專利名稱：一種草莓莖尖組培專用培養(yǎng)基及其生產(chǎn)脫毒苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組培育苗技術(shù)領(lǐng)域，具體說涉及一種草莓莖尖組培專用培養(yǎng)基及其生 產(chǎn)脫毒苗的方法。
背景技術(shù)：
草莓(Fragaria ananassa Ducde)是薔薇科草莓屬宿根性多年生常綠草本植物， 屬于多倍體，是一種靠匍匐莖進(jìn)行無性繁殖的作物，傳統(tǒng)種苗培育的方法是采用匍匐莖繁 殖的無性繁殖方式，效率較低，不利于優(yōu)良品種的推廣，而且極易感染病毒。我國已鑒定明 確的草莓病毒有四種，即草莓斑駁病毒(SMOV)、草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)、草莓皺縮病毒 (SCRV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)。種苗普遍感染病毒是草莓生產(chǎn)中的瓶頸問題，感染病毒的 草莓比未感染病毒的草莓長勢弱、抗性差、產(chǎn)量明顯下降，果品品質(zhì)與商品性狀變劣，嚴(yán)重 影響了這一名優(yōu)種植業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展。目前，解決草莓的病毒病主要是通過草莓脫毒組培技 術(shù)，即通過花藥組織培養(yǎng)、微莖尖組織培養(yǎng)等技術(shù)脫去病毒病原獲得無毒草莓再生植株，使 草莓種苗恢復(fù)品種原種優(yōu)良種性，以達(dá)到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)之目的。草莓的莖尖培養(yǎng)是獲得無病毒 植株的重要途徑。在莖尖培養(yǎng)過程中，應(yīng)根據(jù)外植體來源和生長狀況不同，對培養(yǎng)基中激 素濃度的大小及相互之間的配比進(jìn)行調(diào)整，從而得到某種材料及相應(yīng)外植體的最適組培方 法。紅顏草莓(又稱紅頰草莓，日本99號，紅臉頰)，是目前最優(yōu)秀的日本系列草莓。 紅顏草莓生長勢強(qiáng)，植株較高(25厘米)，結(jié)果株徑大，分生新莖能力中等，葉片大而厚，葉 柄淺綠色，基部葉鞘略呈紅色，匍匐莖粗，抽生能力中等，花序梗粗，分枝處著生一大一小兩 完全葉。每個花序4至5朵花，花瓣易落，不污染果實(shí)。該品種果個較大，最大可達(dá)100多 克，一般30至60克。果實(shí)圓錐形，種子黃而微綠，稍凹入果面，果肉橙紅色，質(zhì)密多汁，香味 濃香，糖度高，風(fēng)味極佳，果皮紅色，富有光澤，韌性強(qiáng)，果實(shí)硬度大，耐貯運(yùn)；但紅顏草莓育 苗不易，初代培養(yǎng)脫毒效果差，污染及玻璃化問題，初代莖尖萌發(fā)率和繁育系數(shù)低，移栽成 活率不高，繼代快繁培養(yǎng)過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)一種生長異常的試管苗即玻璃苗。表現(xiàn)出植株 矮小、葉色淺且皺縮，呈水晶樣透明或半透明水漬狀，莖葉變脆硬，易碎，嚴(yán)重影響繁殖率， 給生產(chǎn)造成很大損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種莖尖組培專用培養(yǎng)基。包括初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基 和生根培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一目的在于提供一種草莓莖尖組織培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法。一種草莓莖尖組織初代培養(yǎng)基，該初代培養(yǎng)基是含有濃度為0. 2 0. 5mg/L的 6-芐氨基嘌呤(BA)和濃度為0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基，也就是說是以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后向MS培養(yǎng)基中添加濃度為0. 2 0. 5mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA) 和濃度為0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸(NAA)；
