醋酸(GB676-78)分析純，準(zhǔn)確標(biāo)定的lmol/L的HAC溶液；用純醋酸6mL，用蒸餾水稀釋至100mL。3)碘儲備液及碘試劑稱2g碘(分析純)和20g碘化鉀(分析純)用蒸餾水溶解并稀釋至IOOmL,即為點(diǎn)儲備液。取IOmL碘儲備液稀釋至IOOmL,即為碘試劑。4)氫氧化鈉分析純，準(zhǔn)確標(biāo)定的0. 09mol/L的NaOH溶液；取9mL lmol/L的NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至IOOmL,即為0. 09mol/L的NaOH溶液。5)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取重量0. IOOOg純度為95%的馬鈴薯直鏈淀粉(哈爾濱農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)檢中心，Potato Amylose-1.0)，放入IOOmL容量瓶中，加入ImL無水乙醇潤濕樣品，再加入 9mL lmol/L的氫氧化鈉溶液于沸水浴中加熱lOmin，迅速冷卻后，用水定容至100mL。6)大米支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取重量0. IOOOg純度為83. 4%的大米支鏈淀粉(哈爾濱農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)檢中心，Rice Amylopectin-L 0)，放入IOOmL容量瓶中，加入ImL無水乙醇潤濕樣品，再加入 9mL lmol/L的氫氧化鈉溶液于沸水浴中加熱lOmin，迅速冷卻后，用水定容至100mL。7)待測樣品溶液待測樣品用80目篩子篩過后，稱取待測樣品0. lOOOg，放入IOOmL容量瓶中，加入 ImL無水乙醇濕潤樣品，再加入9mL lmol/L的氫氧化鈉溶液于沸水浴中加熱lOmin，迅速冷卻后，用水定容至100mL。4、測定步驟1)分別取如下編號的陽性1~5代轉(zhuǎn)sbdR小麥株系的100粒種子，加入適量水濕潤， 在自封袋中封口存放大約 24 小時B143、B187、B085、B108、B179、B186、B024、B114、B109、 B134、B315、B088、B062、B189。以野生型小麥(CK)為對照。2)用旋風(fēng)磨磨面，每個樣品磨3次，過80目篩，將所得面粉裝入新的自封袋中，備用，即得到粗淀粉樣品?；没€校準(zhǔn)取一個IOOml的容量瓶，加入0. 09mol/L的NaOH溶液5ml放入IOOml的容量瓶中作為空白，然后依次加入50mL蒸餾水、ImL lmol/L的醋酸、ImL碘試劑，用蒸餾水定容至 IOOmL后顯色lOmin。作為DPCZ-2型直鏈淀粉測定儀的基線校準(zhǔn)溶液。4)混合校準(zhǔn)曲線繪制基線校準(zhǔn)完畢，繪制混合校準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)工作曲線)取6個IOOmL容量瓶，分別加入lmg/mL馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0. 25,0. 50、 1. 00、1. 50,2. OOmL，再依次加入大米支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液 5,4. 75,4. 50,4. 00,3. 50,3. OOmL, 總量為5mL。另取1個IOOmL的容量瓶，加入0. 09mol/L的NaOH溶液5mL做空白。然后于各瓶中依次加入約50mL水、ImL lmol/L的醋酸及ImL碘試劑。用水定容后顯色lOmin。用DPCZ-2型直鏈淀粉測定儀進(jìn)行測量，由系統(tǒng)軟件繪制并給出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。5)待測樣品測量(1)樣品分散稱取0. IOOOg粗淀粉樣品于IOOmL容量瓶中，加ImL無水乙醇，充分潤濕樣品，再加入9mL lmol/L的氫氧化鈉溶液于沸水浴中分散lOmin，迅速冷卻，用水定容。(2)脫脂取20mL分散液于50mL具備刻度試管中，加入7-10mL石油醚，間歇搖動 IOmin,靜止15min，分層后用連接在水泵上的吸管抽吸，吸去上部石油醚層，重復(fù)以上操作 2-3 次。(3)取待測樣品溶液5mL，放入IOOmL容量瓶中。依次加入50mL蒸餾水、ImL Imol/ L的醋酸、ImL碘試劑。用蒸餾水定容至IOOmL后顯色lOmin。用DPCZ-2型直鏈淀粉測定儀進(jìn)行測定其直鏈淀粉含量。結(jié)果如表1和圖9所示，圖9中，CK為野生型小麥“保豐104”，其余為編號為B143、 B187、B085、B108、B179、B186、B024、B114、B109、B134、B315、B088、B062、B189、B024 的陽性丁5代轉(zhuǎn)sbeIR小麥。表1轉(zhuǎn)SbdR株系面粉中直鏈淀粉的百分含量
權(quán)利要求
1.一種RNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列4。
2.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述RNA的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列5。
3.含有權(quán)利要求2所述DNA分子的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2所述DNA分子插入pBAC47P載體的多克隆位點(diǎn)間得到的載體。
5.擴(kuò)增權(quán)利要求2所述DNA分子全長及其任意片段的引物對。
6.權(quán)利要求1所述的RNA分子或權(quán)利要求2所述的DNA分子在改良小麥淀粉的品質(zhì)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述小麥淀粉的品質(zhì)通過小麥籽粒直鏈淀粉含量體現(xiàn)。
8.一種培育高直鏈淀粉含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將目的植物中的SBEIIa基因功能喪失，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的籽粒中的直鏈淀粉含量高于所述目的植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述將目的植物中的SBEIIa基因功能喪失是通過將權(quán)利要求2所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中實(shí)現(xiàn)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2所述DNA分子通過權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入；所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述SBEIIa基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)抑制小麥SBEIIa的發(fā)卡RNA的DNA分子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供一種RNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列4。還提供一種表達(dá)所述RNA的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列5。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，利用RNAi技術(shù)得到插入小麥籽粒SBEIIa基因片段正向和反向的RNA干擾載體，轉(zhuǎn)入小麥中，在不影響小麥營養(yǎng)生長和抗逆性的前提下提高小麥籽粒淀粉的直鏈淀粉含量，改良小麥淀粉的品質(zhì)。
文檔編號A01H5/00GK102212523SQ20111013146
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月19日
發(fā)明者倪中福, 劉志勇, 姚穎垠, 孫其信, 尤明山, 彭惠茹, 李保云, 杜金昆, 梁榮奇, 王樹彬, 秦麗燕, 解超杰 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)