專利名稱：一種生姜脫毒苗的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)發(fā)明是一種涉及生姜脫毒苗的生產(chǎn)技術(shù)方法，專用于生姜脫毒苗的培育與快速繁殖，屬農(nóng)業(yè)高新技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生姜(Zingiber officiale Roscoe)為我國主要出口創(chuàng)匯蔬菜之一，是以根狀莖為產(chǎn)品器官和繁殖器官的無性繁殖作物，由于其生長發(fā)育未經(jīng)有性世代，病毒易在體內(nèi)積累，導致生長勢衰退，種性退化，抗逆性降低，病蟲害加重，產(chǎn)量品質(zhì)下降，嚴重制約了生姜產(chǎn)品在國際市場的競爭力。因此，培育生姜脫毒苗，恢復生姜種性，是提高生姜產(chǎn)量，改善生姜品質(zhì)的重要技術(shù)措施之一。
目前，利用莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒種苗，已廣泛應用于馬鈴薯、大蒜等無性繁殖作物。中國專利CN 1031637A“大量生產(chǎn)無類病毒和病毒馬鈴薯繁殖材料的方法”，介紹了利用馬鈴薯莖尖組織進行體外培養(yǎng)誘導生根，或誘導微型塊莖的生產(chǎn)方法。中國專利CN 1043718C“馬鈴薯脫毒微型種薯生產(chǎn)技術(shù)”介紹了一種馬鈴薯脫毒種薯的生產(chǎn)方法，該方法包括脫毒試管苗的培養(yǎng)與選擇，扦插苗培養(yǎng)及選擇，基質(zhì)選擇和藥劑處理，田間栽培管理措施等。中國專利CN1090901C“一種大蒜脫毒種苗繁殖的方法”介紹了利用未熟蒜薹為外植體，通過對不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間的選擇以及糖、激素等配比的改變等，獲得了大量脫毒大蒜試管苗。但目前關(guān)于生姜脫毒苗培育的方法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可在生產(chǎn)中推廣應用的生姜脫毒苗的培育方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，方法中具有馬鈴薯等無性繁殖作物脫毒苗的生產(chǎn)方法，其特征在于a、脫毒生姜試管苗的獲得取一般生姜根莖萌發(fā)的幼芽，剝離至僅剩1～2個葉原基后，接種于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～35d，可獲得生姜離體莖尖再生植株試管苗，剪取試管苗莖葉進行病毒檢測，對未帶毒叢生試管苗基部按單芽分割后，重新轉(zhuǎn)接新的培養(yǎng)瓶進行繼代培養(yǎng)，即可獲得脫毒的生姜試管苗；b、脫毒生姜試管苗快繁將獲得的脫毒生姜試管苗剪取莖葉后，對試管苗基部按單芽分割，重新接種到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，40～50d后即可獲得大量脫毒生姜試管苗；c、脫毒生姜試管苗生根培養(yǎng)將快繁的脫毒生姜試管苗基部按單芽分割后，轉(zhuǎn)接于附加NAA 0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40～50d后，即可培養(yǎng)成根、莖、葉完整的生姜脫毒苗。
本方法各階段培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強2000～4000lx。
由于本發(fā)明是一套完整的生姜脫毒苗的培育方法，實踐證明可很好的在生產(chǎn)實踐中推廣應用，所以實施后可產(chǎn)生比較積極的效果。
具體實施例方式
本發(fā)明包含了從生姜試管苗培養(yǎng)、病毒檢測、脫毒試管苗快繁到脫毒生姜試管苗生根培養(yǎng)全過程的完整配套技術(shù)，可在生產(chǎn)實踐中推廣應用。具體實施時的基本步驟為a、脫毒生姜試管苗的獲得取一般生姜根莖萌發(fā)的幼芽，剝離至僅剩1～2個葉原基后，接種于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～35d，可獲得生姜離體莖尖再生植株試管苗，剪取試管苗莖葉進行病毒檢測，對未帶毒叢生試管苗基部按單芽分割后，重新轉(zhuǎn)接新的培養(yǎng)瓶進行繼代培養(yǎng)，即可獲得脫毒的生姜試管苗；b、脫毒生姜試管苗快繁將獲得的脫毒生姜試管苗剪取莖葉后，對試管苗基部按單芽分割，重新接種到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，40～50d后即可獲得大量脫毒生姜試管苗；c、脫毒生姜試管苗生根培養(yǎng)將快繁的脫毒生姜試管苗基部按單芽分割后，轉(zhuǎn)接于附加NAA 0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40～50d后，即可培養(yǎng)成根、莖、葉完整的生姜脫毒苗。
各培養(yǎng)基的卡拉膠含量為4～5g/L，pH 6.5，各階段培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強2000～4000lx。
進一步說，在具體實施的過程中還應注意如下幾點1.生姜幼芽的培養(yǎng)取一般生姜根莖用清水洗凈后，以500倍50％多菌靈溶液浸泡30min，撈出生姜根莖，置散射光條件下晾干，埋于室內(nèi)用清水淘洗的濕沙內(nèi)，保持環(huán)境溫度22～28℃。經(jīng)過25d左右，生姜根莖幼芽萌發(fā)至1cm左右，取下備用。