上述初代培養(yǎng)基中還包含0. 02mg/L的赤霉素(GA3)或/和0. 3mg/L的激動素 (KT)；上述初代培養(yǎng)基中0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸(NAA)可以用0. 2mg/L的吲哚乙酸 (IAA)來代替。一種草莓莖尖組織繼代培養(yǎng)基，該繼代培養(yǎng)基是含有濃度為0. 2 0. 5mg/L的
6-芐氨基嘌呤(BA)的MS培養(yǎng)基；上述繼代培養(yǎng)基中還包括0. 2mg/L的吲哚乙酸(IAA)。一種草莓莖尖組織生根培養(yǎng)基，該生根培養(yǎng)基為1/2MS ；上述生根培養(yǎng)基還包含0. 1 0. 3mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0. 5 1. Omg/L的吲哚 乙酸(IAA)或0. 01 0. lmg/L的萘乙酸(NAA)。一種草莓莖尖組織培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，包括以下操作步驟(1)熱處理將無病健壯的日本紅顏草莓苗放入人工氣候箱中，一天中16小時在 40 41°C、有光照的條件下處理，其余18小時在35°C、黑暗條件下處理，持續(xù)變溫處理4_5 周；(2)材料的采集及消毒取步驟⑴熱處理后的草莓苗匍匐莖頂芽，進(jìn)行滅菌消毒 處理；(3)莖尖初代培養(yǎng)在解剖鏡下從滅菌消毒后的頂芽上切取0. 2-0. 5mm大小的莖 尖生長點(diǎn)，接種到上述的初代培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5-7天后，光照培養(yǎng)35-45天至分化出叢生 芽，其中，光照強(qiáng)度為1500-20001x，光照時間為10h/d，溫度25士2°C ；(4)繼代培養(yǎng)將初代培養(yǎng)分化出來的叢生芽轉(zhuǎn)接到上述繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng) 25-35天，光照強(qiáng)度為2000-30001x，光照時間為14h/d，溫度25士2°C，繼代培養(yǎng)代數(shù)控制在 5-8 代；(5)生根培養(yǎng)將經(jīng)繼代培養(yǎng)的草莓苗轉(zhuǎn)到上述生根培養(yǎng)基中促使其生根，生根 培養(yǎng)20-35天；(6)草莓苗的馴化及移栽將生根培養(yǎng)后的瓶栽草莓苗置于待生長條件下煉苗
7-10天，移栽時開蓋鍛煉l-2d，然后將其移栽至含有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中。所述移栽具體為將生根培養(yǎng)后的瓶栽草莓苗置于待生長條件下煉苗7-10天，移 栽時開蓋鍛煉l-2d，然后把草莓苗取出，用水沖掉培養(yǎng)基，用1000倍百菌清浸泡5min后扦 插到8X8營養(yǎng)缽中，所用基質(zhì)為袋裝富養(yǎng)基質(zhì)，扦插完畢后覆膜保濕7-10天，保持相對濕 度80%以上，溫度30°C以上加蓋遮陽網(wǎng)，7-10天后逐步撤膜。步驟⑵中所述頂芽為2_3cm長，滅菌和消毒方法為清水沖洗2_3小時后，依次 用75%酒精消毒30s，5%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，然后再用無菌水沖洗5_8次。所述0. 2-0. 5mm大小的莖尖生長點(diǎn)帶2_3個葉原基。步驟(4)中繼代培養(yǎng)達(dá)到第5代后，包括第5代，使用的繼代培養(yǎng)基中硝酸銨濃度 降為原濃度的1/2-1/4，繼代培養(yǎng)基中其他成分不變。步驟(6)所述基質(zhì)為本領(lǐng)域常規(guī)使用的基質(zhì)配方，比如草碳、蛭石和珍珠巖的混 合物。所使用的培養(yǎng)基的pH為5. 7-5. 8。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的草莓脫毒快繁體系方便實(shí)用、脫毒效果好、繁殖系數(shù)
