專利名稱：一種蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型的制備方法
一種蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有害生物的生物防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是通過省略殺蟲蛋白的提取和芽胞分 離程序，直接將礦物加到發(fā)酵液中，伴胞晶體堿解生成的活性殺蟲蛋白被礦物載體吸附，得 到含有芽胞的蘇云金桿菌殺蟲蛋白吸附復(fù)合劑型。
背景技術(shù)：
蘇云金桿菌(feciBm thuringiensis,簡稱Bt)是一種近緣于臘狀芽胞桿菌、產(chǎn)生芽 胞和伴胞晶體、能寄生于昆蟲體內(nèi)引起昆蟲發(fā)病的細(xì)菌，1938年法國出現(xiàn)了第一個蘇云金 桿菌制劑，20世紀(jì)中期實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，其產(chǎn)量占生物殺蟲劑總量的97%，成為當(dāng)前世界 上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的一種生物殺蟲劑，對鱗翅目、膜翅目、直翅目、雙翅目、鞘翅目等數(shù) 百種昆蟲有防治效果。然而，蘇云金桿菌制劑存在持效期短，防治效果易受陽光、溫度、濕 度、雨水等外界氣候和生態(tài)條件制約等缺點(diǎn)，制劑貯藏穩(wěn)定性差，田間殘效期短。從實(shí)際應(yīng) 用效果上看，經(jīng)過2-3天的日光照射，伴胞晶體即基本上失去活性。蘇云金芽胞桿菌田間應(yīng) 用殘效期短，已成為制約該殺蟲劑發(fā)展的瓶頸，如何提高其殺蟲效果是蘇云金桿菌科研單 位和生產(chǎn)企業(yè)所共同面臨的難題。目前延長殘效期的方法主要有添加紫外線吸收劑、制備 微膠囊包被、與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配，具有一定的實(shí)際效果，但尚未成為一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、高效兼顧 的理想手段。蘇云金桿菌商業(yè)制劑是由伴胞晶體、芽胞和填料組成，其中伴胞晶體又稱δ 內(nèi)毒素，是蘇云金桿菌制劑的主要?dú)⑾x成分。伴胞晶體是否會在環(huán)境中積累與以下三種因 素有關(guān)(1)使用的濃度；(2)昆蟲消耗的速度；(3)紫外光及土壤、作物表面微生物群對 其鈍化和降解的速度。上述三種因素中，環(huán)境降解是蘇云金桿菌制劑活性下降的主要原因。 研究發(fā)現(xiàn)，伴胞晶體酶解后釋放的活性殺蟲蛋白很容易被土壤礦物顆粒吸附，而且一旦吸 附完成，Bt殺蟲蛋白就會對微生物分解產(chǎn)生抗性，殺蟲活性持續(xù)的時間顯著延長。吸附態(tài) Bt蛋白殺蟲活性提高、持效期延長的性質(zhì)為蘇云金桿菌長效制劑研究提供了新思路。為此， 國內(nèi)有專利(ZL200510015^2. 3)提出了利用土壤礦物吸附固定殺蟲蛋白的方法，使之能夠 抵御陽光、微生物和酶的降解。實(shí)踐證明，這種吸附劑型具有活性高、持效期長的特點(diǎn)，但 這種劑型是以蘇云金桿菌伴胞晶體釋放的原毒素為唯一殺蟲成分，不含芽胞，因而缺乏芽 胞的增效作用。其次，原毒素(分子量130 kDa)的殺蟲毒力與活性殺蟲蛋白(分子量65-70 kDa)相當(dāng)，而分子量卻比后者高出了一倍，空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致原毒素在土壤礦物上的負(fù)載 量低于活性殺蟲蛋白。經(jīng)實(shí)驗(yàn)計算，原毒素在土壤礦物上的飽和吸附量僅為活性殺蟲蛋白 的71. 0%-90. 7%。原毒素蛋白在礦物載體上吸附量偏低，必然影響吸附制劑的單位質(zhì)量效 價。
為了提高蘇云金桿菌吸附劑型的效價和降低制造成本，申請人在長期研究中發(fā) 現(xiàn)，將蘇云金桿菌發(fā)酵液中的伴胞晶體和芽胞不經(jīng)洗滌直接堿溶，得到分子量較低的活性 殺蟲蛋白，生成的殺蟲蛋白被預(yù)先加入的礦物載體吸附，不僅提高了殺蟲蛋白在礦物載體 上的吸附量，而且發(fā)揮了芽胞的增效作用，使吸附制劑的效價大幅度提高。由于省去了胞晶 混合物的洗滌、離心分離等步驟，產(chǎn)品的制備成本降低。

發(fā)明內(nèi)容3本發(fā)明的目的在于改進(jìn)現(xiàn)有蘇云金桿菌吸附劑型的制備方法，通過簡化原毒素的提取 制備程序，直接對發(fā)酵液中的伴胞晶體堿解，得到降解的活性殺蟲蛋白。
