專利名稱：一種富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種北蟲草的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
北冬蟲夏草，又名蛹蟲草[C.militarise(L. )Link]、北蟲草，屬子囊菌亞門(Asco mycotina)核菌綱(pyrenomycetes)球殼目(Sphaerinles)麥角菌禾斗(claviticpitaceae) 蟲草屬(Codyc印s)，是我國(guó)名貴中藥材之一。具有催眠鎮(zhèn)靜、益肝腎、補(bǔ)虛損、防癌、抗癌、止血、化痰、平喘等多種功效，與人參、鹿茸并稱為中藥寶庫(kù)中的三大補(bǔ)藥。在《本草從新》中記載有“甘平保肺、益腎、補(bǔ)精髓、止血化痰”等療效。因?yàn)橄x草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，是唯一能同時(shí)平衡和調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥。北冬蟲夏草主要分布在我國(guó)吉林、河北、陜西等省。其主要的化學(xué)成分藥理、藥效與野生冬蟲夏草極為相似，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究分析室、中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)分院理化測(cè)試中心等權(quán)威部門的檢測(cè)表明，北蟲草的一些主要營(yíng)養(yǎng)及藥物成份如蟲草素、蟲草多糖、 蛋白質(zhì)等還要高于冬蟲夏草。據(jù)《全國(guó)中草藥匯編》記載“北蟲草的子實(shí)體及蟲體可作為冬蟲夏草入藥”。因此，北蟲草在藥理功能及臨床效果方面與野生冬蟲夏草基本是一致的?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，北蟲草不僅含有豐富的蛋白質(zhì)(含量為39. 37 %，是豬肉、牛肉、羊肉蛋白質(zhì)含量的1. 8，1. 5，1. 9倍)和氨基酸，而且含有30多種人體所需的微量元素。 其中P(磷)的含量是冬蟲夏草的3. 5倍，Zn(鋅)、Cu(銅)、Fe (鐵)三種元素的含量是觀種補(bǔ)益藥平均值的1.8，2.1和8. 8倍，Se (硒)的含量與黃芪的含量相當(dāng)。中醫(yī)臨床上常將北蟲草與各種補(bǔ)益中藥配伍使用以達(dá)到協(xié)同增效的目的，但患者在配伍使用中藥時(shí)常常因?yàn)榉昧看?，服用不便為由中斷使用藥物。因此?jiǎn)化中醫(yī)配伍用藥，提高北蟲草的利用率是必須解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法；目的是為了簡(jiǎn)化中醫(yī)配伍用藥，提高北蟲草的利用率。富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行一、將北蟲草菌株玉豐一號(hào)接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在23°C下暗培養(yǎng)7d，得到活化的菌種；二、將活化好的菌種切成IcmX Icm的菌塊接種到300ml的液體種子培養(yǎng)基中，在溫度為23°C、120r/min的條件下暗培養(yǎng)7d，得液體菌種；三、將液體菌種用磁力攪拌器打碎并稀釋250倍，然后取15ml 接種到富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基中，薄膜封口后在溫度為22°C、濕度為55% 60% 的條件下暗培養(yǎng)6 9d，得菌絲體，然后置于光照下培養(yǎng)至子實(shí)體成熟，然后繼續(xù)培養(yǎng)至子座生長(zhǎng)到4 8cm長(zhǎng)且表面出現(xiàn)橘黃色粉末狀物質(zhì)，進(jìn)行采收，即完成富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)；其中步驟三中富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和60ml的營(yíng)養(yǎng)液組成，400ml的瓶裝量為1/4 1/3 ；所述五味子粉末的制備將五味子果粉碎后過(guò)20目篩；所述營(yíng)養(yǎng)液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氫鉀、4g的硫酸鎂、200g的土豆液、Ig的維生素Bl和余量的水組成；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min ；步驟三中光照的時(shí)間為10 12h。本發(fā)明富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，通過(guò)五味子中的成分與北冬蟲夏草生長(zhǎng)代謝間的相互作用起到提高腺苷和蟲草素的含量，同時(shí)又產(chǎn)生了具有五味子藥效成分的北冬蟲夏草子實(shí)體，從而起到在使用北蟲草的同時(shí)配伍了五味子。本發(fā)明產(chǎn)出的北蟲草，能大幅度提高北蟲草子實(shí)體蟲草素和腺苷含量，蟲草素可達(dá)0. 774%，腺苷可達(dá)0. 0258%，上述兩種成分含量均高于報(bào)道的野生冬蟲夏草，商品價(jià)值很高；并且本發(fā)明產(chǎn)出的北蟲草子實(shí)體中含有五味子醇甲0. 007mg/g和五味子酯甲 0. 055mg/g，從而起到將五味子有效成分轉(zhuǎn)移至北蟲草子實(shí)體中的目的，簡(jiǎn)化了中醫(yī)學(xué)中北蟲草與五味子配伍的方法，并提高了北蟲草的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值；另外，實(shí)施條件容易達(dá)到， 能在全行業(yè)推廣。