2.生姜離體莖尖初代培養(yǎng)將取下的生姜根莖幼芽，以70％乙醇或0.1％升汞消毒后，在立體解剖鏡下剝離至僅剩1～2個葉原基，接種于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強2000～4000lx，培養(yǎng)30～35d，即可獲得株高5～7cm的離體再生植株試管苗。
3.生姜試管苗病毒檢測取生姜離體莖尖再生植株試管苗，剪下莖葉，將其置于消毒研缽中，加入適量緩沖液(PBS 0.05M、pH 7.0，含0.1％巰基乙醇)研磨，用常規(guī)方法接種于栽培在消毒土中的心葉煙(Nicotiana qilutinosa)、曼陀羅(Datura stramonium)、莧色藜(Chenopdium amaranticolor)等寄主上，置于防蟲網(wǎng)室或溫室內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)3～4d后觀察記錄。若發(fā)現(xiàn)有系統(tǒng)花葉、局部枯斑、褪綠斑等病毒侵染癥狀，表明試管苗帶毒，該類生姜試管苗應淘汰；若無異常生長表現(xiàn)，則表明生姜試管苗未被病毒侵染，該類試管苗即為生姜脫毒苗，保存?zhèn)溆谩?br> 4.生姜脫毒試管苗的繼代培養(yǎng)與快繁將生姜脫毒試管苗按基部單芽進行分割后，重新接種到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強2000～4000lx，培養(yǎng)40～50d后即可長出大量叢生脫毒生姜試管苗。將其莖葉剪除后，再次分割基部單芽，進行重新接種。如此往復進行，即可獲得大量脫毒生姜試管苗。
5.生姜脫毒試管苗的生根培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)獲得的生姜叢生試管苗，剪除莖葉，按單芽分割后，轉(zhuǎn)接于附加NAA 0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強2000～4000lx。一般經(jīng)過40～50d后，即可獲得株高7～8cm、且具有良好根系的脫毒生姜試管苗。
下面，通過3個實施例，來進一步說明具體的實施過程。
實施例11.生姜離體莖尖培養(yǎng)再生植株的獲得將‘萊蕪大姜’姜塊用清水洗凈，然后在500倍50％多菌靈溶液中浸泡30min，埋于清水洗凈的濕沙中，置于溫度22～28℃的室內(nèi)催芽25d后，取長度1.2cm左右的姜芽，以70％乙醇消毒30min后，再用0.1％升汞滅菌4min，用無菌水沖洗5次，然后在立體解剖鏡下，將姜芽剝離至僅剩1～2個葉原基，單芽接種于附加KT 2.0mg/L、NAA 0.25mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上，共接種100瓶。培養(yǎng)條件為溫度26±2℃、光照12h/d、光強4000lx。培養(yǎng)35d后，獲得株高5～6cm的離體再生植株86瓶，單瓶平均苗莖數(shù)5.7個。
2.生姜試管苗病毒檢測與脫毒苗的獲得單株剪取離體再生植株試管苗莖葉，將其置于消毒研缽中，加入5ml緩沖液(PBS 0.05M、pH 7.0，含0.1％巰基乙醇)研磨，靜置10min后，取上清液接種于栽培在消毒土中的心葉煙(Nicotiana qilutinosa)、曼陀羅(Datura stramonium)植株葉片上，置于防蟲網(wǎng)室或溫室內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)4d后觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的86瓶生姜試管苗，有18瓶植株帶毒，予以淘汰，68瓶未發(fā)現(xiàn)病毒，即為脫毒生姜試管苗。
3.脫毒生姜試管苗繼代培養(yǎng)與快繁利用剪除莖葉的脫毒生姜試管苗基部，按單芽(株)進行分割后，轉(zhuǎn)接于附加KT 2.5mg/L、NAA 0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每瓶接種4～5芽(株)，培養(yǎng)條件為溫度24～28℃、光照12h/d、光強4000lx。45d后有效繁殖系數(shù)平均達6.2。之后，按以上方法連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，植株再生能力基本沒有衰退，并獲得了10000余株脫毒生姜試管苗。
4.脫毒生姜試管苗生根培養(yǎng)將快繁的脫毒生姜試管苗剪除莖葉，按單芽(株)分割基部，轉(zhuǎn)接于附加NAA 1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)生根，每瓶接種4～5芽(株)。培養(yǎng)條件為溫度24～28℃、光照12h/d、光強4000lx。生姜試管苗在生根培養(yǎng)基培養(yǎng)45d后，幼苗平均株高達7.6cm，根長達2～3cm。
實施例21.生姜離體莖尖初代培養(yǎng)取生姜根莖萌發(fā)的1cm左右的幼芽，以0.1％升汞消毒后，在立體解剖鏡下剝離至僅剩1～2個葉原基，接種于附加KT 2.5mg/L、NAA 0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強2000lx，培養(yǎng)35d，獲得株高5～7cm的離體再生植株試管苗。
