專利名稱：一種質(zhì)粒載體pLGF及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體PLGF及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
香菇是一種重要的食藥用栽培真菌，具有很高的營(yíng)養(yǎng)、藥用和保健價(jià)值，其中的香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，抗感染等生物活性而受到廣泛的關(guān)注(叢陽(yáng)，黃敏.香菇多糖抗腫瘤的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用進(jìn)展。大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,4(32) =465-470 ； 遲彥，周東坡，平文祥，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用.菌物學(xué)報(bào)，2005， 24(4) :612-619)，我國(guó)是世界香菇生產(chǎn)和貿(mào)易第一大國(guó)和人工栽培香菇的發(fā)源地。目前運(yùn)用于香菇的遺傳轉(zhuǎn)化方法與動(dòng)植物、微生物的轉(zhuǎn)化方法基本相同，主要使用PEG法 (Challen MP,Rao BGiElliot TJ. Transformation strategies for A garicus bisporus. Wageningen :Pudoc，1991 :129-134)，電激法(Chun-Yi Kuo，Ching-Tsan Huang. A reliable transformation method and heterologous expressionof β -glucuronidase in Lentinula edodes. Journal of Microbiological Methods,2008, (72) :111-115) VX 及限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合法(Sato T，Yaegashi K，Ishii S1998 Transformation of the ediblebasidiomycete lentinus edodes by restriction enzymemediated DNA integration of ρlasmid DNA. Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1998， 62(12) :2346-2350)。這些轉(zhuǎn)化方法需要復(fù)雜的原生質(zhì)體制備，假陽(yáng)性率高，轉(zhuǎn)化效率較低。根癌農(nóng)桿菌是革蘭氏陰性菌，當(dāng)其侵染雙子葉植物受傷的部位時(shí)可以轉(zhuǎn)移腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的部分T-DNA片段到植物基因組中產(chǎn)生冠嬰瘤，屬于天然遺傳轉(zhuǎn)化體系 (遲彥，周東坡，平文祥，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用.菌物學(xué)報(bào)，2005， 24(4) :612-619)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌首先是在酵母中獲得成功的，之后在1998年De Groot 等人首次利用農(nóng)桿菌成功的轉(zhuǎn)化了絲狀真菌后(de Groot MJA,Bundock P,Hooykaas PJJ, Beijersbergen AGM,1998, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nat Biotechnol 16 :839-842.)，農(nóng)桿菌被廣泛的應(yīng)用到真菌的轉(zhuǎn)化中。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，乙酰丁香酮(AS)會(huì)誘導(dǎo)vir毒性基因的表達(dá)，編碼的毒性蛋白會(huì)介導(dǎo)T-DNA的轉(zhuǎn)移。VirDl和VirD2蛋白共同作用，識(shí)別T-DNA的末端重復(fù)序列，并在末端鏈上產(chǎn)生缺刻，而這些缺刻就成為T-DNA末端線性單鏈置換的起始位點(diǎn)禾口終止位點(diǎn)(M ichielse CB, Ram AF, Hooykaas PJ. Role of bacterial viru lence proteins in Agrobacterium. Mediated transform ation of Aspergillusawamori. Fungal GenetBiol. 2004，41 (5) :571-578)。