4高、遺傳穩(wěn)定性好而且再生率高，具體如下①本發(fā)明的組培方法步驟(2)采取的熱處理結(jié) 合莖尖培養(yǎng)脫毒，使草莓苗的脫毒效果達(dá)到100% ；②在初代培養(yǎng)過程中往往會褐化嚴(yán)重， 大大降低誘導(dǎo)萌發(fā)率，本發(fā)明通過暗培養(yǎng)5-7天，同時降低培養(yǎng)溫度來防止褐化，褐化比例 明顯減少；③繼代培養(yǎng)中玻璃化是普遍嚴(yán)重的問題，在這方面本發(fā)明主要是通過降低銨態(tài) 氮與控制代數(shù)同時嚴(yán)格控制溫度來解決，一般繼代培養(yǎng)5代以后，培養(yǎng)基中的大量元素硝 酸銨的濃度降為原濃度的1/2-1/4，一般繼代控制在8代以內(nèi)，本發(fā)明的繁育系數(shù)為5-10 ； ④采用本發(fā)明初代培養(yǎng)基對紅顏草莓莖尖進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，其莖尖萌發(fā)率為50-65%，而 通常情況下莖尖萌發(fā)率僅為40%左右；⑤采用本發(fā)明生根培養(yǎng)基對紅顏草莓莖尖進(jìn)行生 根培養(yǎng)，其誘導(dǎo)生根率90%以上，平均根數(shù)5-10條，根長3-8cm不等；⑥本發(fā)明的草莓苗的 移栽成活率為95%以上。⑦將本發(fā)明方法獲得的草莓苗進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)種植，結(jié)果表明，草 莓畝產(chǎn)量達(dá)到3500Kg/畝。本發(fā)明方法可作為商業(yè)用途的草莓苗脫毒方法在生產(chǎn)上的大規(guī) 模使用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1含有不同激素的初代培養(yǎng)基培養(yǎng)紅顏草莓莖尖的實(shí)驗(yàn)將無病健壯的日本紅顏草莓苗放入人工氣候箱中，一天中16小時在40°C、有光照 的條件下處理，其余18小時在35°C、黑暗條件下處理，持續(xù)變溫處理4周；然后獲取頂芽 2-3cm長，清水沖洗2-3小時后，依次用75%酒精消毒30s，5%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，然 后再用無菌水沖洗5-8次；在解剖鏡下切取0. 2-0. 5mm大小的莖尖生長點(diǎn)，接種到上述的 初代培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)5天后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001x，光照時間為10h/d，溫度 25士2°C ；各初代培養(yǎng)基設(shè)兩個重復(fù)，每個處理接種莖尖數(shù)為50個，莖尖萌發(fā)率統(tǒng)計以莖尖 生長點(diǎn)接種后40天分化出的叢生芽為準(zhǔn)，莖尖萌發(fā)率％ =(萌發(fā)出芽的莖尖數(shù)/接種總莖 尖數(shù))X 100%，結(jié)果見表1。配制初代培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，向其中添加不同濃度的激素(見表1)，共 四種培養(yǎng)基，PH調(diào)節(jié)至5. 7-5. 8，高壓滅菌20min ；表1含有不同激素的初代培養(yǎng)基及其莖尖萌發(fā)率
權(quán)利要求
一種草莓莖尖組織初代培養(yǎng)基，其特征在于，該初代培養(yǎng)基是含有濃度為0.2～0.5mg/L的6 芐氨基嘌呤和濃度為0.1 0.2mg/L的萘乙酸的MS培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖組織初代培養(yǎng)基，其特征在于，所述初代培養(yǎng)基中 還包含0. 02mg/L的赤霉素或/和0. 3mg/L的激動素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖組織初代培養(yǎng)基，其特征在于，所述初代培養(yǎng)基中 0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸用0. 2mg/L的吲哚乙酸來代替。
4.一種草莓莖尖組織繼代培養(yǎng)基，其特征在于，該繼代培養(yǎng)基是含有濃度為0. 2 0. 5mg/L的6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草莓莖尖組織繼代培養(yǎng)基，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基中 還包括0. 2mg/L的吲哚乙酸。
6.一種草莓莖尖組織生根培養(yǎng)基，其特征在于，該生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的草莓莖尖組織生根培養(yǎng)基，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基還 包含0. 1 0. 3mg/L的吲哚丁酸、0. 5 1. Omg/L的吲哚乙酸或0. 01 0. lmg/L的萘乙酸。