圖1為具體實(shí)施方式
四中HPLC法測(cè)定北蟲草中腺苷含量的對(duì)照品譜圖，其中曲線1表示腺苷；圖2為具體實(shí)施方式
四中HPLC法測(cè)定北蟲草中蟲草素含量的對(duì)照品譜圖， 其中曲線2表示蟲草素；圖3為具體實(shí)施方式
四中培養(yǎng)所得富含五味子有效成分的北蟲草中腺苷和蟲草素含量的譜圖，其中曲線1表示腺苷，曲線2表示蟲草素；圖4為具體實(shí)施方式
四中HPLC法測(cè)定北蟲草中五味子的有效成分含量的對(duì)照品譜圖，其中曲線1為五味子醇甲，曲線2為五味子酯甲，曲線3為五味子甲素，曲線4為五味子乙素；圖5為具體實(shí)施方式
四中培養(yǎng)所得富含五味子有效成分的北蟲草中五味子的有效成分含量的譜圖，其中曲線1 為五味子醇甲，曲線2為五味子酯甲。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行一、將北蟲草菌株玉豐一號(hào)接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在23°C下暗培養(yǎng)7d，得到活化的菌種；二、將活化好的菌種切成IcmX Icm的菌塊接種到300ml的液體種子培養(yǎng)基中， 在溫度為23°C、120r/min的條件下暗培養(yǎng)7d，得液體菌種；三、將液體菌種用磁力攪拌器打碎并稀釋250倍，然后取15ml接種到富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基中，薄膜封口后在溫度為22°C、濕度為55% 60%的條件下暗培養(yǎng)6 9d，得菌絲體，然后置于光照下培養(yǎng)至子實(shí)體成熟，然后繼續(xù)培養(yǎng)至子座生長(zhǎng)到4 8cm長(zhǎng)且表面出現(xiàn)橘黃色粉末狀物質(zhì)，進(jìn)行采收，即完成富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)；其中步驟三中富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和60ml的營(yíng)養(yǎng)液組成，400ml的瓶裝量為1/4 1/3 ；所述五味子粉末的制備將五味子果粉碎后過(guò)20目篩；所述營(yíng)養(yǎng)液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氫鉀、4g的硫酸鎂、200g的土豆液、Ig的維生素Bl和余量的水組成；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min ；步驟三中光照的時(shí)間為10 12h。
本實(shí)施方式步驟一中北蟲草菌株玉豐一號(hào)，購(gòu)買自哈爾濱玉豐菌業(yè)有限責(zé)任公
司ο本實(shí)施方式步驟二中每300ml液體種子培養(yǎng)基中接種1個(gè)菌塊。本實(shí)施方式步驟三中暗培養(yǎng)6 8d的過(guò)程中，菌絲體長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基的表面并吃透培養(yǎng)基；且接種后前1周不通風(fēng)，以后每天通風(fēng)換氣1 2次。本實(shí)施方式步驟三中光照下培養(yǎng)至子實(shí)體成熟，然后繼續(xù)培養(yǎng)至子座生長(zhǎng)到4 8cm長(zhǎng)的過(guò)程為在培養(yǎng)中不需要去掉封口薄膜；當(dāng)子實(shí)體長(zhǎng)到2cm長(zhǎng)，用粗針或竹簽在封口薄膜上扎5 8個(gè)小洞；如子實(shí)體向一邊倒，則調(diào)整光源方向，或每間隔3天轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基方向，以便采光均勻，保證子座正常生長(zhǎng)到4 8cm長(zhǎng)。本實(shí)施方式步驟三中總的培養(yǎng)時(shí)間為40 50h。本實(shí)施方式步驟三中采收后，將北蟲草置于45°C下烘干至恒重。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中PDA固體培養(yǎng)基由200g的土豆液、20g的葡萄糖、18g的瓊脂和IOOOml的水組成，pH自然；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中液體種子培養(yǎng)基每L由200g的土豆液、20g的葡萄糖、Ig的硫酸鎂、Ig磷酸二氫鉀和余量的水組成，pH自然；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH 自然，121°C高壓滅菌30min。