T-DNA隨即的插入到宿主基因組中，在整合過(guò)程中，宿主因素對(duì)同源或非同源整合起主要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種質(zhì)粒載體pLGF及其應(yīng)用。該質(zhì)粒載體可轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，通過(guò)農(nóng)桿菌浸染香菇，從而將目的基因?qū)胂愎骄w中獲得穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)本發(fā)明可以建立穩(wěn)定有效的香菇外源基因轉(zhuǎn)化體系，為獲得穩(wěn)定、遺傳性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因香菇新菌種提供了新的方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種質(zhì)粒載體pLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述質(zhì)粒載體pLGF在選育香菇新品種中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下(1)將經(jīng)Nco I、BglII或Spe I內(nèi)切酶中任意兩個(gè)內(nèi)切的目的基因插入經(jīng)同樣內(nèi)切酶內(nèi)切的上述質(zhì)粒載體PLGF中，得到插入目的基因的質(zhì)粒載體；(2)將步驟⑴制得的插入目的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到含目的基因的根癌農(nóng)桿菌；(3)將步驟( 制得的含目的基因的根癌農(nóng)桿菌侵染處理后的香菇菌球，得到侵染后的香菇菌球；(4)將步驟(3)制得的侵染后的香菇菌球在含有10_20yg/mL潮霉素和 300-500 μ g/mL頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，得到表達(dá)目的基因的香菇新品種。所述步驟O)中的轉(zhuǎn)化，具體操作如下將根癌農(nóng)桿菌EHA105在200_250rpm的條件下，于含50 μ g/mL鏈霉素的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD66tl為0. 5-0. 8，然后置于冰上15min，離心，棄上清液，再加入預(yù)冷的20mM CaCl2溶液重懸，得重懸液；然后，向重懸液中加入含有插入目的基因的質(zhì)粒載體， 混勻，冰浴30min后，液氮速凍2min，37°C水浴5min，然后，加入等體積的LB液體培養(yǎng)基， 26-28 0C 220rpm培養(yǎng)Ih，再經(jīng)過(guò)含50 μ g/mL鏈霉素和50 μ g/mL卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，得到含目的基因的根癌農(nóng)桿菌。所述步驟(3)中的侵染，具體操作如下(a)將含目的基因的根癌農(nóng)桿菌在200_250rpm的條件下，于含50 μ g/ mL鏈霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)22-25小時(shí)，再加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基和 AS (乙酰丁香酮)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD66tl 0. 2-0. 5，得誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌溶液；(b)將處理后的香菇菌球浸入步驟(a)制得的誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌溶液，浸染 20-30min，浸染期間每隔5-lOmin振蕩一次；然后將香菇菌球在誘導(dǎo)平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)2_4 天，培養(yǎng)溫度22-25°C，得到侵染后的香菇菌球。上述處理后的香菇菌球制備方法如下取香菇菌體接種于PDA液體培養(yǎng)基中25°C，150-160rpm培養(yǎng)10天，離心，棄上清液，然后，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌離心2-4次，得到處理后的香菇菌球。上述培養(yǎng)基采用如下配方配制LB液體培養(yǎng)基為950mL去離子水中加5g酵母抽提物，IOg胰蛋白胨，IOgNaCl，定容至IL0LB平板培養(yǎng)基為在IL上述LB液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:850mL去離子水中加入 1. 45g ΚΗ2Ρ04、0· 066g CaCl2 · 2H20， 0. 00248g FeSO4 · 7Η20、0· 5g (NH4) 2S04、1. 8g 葡萄糖、5mL 甘油，定容至 940mL。