本發(fā)明公開了這種蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型的制備方法，其特征 在于按照下列步驟操作(1)采用SDS-PAGE電泳法對蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中的伴胞晶體進(jìn)行含量測定，計算 發(fā)酵液中殺蟲蛋白總量；(2)取微米級礦物顆粒用水配置成重量與體積比為5.0%—20. 0%的懸浮液，然后按照 礦物殺蟲蛋白的質(zhì)量比=10:廣1:15的比例將礦物懸液加入到蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中；(3)將步驟(2)得到的蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液升溫至37-60°C，用濃度lmol/LNaOH溶 液調(diào)節(jié)PH至11一 12，溶解4一 6 h ；(4)將步驟(3)得到的溶解液用濃度lmol/LHCl溶液調(diào)節(jié)pH至6_8，并緩慢降至 O0C -:35°C，繼續(xù)攪拌吸附1-10 h ；(5)將步驟(4)得到的吸附懸浮液進(jìn)行離心濃縮，脫出上清液，即得到蘇云金桿菌殺蟲 蛋白和芽胞的吸附復(fù)合劑型，冷凍保存。
所述礦物顆粒是2:1型層狀礦物蒙脫土或累托石，2:1型層鏈狀礦物海泡石或凹 凸棒土，或1:1型非膨脹型礦物高嶺石中的一種或兩種以上的混合物。
本發(fā)明制備蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型方法簡便，成本低，省去了 蘇云金桿菌胞晶混合物用NaCl溶液和無菌去離子水洗滌過程，實(shí)現(xiàn)了活性殺蟲蛋白制備 與吸附的同步進(jìn)行，所得到的吸附復(fù)合劑型具有以下特點(diǎn)(1)吸附量大。活性殺蟲蛋白的分子量只有原毒素的二分之一，吸附時所遇到的空間位 阻小，所以吸附量高。
(2)殺蟲活性高。蛋白酶對蘇云金桿菌原毒素蛋白的降解是從C端開始的，最后得 到一段分子量在65000-70000的N端片段。這個片段對蛋白酶的水解具有很高的抗性，可以 穩(wěn)定存在并保持了原毒素的活性。吸附量的增加提高了單位質(zhì)量吸附劑的殺蟲活力。此外， 由于芽胞的增效作用，活性殺蟲蛋白吸附制劑的殺蟲活性較原毒素吸附劑型有了進(jìn)一步提 高。以蒙脫土、高嶺土、海泡石、累托石、凹凸棒土為吸附載體的活性殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù) 合劑型的殺蟲效價(三齡棉鈴蟲幼蟲)分別為132450、92379、74627、117647、12133 IU/mg， 而原毒素被上述礦物吸附后的殺蟲效價(三齡棉鈴蟲幼蟲)分別為106382、67682、67001、 80972、10402 IU/mg，前者活性比后者分別提高 24. 5%, 36. 5%, 11. 4%,45. 3% 和 16. 6%。
具體實(shí)施方式本發(fā)明提出的一種蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型的制備方法，是在蘇云金 桿菌發(fā)酵液中預(yù)先加入微米級礦物吸附劑，然后直接加堿溶解伴胞晶體，產(chǎn)生的活性殺蟲 蛋白同時被礦物載體吸附，實(shí)現(xiàn)對活性殺蟲蛋白的負(fù)載固定?；钚詺⑾x蛋白與土壤礦物顆 粒的質(zhì)量比為:10:1 1:15 (質(zhì)量比)，在溫度0°c-35°c，攪拌下吸附1-10小時。
上述的礦物顆?？梢允?:1型層狀礦物蒙脫土、累托石，2:1型層鏈狀礦物海泡石 和凹凸棒土，1 1型非膨脹型礦物高嶺石。
本發(fā)明蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型可以通過以下方法制備 (1)蘇云金桿菌活性殺蟲蛋白含量測定取蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液樣品，用SDS-PAGE電泳法對發(fā)酵液中的伴胞晶體進(jìn)行檢測，4以已知濃度的純伴胞晶體作為定量標(biāo)準(zhǔn)，計算發(fā)酵液中伴胞晶體含量。按照伴胞晶體與活 性殺蟲蛋白分子量的比值，推算發(fā)酵液中活性殺蟲蛋白含量。
(2)礦物吸附劑的配制與添加活性殺蟲蛋白含量與發(fā)酵液體積的乘積，即為堿解后產(chǎn)生的活性殺蟲蛋白總量，據(jù)此 可以計算出微米級礦物吸附劑的添加量。取微米級礦物顆粒用水配置成5. 0%—20. 0% (w/ ν)的懸浮液，然后按照礦物殺蟲蛋白=10:廣1:15 (質(zhì)量比)的比例將礦物懸液加入發(fā)酵液 中，攪拌均勻。
(3)伴胞晶體的堿解與活性殺蟲蛋白吸附將蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液在攪拌下升溫至37-60°C，緩慢滴加lmol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié) PH至11 一 12，維持4一6 h。期間如遇pH降低情況，則補(bǔ)加堿液。伴胞晶體降解產(chǎn)生的活 性殺蟲蛋白隨時被礦物載體吸附。堿解完成后，懸浮液用lmol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 6_8，并緩 慢降至0°C-35°C，繼續(xù)攪拌吸附1-10 h。降低溫度和降低體系pH可以增加活性殺蟲蛋白 的吸附量。