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行一、將北蟲草菌株玉豐一號(hào)接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在23°C下暗培養(yǎng)7d，得到活化的菌種；二、將活化好的菌種切成IcmX Icm的菌塊接種到300ml的液體種子培養(yǎng)基中， 在溫度為23°C、120r/min的條件下暗培養(yǎng)7d，得液體菌種；三、將液體菌種用磁力攪拌器打碎并稀釋250倍，然后取15ml接種到富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基中，薄膜封口后在溫度為22°C、濕度為60%的條件下暗培養(yǎng)8d，得菌絲體，然后置于光照下培養(yǎng)至子實(shí)體成熟， 然后繼續(xù)培養(yǎng)至子座生長(zhǎng)到8cm長(zhǎng)且表面出現(xiàn)橘黃色粉末狀物質(zhì)，進(jìn)行采收，即完成富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)；其中步驟三中富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和60ml的營(yíng)養(yǎng)液組成，400ml的瓶裝量為1/3 ；所述五味子粉末的制備將五味子果粉碎后過(guò)20目篩；所述營(yíng)養(yǎng)液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氫鉀、4g的硫酸鎂、 200g的土豆液、Ig的維生素Bl和余量的水組成；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min ；步驟三中光照的時(shí)間為llh。本實(shí)施方式步驟一中北蟲草菌株玉豐一號(hào)，購(gòu)買自哈爾濱玉豐菌業(yè)有限責(zé)任公
司ο本實(shí)施方式中培養(yǎng)所得富含五味子有效成分的北蟲草，采用HPLC法測(cè)定北蟲草中腺苷和蟲草素的含量步驟如下1、儀器與試藥FL2200高效液相色譜儀，F(xiàn)L2200紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器，Venusil XBP Cw色譜柱，P-20型移液槍，KQ100-DE型超聲波清洗機(jī)，PL303電子精密天平；腺苷對(duì)照品(批號(hào) 110879-200202，中國(guó)藥品生物制品檢定所)、蟲草素對(duì)照品(批號(hào)858_200202，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇為色譜純；2、方法色譜柱Venusil XBP-Q8柱(柱4. 6匪X 250匪，5 μ m，USA)；流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸(185 14 1)；流速=ImLiirT1 ；柱溫25°C ；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm;進(jìn)樣量=IOyL;3、對(duì)照品溶液的制備精密稱取腺苷對(duì)照品lmg，蟲草素lmg，以甲醇分別制成質(zhì)量濃度為lmg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；4、供試品溶液制備精密稱取本實(shí)施方式培養(yǎng)的北蟲草樣品0. 5g，加入5mL甲醇，超聲提取60min后取出，冷卻，以該溶劑補(bǔ)足減失的溶劑，以0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，即為供試品溶液；5、測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液10 μ L，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算
含量；6、結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示，本實(shí)施方式中培養(yǎng)所得富含五味子有效成分的北蟲草，在與腺苷、蟲草素對(duì)照品保留時(shí)間相同的位置上含有相同的物質(zhì)。采用HPLC法測(cè)定北蟲草中五味子的有效成分含量步驟如下a、色譜條件色譜柱VenusilXBP-C18 柱(柱 4. 6讓X 250讓，5 μ m，USA)；流動(dòng)相甲醇-乙腈-水(32 38 30)；流速=ImL · mirT1 ；柱溫:25°C ；檢測(cè)波長(zhǎng):250nm ；進(jìn)樣量:10yL；b、對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素及五味子乙素對(duì)照品適量，以甲醇分別制成質(zhì)量濃度均為lmg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；C、供試品溶液的制備取本實(shí)施方式培養(yǎng)的北蟲草2g，精密稱定，加入90%甲醇5mL，超聲提取60min后取出，冷卻，稱定重量，用90 