誘導(dǎo)平板培養(yǎng)基:850mL去離子水中加 1. 45g KH2PO4, 2. 05g K2HPO4,0. 15g NaCl， 0. 5g MgSO4 · 7H20,0. 066g CaCl2 · 2H20,0. 00248g FeSO4 · 7H20,0. 5g (NH4) 2S04,0. 9g 葡萄糖，5mL甘油，15g瓊脂，定容至940mL。AS(乙酰丁香酮)培養(yǎng)基配比為0. 01962g乙酰丁香酮溶于甲醇，去離子水定容至 10mL，過(guò)濾除菌。PDA 液體培養(yǎng)基為:200g 土豆泥，20g 葡萄糖，2g KH2PO4,1. 5gMgS04 · 7H20,1. 5g 蛋白胨，定容至IL0PDA固體培養(yǎng)基在上述PDA液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂。選擇培養(yǎng)基為在上述PDA固體培養(yǎng)基中加入潮霉素和頭孢霉素，使潮霉素終濃度為10-20 μ g/ml，頭孢霉素終濃度為300-500 μ g/ml。有益效果1、根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化可以轉(zhuǎn)移Ti質(zhì)粒的部分片段T-DNA整合到宿主基因組中，以香菇的菌絲作為初始材料，轉(zhuǎn)化效率高且遺傳穩(wěn)定性好，可進(jìn)行同源整合，也可以隨機(jī)插入，避免了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法中原生質(zhì)體制備困難，再生率低的缺點(diǎn)；可以從農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的香菇中直接獲得T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列和確定被破壞的基因，并通過(guò)表型的變化實(shí)現(xiàn)正反向遺傳性的結(jié)合分析。2、利用香菇轉(zhuǎn)化獲得突變體已成為進(jìn)行基因克隆和遺傳學(xué)分析最有效的方法之一，建立相應(yīng)的插入突變體庫(kù)是功能基因組學(xué)發(fā)展的趨勢(shì)，通過(guò)對(duì)不同表型突變體的正、反向遺傳學(xué)分析揭示香菇生長(zhǎng)、代謝的分子機(jī)理，對(duì)進(jìn)一步了解這個(gè)經(jīng)濟(jì)重要的工業(yè)菌株具有重大意義，同時(shí)也為鑒定那些與菌株生長(zhǎng)發(fā)育、代謝途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因，深入了解基因功能和闡明相關(guān)的分子機(jī)理提供了技術(shù)平臺(tái)和研究基礎(chǔ)。3、與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，孢子、菌絲子實(shí)體均可作為初始材料，避免了制備原生質(zhì)體的麻煩；T-DNA單拷貝插入效率高；不需要專門儀器，轉(zhuǎn)化率高于其它轉(zhuǎn)化方法；可以避免菌絲的多核所造成的轉(zhuǎn)化子的不穩(wěn)定。除此之外， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化還有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)，由于T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列，這有利于突變相關(guān)基因的確定。本發(fā)明方法所建立的香菇轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為香菇新品種的選育開辟了新的途徑，更好的滿足人們對(duì)香菇質(zhì)量和產(chǎn)量的要求。


圖1為pLGF的質(zhì)粒圖譜；其中，RB為 T-DNA 區(qū)右邊界；LB 為 T-DNA 區(qū)的左邊界；EcoR I,Xho I.BamH I,Pst I、Bgl II為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；gpd 1和gpd 2為3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子，hphR 為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，KanR為卡那霉素，mGFP為綠色熒光蛋白基因，NOS-poly A為終止子，CaMV35S poly A為煙草花椰菜病毒啟動(dòng)子；圖2為pLGF酶切鑒定電泳圖；圖3為含有SW0基因的pLGF酶切鑒定電泳圖其中，M:lkb marker 1 :Pst I 和 Bgl II ；2 =EcoR I 和 BamH I ；3 :Xho I 和 EcoR I ；圖4為pLGF轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR鑒定電泳圖；圖5為香菇轉(zhuǎn)化子在潮霉素抗性平板生長(zhǎng)情況的照片；圖6為香菇轉(zhuǎn)化子潮霉素hph基因的PCR鑒定電泳其中，泳道1為11Λ marker,泳道2，3為香菇轉(zhuǎn)化子PCR，泳道4為原菌株P(guān)CR，泳道5為pLGF質(zhì)粒PCR ；圖7香菇轉(zhuǎn)化子的點(diǎn)雜交鑒定圖；其中，1 質(zhì)粒對(duì)照；2 原菌株對(duì)照；3 香菇轉(zhuǎn)化子；4 香菇轉(zhuǎn)化子。