專(zhuān)利名稱(chēng)：草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種農(nóng)業(yè)育苗技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法。
背景技術(shù)：
草莓(Fragaria ananassa Ducde)是薔薇科草莓屬宿根性多年生常綠草本植物，是一種靠匍匐莖進(jìn)行無(wú)性繁殖的作物，體內(nèi)病毒積累逐年增加，病毒病發(fā)生嚴(yán)重。感染了病毒的草莓生長(zhǎng)緩慢、葉皺縮、果子一年比一年小、畸形、品質(zhì)差，一般減產(chǎn)30％-80％，并逐年加重。在我國(guó)已造成損失的草莓病毒病主要有草莓斑駁病毒(SmoV)，草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)，草莓鑲脈病毒(SVBV)，草莓皺縮病毒(SCrV)等四種。據(jù)報(bào)道這四種病毒總侵染率為80.2％，其中單種病毒侵染率為41.6％，2種以上的病毒復(fù)合侵染率為38.6％。對(duì)于病毒病，目前還沒(méi)有藥劑可以治理。因此，培育無(wú)病毒母本苗，栽培無(wú)病毒苗木，是防治草莓病毒病的根本對(duì)策。目前，世界上培育草莓無(wú)毒苗有三種方法熱治療法、花藥培養(yǎng)法和莖尖培養(yǎng)法。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?3110849.0，名稱(chēng)為植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)草莓苗的方法，該專(zhuān)利自述為提供了一種采用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)草莓苗的方法。該方法是在MB培養(yǎng)基上培養(yǎng)草莓葉片，再生草莓幼苗，得到草莓無(wú)性系。草莓再生率達(dá)到97.0％以上，生根率達(dá)100％，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。該項(xiàng)技術(shù)不足之處在于利用葉片建立無(wú)性繁殖體系，必然要經(jīng)過(guò)愈傷組織這個(gè)階段，難免會(huì)產(chǎn)生大量變異，雖然再生率很高，但培養(yǎng)出來(lái)的草莓苗不能保持其種性，不符合生產(chǎn)需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，使其建立一套既能保持原始品種優(yōu)良種性，不發(fā)生變異，又能脫除病毒，提供健壯脫毒苗的草莓無(wú)性繁殖供種體系，解決常規(guī)大田利用匍匐莖繁種病毒累集的問(wèn)題。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟(1)取材滅菌利用春秋兩季采集5cm長(zhǎng)的草莓匍匐莖頂芽，進(jìn)行滅菌處理；(2)莖尖培養(yǎng)在雙筒解剖鏡下剝?nèi)∏o尖，大小為0.2mm左右，將切下的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培養(yǎng)基中，在25℃、光強(qiáng)30μmol·m2·ws-1、光照時(shí)間16hr/天的條件下培養(yǎng)，生長(zhǎng)出叢芽；(3)快速繁殖將叢芽整塊或切成小塊轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(4)試管苗生根經(jīng)過(guò)幾代增殖培養(yǎng)后，將草莓大苗從叢生芽塊上切下，轉(zhuǎn)接到1/2MS培養(yǎng)基上促使生根，其余的繼續(xù)轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(5)試管苗馴化生根苗經(jīng)馴化培養(yǎng)后移栽到苗床，作為在隔離室中繁殖生產(chǎn)用苗的原原種苗。
本發(fā)明采用以莖尖培養(yǎng)的方法進(jìn)行脫毒。以莖尖直接誘導(dǎo)叢生芽，并形成完整植株，這樣的過(guò)程發(fā)生變異的概率小，可以放心地應(yīng)用于生產(chǎn)。病毒粒子是通過(guò)植物體的疏導(dǎo)組織在體內(nèi)傳播，而植物的莖尖部分是一團(tuán)旺盛分裂的細(xì)胞，還沒(méi)有進(jìn)入器官分化階段，及還不存在疏導(dǎo)組織，因此，植物的莖尖部分不含病毒粒子。將該部分細(xì)胞切割下來(lái)，在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得的植株就不含病毒。應(yīng)用這種方法，可以在實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)大量草莓脫毒苗，不受季節(jié)的限制，脫毒苗經(jīng)簡(jiǎn)單馴化就可以應(yīng)用于生產(chǎn)，省時(shí)省力。
本發(fā)明獲得的草莓試管苗，用電子顯微鏡鑒定，沒(méi)有或很少觀察到病毒顆粒，與常規(guī)方法繁殖種苗相比，病毒顆粒大為減少；用野生草莓小葉嫁接法鑒定，可以明顯看到嫁接常規(guī)種苗的野生草莓葉片表現(xiàn)為皺縮，而嫁接脫毒苗的野生草莓葉片仍然平整，無(wú)皺縮表現(xiàn)。大田生產(chǎn)試驗(yàn)表明利用脫毒苗進(jìn)行生產(chǎn)，產(chǎn)量比常規(guī)苗作種苗的生產(chǎn)田高出30％以上，并且品質(zhì)有明顯改善。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合本發(fā)明的內(nèi)容提供以下實(shí)施例，具體實(shí)施如下1.取材滅菌自田間選取健壯草莓母株上生長(zhǎng)充實(shí)而小葉尚為展開(kāi)的匍匐莖頂端5cm長(zhǎng)的頂芽，用自來(lái)水沖洗2h后，在超凈臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理。先用小鑷子將匍匐莖的外部大葉摘除，再用70％酒精快速處理30s，用飽和漂白精液浸泡15min，然后用無(wú)菌水沖洗3遍。
2.莖尖培養(yǎng)在雙筒解剖鏡下由外向內(nèi)逐層剝?nèi)ビ兹~，直至閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來(lái)，切取0.2mm大小莖尖接種到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)容器為100ml的玻璃瓶，培養(yǎng)基放30ml/瓶，每瓶接種3個(gè)材料，接種后移至培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，光照30μmol·m-2·s-1，16h/天，溫度25℃(下同)。大約10天后莖尖轉(zhuǎn)綠，30天后形成幼小叢芽，60天后叢芽長(zhǎng)大。