3.生姜試管苗病毒檢測取生姜離體莖尖再生植株試管苗，剪下莖葉，將其置于消毒研缽中，加入適量緩沖液(PBS 0.05M、pH 7.0，含0.1％巰基乙醇)研磨，用常規(guī)方法接種于栽培在消毒土中的心葉煙(Nicotiana qilutinosa)上，置于防蟲網(wǎng)室或溫室內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)4d后觀察記錄，淘汰導致心葉煙出現(xiàn)系統(tǒng)花葉、局部枯斑、褪綠斑等病毒侵染癥狀的試管苗，保留無異常生長表現(xiàn)的生姜試管苗。
4.生姜脫毒試管苗的繼代培養(yǎng)與快繁將生姜脫毒試管苗按基部單芽進行分割后，重新接種到新的附加KT 3.0mg/L、NAA 0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強3000lx，培養(yǎng)45d后即可長出大量叢生脫毒生姜試管苗。將其莖葉剪除后，再次分割基部單芽，進行重新接種。如此往復進行，即可獲得大量脫毒生姜試管苗。
5.生姜脫毒試管苗的生根培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)獲得的生姜叢生試管苗，剪除莖葉，按單芽分割后，轉(zhuǎn)接于附加NAA 1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強4000lx。經(jīng)過40d后，即可獲得株高7～8cm、且具有良好根系的脫毒生姜試管苗。
實施例31.脫毒生姜試管苗的獲得取一般生姜根莖萌發(fā)的幼芽，剝離至僅剩1～2個葉原基后，接種于附加KT 2.0mg/L、NAA 0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為溫度22～28℃、光照12h/d、光強4000lx。培養(yǎng)35d，可獲得生姜離體莖尖再生植株試管苗，剪取試管苗莖葉進行病毒檢測，對未帶毒叢生試管苗基部按單芽分割后，重新轉(zhuǎn)接新的培養(yǎng)瓶進行繼代培養(yǎng)，即可獲得脫毒的生姜試管苗；2.脫毒生姜試管苗快繁將獲得的脫毒生姜試管苗剪取莖葉后，對試管苗基部按單芽分割，重新接種到新的附加KT 2.5mg/L、NAA 0.35mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度22～28℃、光照12h/d、光強4000lx，40d后即可獲得大量脫毒生姜試管苗；3.脫毒生姜試管苗生根培養(yǎng)將快繁的脫毒生姜試管苗基部按單芽分割后，轉(zhuǎn)接于附加NAA 0.50mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為溫度22～28℃、光照12h/d、光強4000lx。培養(yǎng)40d后，即可培養(yǎng)成根、莖、葉完整的生姜脫毒苗。
權(quán)利要求
1.一種生姜脫毒苗的培育方法，具有馬鈴薯等無性繁殖作物脫毒苗生產(chǎn)方法，其特征在于a、脫毒生姜試管苗的獲得取一般生姜根莖萌發(fā)的幼芽，剝離至僅剩1～2個葉原基后，接種于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～35d，可獲得生姜離體莖尖再生植株試管苗，剪取試管苗莖葉進行病毒檢測，對未帶毒叢生試管苗基部按單芽分割后，重新轉(zhuǎn)接新的培養(yǎng)瓶進行繼代培養(yǎng)，即可獲得脫毒的生姜試管苗；b、脫毒生姜試管苗快繁將獲得的脫毒生姜試管苗剪取莖葉后，對試管苗基部按單芽分割，重新接種到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS快繁培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，40～50d后即可獲得大量脫毒生姜試管苗；c、脫毒生姜試管苗生根培養(yǎng)將快繁的脫毒生姜試管苗基部按單芽分割后，轉(zhuǎn)接于附加NAA 0.50～1.0mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40～50d后，即可培養(yǎng)成根、莖、葉完整的生姜脫毒苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生姜脫毒苗的培育方法，其特征在于各培養(yǎng)基的卡拉膠含量為4～5g/L，各階段培養(yǎng)條件為溫度20～28℃、光照12h/d、光強2000～4000lx。
全文摘要
本發(fā)明屬農(nóng)業(yè)高新技術(shù)領(lǐng)域的一種生姜脫毒苗的培育方法，其特征在于將生姜幼芽剝離至1～2個葉原基后，接種于附加KT 2.0～2.5mg/L、NAA 0.25～0.30mg/L、蔗糖25g/L、pH 6.5的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～35d，可獲得生姜離體莖尖再生植株試管苗；剪取試管苗莖葉進行病毒檢測，對未帶毒者重新接種到新的附加KT 2.5～3.0mg/L、NAA 0.30～0.40mg/L的MS快繁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40～50d后即可獲得脫毒試管苗；將快繁的試管苗轉(zhuǎn)接于附加NAA 0.50～1.0mg/L的MS生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40～50d后，即可培養(yǎng)成根、莖、葉完整的生姜脫毒苗。
文檔編號C12N5/04GK1930951SQ200610069250
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日
發(fā)明者徐坤, 鄭永強 申請人:徐坤, 鄭永強