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例1質(zhì)粒載體pLGF的構(gòu)建，步驟如下(1)按以下步驟提取質(zhì)粒pCAMBIA1302(a)將含有質(zhì)粒PCAMBIA1302的大腸桿菌DH5 α接種至含有卡那霉素的20mL的 LB液體培養(yǎng)基(每升含酵母抽提物5g，胰蛋白胨10g，NaCl IOg)中，37°C ISOrpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得培養(yǎng)液。(b)取1. 5mL培養(yǎng)液于微量離心管中，12000rpm離心30s，棄上清液，得細(xì)胞沉淀。(c)向細(xì)胞沉淀中加入10(^1^預(yù)冷的溶液1(每10011^中含201111葡萄糖251^， IMTris-HCl (pH8. 0) 2. 5mL, 250mM EDTA (pH8. 0) 4mL)，用旋渦混合儀劇烈振蕩，使菌體充分懸浮。(d)加入 200 μ L新配制的溶液 II(10M NaOH 200 μ L，10% SDS (W/V) ImL,臨用前力口去離子水定容至IOmL)，立即溫和顛倒離心管5 6次(避免劇烈振蕩)，靜置aiiin。(e)加入150 μ L預(yù)冷的溶液III (每IOOmL含5Μ乙酸鉀60mL，冰乙酸11. 5mL)，反復(fù)顛倒數(shù)次，冰浴10min，12000rpm離心lOmin。(f)取上清液于另一 1.5mL離心管中，加入等體積酚氯仿異戊醇(體積比 25 24 1)，顛倒混勻，12000rpm 離心 5min。(g)取上清液，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心 IOmin0(h)棄上清液，沉淀用ImL 70%乙醇洗滌兩次，12000rpm離心anin。棄上清液，除酒精。⑴沉淀用30 μ L 的 TE (每升含 Tris 1. 21g，EDTA-Na2 0. 37g，pH 8. 0)溶解，即得質(zhì)粒 PCAMBIA1302。(2)以質(zhì)粒pCAMBIA1302為模板，設(shè)計(jì)的引物ZHFn 5 -CCGGAATTCGCTTTCGCAGATCCCGGG-3，(下劃線處為 EcoR I 位點(diǎn))SEQ ID NO. 2ZHRl 5’ -CCGCTCGAGTTATGGAGAAACTCGAGCTT-3’ (下劃線處為 Xho I 位點(diǎn))SEQ ID N0. 3，擴(kuò)增出Ikb的hph基因，帶有EcoR I和Xho I位點(diǎn)。(3)回收后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和B10 I酶切hph片段，并用T4連接酶將hph 片段與同樣酶切回收后的PCAMBIA1302大片段相連。(4)按以下步驟提取香菇的基因組DNA
(a)刮取香菇菌絲，倒入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管中。(b)加入600 μ L于65°C預(yù)熱的CTAB(100mM Tris,pH 8.0 ；20mMEDTA,pH 8. 0，1· 4M NaCl提取緩沖液)，65°C下孵育60min，每15min顛倒混合一次。(c)加入等量的600 μ L苯氯仿異戊醇(體積比25 24 1)，顛倒混勻。(d) 8000rpm,離心IOmin后吸取上清液加入另一干凈的離心管中。(e)加入0. 6倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，在_20°C下放置45min， 12000rpm離心5min，倒掉上清。(f)加入500 μ L預(yù)冷的70%乙醇漂洗兩次。(g)除乙醇，加入40 μ L TE溶液，溶解DNA。(5)以提取的香菇基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)的引物pLgFl :5，-CGCGGATCCGATATCAGTCAGATTG-3，(下劃線處為 EcoR I 位點(diǎn))SEQ ID NO. 4，pLgRl :5，-CCGGAATTCGGCCATTTTAATTCAAGC-3’ SEQ ID NO. 5，(下劃線處為BamHI位點(diǎn))擴(kuò)增出750bp的啟動(dòng)子gpdl。以引物 PLgF3 5’-AACTGCAGTCGATATCAGTCAGATTG-3’ (下劃線處為 PstI 位點(diǎn))SEQ ID NO. 6 和 pLgRl :5，-GAAGATCTGGCCATTTTAATTCAAGC3-3’ (下劃線處為 Bg/II 位點(diǎn))SEQ ID NO. 7擴(kuò)增出750bp的啟動(dòng)子gpd2 (帶有Pst I位點(diǎn))。