(4)吸附懸浮液的離心濃縮吸附懸浮液轉(zhuǎn)入離心管，于高速離心機(jī)上15000 r/min離心20min，去掉上清液，即為 蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型，冷凍保存。
實(shí)施例1 蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞蒙脫土吸附復(fù)合劑型取蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液1000 mL(固含量6. 5%，w/v),經(jīng)SDS-PAGE檢測殺蟲蛋白 0.51%。稱取蒙脫土 (粒徑< 2微米)30 g，加去離子水500 mL配成6% (w/v)的懸浮液。將 蒙脫土懸浮液在攪拌下加入蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中。水浴加熱發(fā)酵液使之升溫至37°C， 攪拌下緩慢滴加lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pHll —12，5 h后降溫至25°C，懸浮液用lmol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 6-7，繼續(xù)攪拌3 h。
將蘇云金桿菌吸附懸浮液裝入離心管，15000 r/min離心10 min，傾去上清液，得 蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞蒙脫土吸附復(fù)合劑型，效價13M50IU/mg。
實(shí)施例2 蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞高嶺土吸附復(fù)合劑型取蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液1000 mL(固含量6. 5%，w/v),經(jīng)SDS-PAGE檢測殺蟲蛋白 0. 51%。。 稱取高嶺土 (粒徑< 2微米)80 g，加去離子水1000 mL配成8% (w/v)的懸浮 液。將高嶺土懸浮液在攪拌下加入蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中。水浴加熱發(fā)酵液使之升溫 至60°C，攪拌下緩慢滴加lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pHll—12，4 h后降溫至20°C，懸浮液用 lmol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 7-8，繼續(xù)攪拌2 h。將吸附完成的懸浮液裝入離心管，15000 r/min 離心10 min，傾去上清液，得蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞高嶺土吸附復(fù)合劑型，效價92379 IU/mg。
實(shí)施例3 蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞海泡石吸附復(fù)合劑型取蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液1500 mL(固含量6. 8%，w/v),經(jīng)SDS-PAGE檢測殺蟲蛋 白0. 56%。稱取海泡石(粒徑< 2微米)117g，加去離子水1200 mL配成9. 75% (w/v)的懸 浮液。將海泡石懸浮液在攪拌下加入蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中。水浴加熱發(fā)酵液使之升溫 至50°C，攪拌下緩慢滴加lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pHll—12，5 h后降溫至20°C，懸浮液用 lmol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 7-8，繼續(xù)攪拌6 h。將吸附完成的懸浮液裝入離心管，15000 r/min 離心10 min，傾去上清液，得蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞海泡石吸附復(fù)合劑型，效價746275IU/mg。