8.—種草莓莖尖組織培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征在于，包括以下操作步驟(1)熱處理將無病健壯的日本紅顏草莓苗放入人工氣候箱中，一天中16小時在40 41°C、有光照的條件下處理，其余18小時在35°C、黑暗條件下處理，持續(xù)變溫處理4-5周；(2)材料的采集及消毒取步驟(1)熱處理后的草莓苗匍匐莖頂芽，進(jìn)行滅菌消毒處理；(3)莖尖初代培養(yǎng)在解剖鏡下從滅菌消毒后的頂芽上切取0.2-0. 5mm大小的莖尖生 長點(diǎn)，接種到上述的初代培養(yǎng)基上中，暗培養(yǎng)5-7天后，光照培養(yǎng)35-45天至分化出叢生芽， 其中，光照強(qiáng)度為1500-20001x，光照時間為10h/d，溫度25士2°C ；(4)繼代培養(yǎng)將初代培養(yǎng)分化出來的叢生芽轉(zhuǎn)接到上述繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天， 光照強(qiáng)度為2000-30001x，光照時間為14h/d，溫度25士2°C，繼代培養(yǎng)代數(shù)控制在5_8代；(5)生根培養(yǎng)將經(jīng)繼代培養(yǎng)的草莓苗轉(zhuǎn)到上述生根培養(yǎng)基中促使其生根，生根培養(yǎng) 20-35 天；(6)草莓苗的馴化及移栽將生根培養(yǎng)后的瓶栽草莓苗置于待生長條件下煉苗7-10 天，移栽時開蓋鍛煉l-2d，然后將其移栽至含有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的草莓莖尖組織培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征在于，所述移 栽具體為將生根培養(yǎng)后的瓶栽草莓苗置于待生長條件下煉苗7-10天，移栽時開蓋鍛煉 l-2d，然后把草莓苗取出，用水沖掉培養(yǎng)基，用1000倍百菌清浸泡5min后扦插到8 X 8營養(yǎng) 缽中，所用基質(zhì)為袋裝富養(yǎng)基質(zhì)，扦插完畢后覆膜保濕7-10天，保持相對濕度80%以上，溫 度30°C以上加蓋遮陽網(wǎng)，7-10天后逐步撤膜。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的草莓莖尖組織培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征在于，步驟 (4)中繼代培養(yǎng)達(dá)到第5代后使用的繼代培養(yǎng)基中硝酸銨濃度降為原濃度的1/2-1/4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種屬于組培育苗技術(shù)領(lǐng)域的草莓莖尖組培專用培養(yǎng)基。包括初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。所述初代培養(yǎng)基是向MS培養(yǎng)基中添加濃度為0.2～0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤和濃度為0.1-0.2mg/L的萘乙酸；所述繼代培養(yǎng)基是向MS培養(yǎng)基中添加濃度為0.2～0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤；所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。本發(fā)明還公開了利用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)草莓莖尖組織生產(chǎn)脫毒苗的方法，包括草莓苗的熱處理、取材滅菌、初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)、和生根培養(yǎng)基和移栽等步驟。本發(fā)明的草莓脫毒快繁體系方便實(shí)用、脫毒效果好、繁殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定性好而且再生率高，可作為商業(yè)用途在生產(chǎn)上的大規(guī)模使用。
文檔編號A01H4/00GK101946702SQ20101025287
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者王立府, 路河, 郭仰東, 陳懷勐, 高麗 申請人:北京金六環(huán)農(nóng)業(yè)園