(6)將啟動(dòng)子gpdl回收并用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I酶切后和同樣酶切回收后的帶有hph片段的載體大片段相連。(7)將回收的啟動(dòng)子gpd2用限制性內(nèi)切酶I^st I和Bgl II酶切，與同樣酶切后的帶有hph基因和gpdl啟動(dòng)子的大片段相連，即得質(zhì)粒載體pLGF，見圖1，圖2。經(jīng)測(cè)序，該質(zhì)粒載體pLGF核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。實(shí)施例2上述質(zhì)粒載體在選育香菇新品種中的應(yīng)用，步驟如下(1)按以下步驟提取質(zhì)粒pUC19-SW0(a)將含有質(zhì)粒pUC19-SW0的大腸桿菌DH5 α接種至含有氨芐霉素的20mL的LB 液體培養(yǎng)基(每升含酵母抽提物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g)中，37°C ISOrpm振蕩培養(yǎng)過(guò)
夜，得培養(yǎng)液。(b)取1. 5mL培養(yǎng)液于微量離心管中，12000rpm離心30s，棄上清液，得細(xì)胞沉淀。(c)向細(xì)胞沉淀中加入10(^1^預(yù)冷的溶液1(每10011^中含201111葡萄糖251^， IMTris-HCl (pH8. 0) 2. 5mL, 250mM EDTA (pH8. 0) 4mL)，用旋渦混合儀劇烈振蕩，使菌體充分懸浮。(d)加入 200 μ L 新配制的溶液 II (10Μ NaOH 200 μ L，10% SDS (ff/V) ImL,臨用前加去離子水定容至IOmL)，立即溫和顛倒離心管5 6次(避免劇烈振蕩)，靜置aiiin。(e)加入150 μ L預(yù)冷的溶液III (每IOOmL含5Μ乙酸鉀60mL，冰乙酸11. 5mL)，反復(fù)顛倒數(shù)次，冰浴10min，12000rpm離心lOmin。(f)取上清液于另一 1. 5mL離心管中，加入等體積酚氯仿異戊醇 (25 24 1)，顛倒混勻，12000rpm 離心 5min。(g)取上清液，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻，靜置lOmin，12000rpm離心IOmin0(h)棄上清液，沉淀用ImL 70%乙醇洗滌兩次，12000rpm離心anin。棄上清液，除酒精。⑴沉淀用30 μ L 的 TE (每升含 Tris 1. 21g，EDTA-Na2 0. 37g，pH 8. 0)溶解，即得質(zhì)粒 pUC19-swo。(2)以質(zhì)粒pCAMBIA1302為模板，設(shè)計(jì)的引物swoF :5，-GAAGATCTCACCACCACCACCACCAC-3，(下劃線處為 Bgl II 酶切位點(diǎn))SEQ ID NO. 8，swoR :5，-GAAGATCTGCGCTTGGAAATCACATT-3’ (下劃線處為 Bgl II 酶切位點(diǎn))SEQ ID NO. 9，擴(kuò)增出1. 4kb的SW0基因，兩端均帶有Bgl II位點(diǎn)。(3)回收后用限制性內(nèi)切酶Bgl II酶切SWO片段，并用T4連接酶將SW0片段與同樣酶切回收后并去磷酸化處理的PLGF相連。(4)經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證連入SWO片段方向的正確性，見圖3。實(shí)施例3將pLGF 質(zhì)粒導(dǎo)入 EHA105 (a)從LB平板上(含50 μ g/ml鏈霉素)挑取農(nóng)桿菌EHA105菌株的單菌落，接種于7ml LB液體培養(yǎng)基(含50 μ g/ml鏈霉素)中，在27°C 220rpm培養(yǎng)Mh。(b)取步驟(a)中的培養(yǎng)液0. 5ml接種于LB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml鏈霉素)中，在 26-280C 220rpm 培養(yǎng) OD660 為 0. 5-0. 8，冰上放置 15min，4°C 3000rpm 離心 lOmin，棄上清， 加入IOmL預(yù)冷的20mM CaCl2重懸菌體。(c)取步驟(b)中的溶液200μ L，加入適量pLGF載體，混勻，冰浴30min，轉(zhuǎn)入液氮速凍2min，然后37°C水浴5min，加入等體積的LB培養(yǎng)基，26-28°C 220rpm培養(yǎng)lhr，涂布于 LB培養(yǎng)基平板(含50 μ g/mL鏈霉素和50 μ g/mL卡那霉素)，培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子，見圖4。將上述已導(dǎo)入pLGF質(zhì)粒的EHA105單菌落接種于7mL LB培養(yǎng)基(含50 μ g/mL鏈霉素和50 μ g/mL卡那霉素)中，27°C 220rpm培養(yǎng)Mhr，再加入13mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基和400 μ LAS， 繼續(xù)培養(yǎng)至OD66tl為0. 