3.快速繁殖將將叢芽整塊轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)容器為250ml帶塞三角塑料瓶。增殖時(shí)，繼代組培苗株數(shù)為3株/瓶，增殖培養(yǎng)過(guò)程中每40天繼代一次。
4.試管苗生根經(jīng)過(guò)幾代增殖培養(yǎng)后，將生長(zhǎng)健壯的組培苗轉(zhuǎn)接到1/2MS生根培養(yǎng)基上。生根時(shí)使用100ml三角瓶。
5.試管苗馴化生根培養(yǎng)20天后，將生根試管苗瓶口打開(kāi)，培養(yǎng)室內(nèi)放置3天取出后洗凈其根部的培養(yǎng)基，移栽到蛭石上(嚴(yán)格隔離的防蟲(chóng)網(wǎng)室中)，溫度保持在25℃，相對(duì)濕度90％，適當(dāng)遮蔭，后期逐漸通風(fēng)，增加光照，常規(guī)管理。
試管苗在蛭石上移栽成活后，在草莓基地進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)，以常規(guī)繁殖苗為對(duì)照。結(jié)果表明應(yīng)用脫毒苗，草莓畝產(chǎn)達(dá)到3000公斤/畝左右，草莓產(chǎn)量比常規(guī)苗增加25％-40％，最高的增加50％以上。
權(quán)利要求
1.一種草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取材滅菌利用春秋兩季采集草莓匍匐莖頂芽，進(jìn)行滅菌處理；(2)莖尖培養(yǎng)在雙筒解剖鏡下剝?nèi)∏o尖，將切下的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長(zhǎng)出叢芽；(3)快速繁殖將叢芽整塊或切成小塊轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(4)試管苗生根經(jīng)過(guò)幾代增殖培養(yǎng)后，將草莓大苗從叢生芽塊上切下，轉(zhuǎn)接到1/2MS培養(yǎng)基上促使生根，其余的繼續(xù)轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(5)試管苗馴化生根苗經(jīng)馴化培養(yǎng)后移栽到苗床，作為在隔離室中繁殖生產(chǎn)用苗的原原種苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征是，所述的步驟(1)，取材滅菌具體如下選取健壯草莓母株上生長(zhǎng)充實(shí)而小葉尚為展開(kāi)的匍匐莖頂端5cm長(zhǎng)的頂芽，用自來(lái)水沖洗2h后，在超凈臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理，先用小鑷子將匍匐莖的外部大葉摘除，再用70％酒精快速處理30s，用飽和漂白精液浸泡15min，然后用無(wú)菌水沖洗3遍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征是，所述的步驟(2)，莖尖培養(yǎng)具體如下在雙筒解剖鏡下由外向內(nèi)逐層剝?nèi)ビ兹~，直至閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來(lái)，切取0.2mm大小莖尖接種到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)容器為100ml的玻璃瓶，培養(yǎng)基放30ml/瓶，每瓶接種3個(gè)材料，接種后移至培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，光照30μmol·m-2·s-1，16h/天，溫度25℃，生長(zhǎng)出叢芽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征是，所述的步驟(3)，快速繁殖具體如下將將叢芽整塊轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L培養(yǎng)基上，培養(yǎng)容器為250ml帶塞三角塑料瓶，增殖時(shí)，繼代組培苗株數(shù)為3株/瓶，增殖培養(yǎng)過(guò)程中每40天繼代一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征是，所述的步驟(4)，試管苗生根具體為經(jīng)過(guò)幾代增殖培養(yǎng)后，將生長(zhǎng)健壯的組培苗轉(zhuǎn)接到1/2MS生根培養(yǎng)基上，生根時(shí)使用100ml三角瓶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，其特征是，所述的步驟(4)，試管苗馴化具體如下生根培養(yǎng)20天后，將生根試管苗瓶口打開(kāi)，培養(yǎng)室內(nèi)放置3天取出后洗凈其根部的培養(yǎng)基，移栽到蛭石上，溫度保持在25℃，相對(duì)濕度90％，適當(dāng)遮蔭，后期逐漸通風(fēng)，增加光照，常規(guī)管理。
全文摘要
一種農(nóng)業(yè)育苗技術(shù)領(lǐng)域的草莓莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)脫毒苗的方法，步驟為(1)取材滅菌利用春秋兩季采集草莓匍匐莖頂芽，進(jìn)行滅菌處理；(2)莖尖培養(yǎng)在雙筒解剖鏡下剝?nèi)∏o尖，大小為0.2mm，將切下的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)接種到事先配好的MS+BA0.5mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長(zhǎng)出叢芽；(3)快速繁殖將叢芽整塊或切成小塊轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(4)試管苗生根經(jīng)過(guò)幾代增殖培養(yǎng)后，將草莓大苗從叢生芽塊上切下，轉(zhuǎn)接到1/2MS培養(yǎng)基上促使生根，其余的繼續(xù)轉(zhuǎn)接到MS+BA0.2mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(5)試管苗馴化生根苗經(jīng)馴化培養(yǎng)后移栽到苗床，作為在隔離室中繁殖生產(chǎn)用苗的原原種苗。利用本發(fā)明獲得的脫毒苗進(jìn)行生產(chǎn)，產(chǎn)量比常規(guī)苗作種苗的生產(chǎn)田高出30％以上，并且品質(zhì)有明顯改善。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1748478SQ20051003044
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月13日
發(fā)明者何歡樂(lè), 蔡潤(rùn), 潘俊松 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)