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，用0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；d、樣品測(cè)定取對(duì)照品溶液和供試品溶液以0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾后，分別精密吸取10 μ L進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量；e、結(jié)果如圖4-5所示，本實(shí)施方式中培養(yǎng)所得富含五味子有效成分的北蟲草，在與五味子醇甲及五味子酯甲對(duì)照品保留時(shí)間相同的位置上含有相同的物質(zhì)，證明按本實(shí)施方式中的培養(yǎng)方法生產(chǎn)的北蟲草中含有五味子的有效成分五味子醇甲及五味子酯甲，因此在服用本實(shí)施方式中培養(yǎng)所得富含五味子有效成分的北蟲草時(shí)可以同時(shí)也服用了五味子，從而起到簡(jiǎn)化了北蟲草與五味子的配伍應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，其特征在于富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，按以下步驟進(jìn)行一、將北蟲草菌株玉豐一號(hào)接種到PDA固體培養(yǎng)基上，在23°C下暗培養(yǎng)7d，得到活化的菌種；二、將活化好的菌種切成IcmX Icm的菌塊接種到 300ml的液體種子培養(yǎng)基中，在溫度為23°C、120r/min的條件下暗培養(yǎng)7d，得液體菌種；三、 將液體菌種用磁力攪拌器打碎并稀釋250倍，然后取15ml接種到富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基中，薄膜封口后在溫度為22°C、濕度為55% 60%的條件下暗培養(yǎng)6 9d，得菌絲體，然后置于光照下培養(yǎng)至子實(shí)體成熟，然后繼續(xù)培養(yǎng)至子座生長(zhǎng)到4 8cm長(zhǎng)且表面出現(xiàn)橘黃色粉末狀物質(zhì)，進(jìn)行采收，即完成富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)；其中步驟三中富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基由40g的大米、0. 3g的五味子粉末和 60ml的營(yíng)養(yǎng)液組成，400ml的瓶裝量為1/4 1/3 ；所述五味子粉末的制備將五味子果粉碎后過(guò)20目篩；所述營(yíng)養(yǎng)液每L由20g的蛋白胨、20g的葡萄糖、5g的磷酸二氫鉀、4g的硫酸鎂、200g的土豆液、Ig的維生素Bl和余量的水組成；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml，pH自然，121°C高壓滅菌30min ；步驟三中光照的時(shí)間為10 12h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟一中PDA固體培養(yǎng)基由200g的土豆液、20g的葡萄糖、18g的瓊脂和IOOOml的水組成，PH自然；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至 1000ml, pH 自然，121°C高壓滅菌 30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟二中液體種子培養(yǎng)基每L由200g的土豆液、20g的葡萄糖、Ig的硫酸鎂、Ig磷酸二氫鉀和余量的水組成，PH自然；所述土豆液的制備200g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30min，紗布過(guò)濾后補(bǔ)足至1000ml, pH自然，121°C高壓滅菌30min。
全文摘要
一種富含五味子有效成分的北蟲草的培養(yǎng)方法，它涉及一種北蟲草的培養(yǎng)方法。它簡(jiǎn)化了中醫(yī)配伍用藥，提高了北蟲草的利用率。方法一、活化菌種；二、制備液體菌種；三、液體菌種打碎并稀釋，接種到富含五味子的北蟲草固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，得菌絲體，然后置于光照下培養(yǎng)至子實(shí)體成熟，然后繼續(xù)培養(yǎng)至子座生長(zhǎng)到4～8cm長(zhǎng)且表面出現(xiàn)橘黃色粉末狀物質(zhì)，進(jìn)行采收即完成。本發(fā)明通過(guò)五味子中的成分與北冬蟲夏草生長(zhǎng)代謝間的相互作用起到提高腺苷和蟲草素的含量，同時(shí)又產(chǎn)生了具有五味子藥效成分的北冬蟲夏草子實(shí)體，從而起到在使用北蟲草的同時(shí)配伍了五味子，簡(jiǎn)化了中醫(yī)學(xué)中北蟲草與五味子配伍的方法，提高了北蟲草的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。
文檔編號(hào)C05G3/00GK102224790SQ20111007850
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者張文艷, 楊鵬, 王雙平, 王淑華, 袁斯文 申請(qǐng)人:王淑華