3。取接種于PDA液體培養(yǎng)基中25V 150rpm培養(yǎng)好的新鮮香菇菌球于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入活化好的農(nóng)桿菌菌液，侵染30min，期間每隔5min振蕩一次。侵染結(jié)束后吸掉培養(yǎng)皿中的菌液，然后將菌球轉(zhuǎn)移至鋪有一張濾紙的誘導(dǎo)平板中，25°C共培養(yǎng)3天至菌球萌發(fā)。 在誘導(dǎo)平板上倒入選擇培養(yǎng)基含有10 μ g/mL潮霉素和300 μ g/mL頭孢霉素)繼續(xù)培養(yǎng)得到香菇轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為18. 23%，見圖5。對(duì)PCR擴(kuò)增鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子(見圖6)，液體培養(yǎng)后，抽取基因組DNA，通過(guò)酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜等操作，與地高辛標(biāo)記的目的基因■探針雜交，出現(xiàn)明顯雜交信號(hào)(見圖 7)。本發(fā)明適用于現(xiàn)有的各種香菇菌種。經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)侵染后的香菇菌球經(jīng)多代培養(yǎng)后， 仍能檢測(cè)到均有明顯的信號(hào)；說(shuō)明本發(fā)明方法已有效的將外源SWO基因整合到香菇的基因組中，并且使SW0基因在香菇中得到穩(wěn)定表達(dá)。上述結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明方法能有效的介導(dǎo)外源基因整合入香菇基因組中，并使之得到穩(wěn)定的表達(dá)，從而建立了香菇的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。實(shí)施例4:
按實(shí)施例3中的步驟將pLGF質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中；將已導(dǎo)入pLGF質(zhì)粒的 EHA105單菌落于7mL LB培養(yǎng)基(含60 μ g/mL鏈霉素和60 μ g/mL卡那霉素)中 200rpm培養(yǎng)24hr，再加入13mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基和500 μ L AS,繼續(xù)培養(yǎng)至OD66tl為0. 4。取接種于PDA液體培養(yǎng)基中25V 160rpm培養(yǎng)好的新鮮香菇菌球于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入活化好的農(nóng)桿菌菌液，侵染20min，期間每隔IOmin振蕩一次。侵染結(jié)束后吸掉培養(yǎng)皿中的菌液，然后將菌球轉(zhuǎn)移至鋪有一張濾紙的誘導(dǎo)平板中，25°C共培養(yǎng)3天至菌球萌發(fā)。 在誘導(dǎo)平板上倒入選擇培養(yǎng)基含有15 μ g/mL潮霉素和400 μ g/mL頭孢霉素)繼續(xù)培養(yǎng)得到香菇轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為19. 73%。實(shí)施例5:按實(shí)施例3中的步驟將pLGF質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中；將已導(dǎo)入pLGF質(zhì)粒的EHA105單菌落于7mLLB培養(yǎng)基(含60 μ g/mL鏈霉素和60 μ g/mL卡那霉素)中 220rpm培養(yǎng)24hr，再加入13mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基和600 μ L AS,繼續(xù)培養(yǎng)至OD66tl為0. 5。取接種于PDA液體培養(yǎng)基中25V 160rpm培養(yǎng)好的新鮮香菇菌球于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入活化好的農(nóng)桿菌菌液，侵染25min，期間每隔IOmin振蕩一次。侵染結(jié)束后吸掉培養(yǎng)皿中的菌液，然后將菌球轉(zhuǎn)移至鋪有一張濾紙的誘導(dǎo)平板中，25°C共培養(yǎng)4天至菌球萌發(fā)。 在誘導(dǎo)平板上倒入選擇培養(yǎng)基含有20 μ g/mL潮霉素和500 μ g/mL頭孢霉素)繼續(xù)培養(yǎng)得到香菇轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化效率為18. 85%。