實(shí)施例4 蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞累托石吸附復(fù)合劑型取蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液1500 mL (固含量6. 8%，w/v),經(jīng)SDS-PAGE檢測殺蟲蛋 白0. 56%。 稱取累托石(粒徑< 2微米)25g，加去離子水250 mL配成10% (w/v)的懸浮 液。將累托石懸浮液在攪拌下加入蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中。水浴加熱發(fā)酵液使之升溫 至45°C，攪拌下緩慢滴加lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pHll—12，5 h后降溫至15°C，懸浮液用 lmol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 6-7，繼續(xù)攪拌3 h。將吸附完成的懸浮液裝入離心管，15000 r/min 離心10 min，傾去上清液，得蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞累托石吸附復(fù)合劑型，效價117647 IU/mg。
實(shí)施例5 蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞凹凸棒土吸附復(fù)合劑型取蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液800 mL(固含量6.0%，w/v)，經(jīng)SDS-PAGE檢測殺蟲蛋白 0. 47%。稱取凹凸棒土 (粒徑< 2微米)11. 75g，加去離子水195 mL配成6. 0% (w/v)的懸 浮液。將凹凸棒土懸浮液在攪拌下加入蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中。水浴加熱發(fā)酵液使之升 溫至45°C，攪拌下緩慢滴加lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pHll —12，5 h后降溫至5°C，懸浮液 用lmol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 6_7，繼續(xù)攪拌3 h。將吸附完成的懸浮液裝入離心管，15000 r/ min離心10 min，傾去上清液，得蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞凹凸棒土吸附復(fù)合劑型，效價 96956 IU/mgο
蘇云金桿菌原毒素與活性殺蟲蛋白在同一種礦物上的吸附量比較見表1。
表1蘇云金桿菌原毒素和活性殺蟲蛋白吸附量比較
權(quán)利要求
1.一種蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型的制備方法，其特征在于按照下列步 驟操作(1)采用SDS-PAGE電泳法對蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中的伴胞晶體進(jìn)行含量測定，計算 發(fā)酵液中殺蟲蛋白總量；(2)取微米級礦物顆粒用水配置成重量與體積比為5.0%—20. 0%的懸浮液，然后按照 礦物殺蟲蛋白的質(zhì)量比=10:廣1:15的比例將礦物懸液加入到蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液中；(3)將步驟(2)得到的蘇云金芽胞桿菌發(fā)酵液升溫至37-60°C，用濃度lmol/LNaOH溶 液調(diào)節(jié)PH至11一 12，溶解4一6 h ；(4)將步驟(3)得到的溶解液用濃度lmol/LHCl溶液調(diào)節(jié)pH至6_8，并緩慢降至 O0C -:35°C，繼續(xù)攪拌吸附1-10 h ；(5)將步驟(4)得到的吸附懸浮液進(jìn)行離心濃縮，脫出上清液，即得到蘇云金桿菌殺蟲 蛋白和芽胞的吸附復(fù)合劑型，冷凍保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述礦物顆粒是2:1型層狀礦物蒙脫土或 累托石，2:1型層鏈狀礦物海泡石或凹凸棒土，或1:1型非膨脹型礦物高嶺石中的一種或兩 種以上的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型的制備方法。該方法是在蘇云金桿菌發(fā)酵液中預(yù)先加入微米級礦物吸附劑，然后直接加堿溶解伴胞晶體，產(chǎn)生的活性殺蟲蛋白同時被礦物載體吸附，實(shí)現(xiàn)對活性殺蟲蛋白的負(fù)載固定。本發(fā)明制備蘇云金桿菌殺蟲蛋白和芽胞吸附復(fù)合劑型方法簡便，成本低，省去了蘇云金桿菌胞晶混合物用NaCl溶液和無菌去離子水洗滌過程，實(shí)現(xiàn)了活性殺蟲蛋白制備與吸附的同步進(jìn)行。所得到的吸附復(fù)合劑型吸附量大，殺蟲活性高。此外，由于芽胞的增效作用，活性殺蟲蛋白吸附制劑的殺蟲活性較原毒素吸附劑型有了進(jìn)一步提高。
文檔編號A01N25/08GK102038006SQ201010588070
公開日2011年5月4日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者周學(xué)永, 董慶潔, 董建萍, 馬錦明 申請人:天津理工大學(xué)