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒載體PLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體pLGF在選育香菇新品種中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下(1)將經(jīng)NcoI、BglII或Spe I內(nèi)切酶中任意兩個(gè)內(nèi)切的目的基因插入經(jīng)同樣內(nèi)切酶內(nèi)切的上述質(zhì)粒載體PLGF中，得到插入目的基因的質(zhì)粒載體；(2)將步驟(1)制得的插入目的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到含目的基因的根癌農(nóng)桿菌；(3)將步驟( 制得的含目的基因的根癌農(nóng)桿菌侵染處理后的香菇菌球，得到侵染后的香菇菌球；(4)將步驟(3)制得的侵染后的香菇菌球在含有10-20μg/mL潮霉素和300-500 μ g/ mL頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，得到表達(dá)目的基因的香菇新品種。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟O)中的轉(zhuǎn)化，具體操作如下 將根癌農(nóng)桿菌EHA105在200-250rpm的條件下，于含50 μ g/ml鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD66tl為0. 5-0. 8，然后置于冰上15min，離心，棄上清液，再加入預(yù)冷的20mM CaCl2溶液重懸，得重懸液；然后，向重懸液中加入含有插入目的基因的質(zhì)粒載體， 混勻，冰浴30min后，液氮速凍2min，37°C水浴5min，然后，加入等體積的LB液體培養(yǎng)基， 26-28 0C 220rpm培養(yǎng)Ihr，再經(jīng)過(guò)含50 μ g/ml鏈霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，得到含目的基因的根癌農(nóng)桿菌。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(3)中的侵染，具體操作如下(a)將含目的基因的根癌農(nóng)桿菌在200-250rpm的條件下，于含50μ g/ml鏈霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)22-2證1·，再加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基和乙酰丁香酮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD66tl 0. 2-0. 5，得誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌溶液；(b)將處理后的香菇菌球浸入步驟(a)制得的誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌溶液，浸染20-30min，浸染期間每隔5-lOmin振蕩一次；然后將香菇菌球在誘導(dǎo)平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天，培養(yǎng)溫度 22-25°C，得到侵染后的香菇菌球。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述處理后的香菇菌球制備方法如下 取香菇菌體接種于PDA液體培養(yǎng)基中25°C，150-160rpm培養(yǎng)10天，離心，棄上清液，然后，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌離心2-4次，得到處理后的香菇菌球。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體pLGF及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。一種質(zhì)粒載體pLGF，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供上述質(zhì)粒載體pLGF在選育香菇新品種中的應(yīng)用。通過(guò)本發(fā)明可以建立穩(wěn)定有效的香菇外源基因轉(zhuǎn)化體系，為獲得穩(wěn)定、遺傳性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因香菇新菌種提供了新的方法。
文檔編號(hào)A01H15/00GK102206666SQ201110094400
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者萬(wàn)魯長(zhǎng), 任海霞, 任鵬飛, 劉巖, 姚強(qiáng), 宮志遠(yuǎn), 曲玲, 李瑾, 趙軍勝, 韓建東, 高興喜 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所