專利名稱：生產(chǎn)雄性不育植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)雄性不育植物的方法。具體地，此發(fā)明涉及用包含植物1 基因的所述基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物并在花藥絨氈層中表達(dá)此基因生產(chǎn)雄性不育的轉(zhuǎn)基因植物。雄性不育的植物在通過有性雜交生產(chǎn)雜種植物中有用。雜交品種的開發(fā)是非常需要的， 這是因為其提高的雜種優(yōu)勢(hybrid vigor或heterosis)導(dǎo)致的通常提高的產(chǎn)率。
背景技術(shù)：
在全世界范圍的多種商業(yè)糧食作物中雜種植物已變得越來越重要。由于雜種優(yōu)勢，雜種植物比其親本具有更高的產(chǎn)量，更好的品質(zhì)和逆境抗性的優(yōu)勢。當(dāng)親本是純合子時，作物的一致性是雜種植物的另一個優(yōu)勢；這導(dǎo)致改進(jìn)的作物管理。因此雜種種子在商業(yè)上重要并以高價出售。在例如玉米、向日葵、高粱、糖用甜菜、棉花的作物和許多蔬菜中，雜種占有了種子市場的很大的市場占有率。不僅美國和歐洲，而且許多發(fā)展中國家在其糧食生產(chǎn)中很大程度地依靠雜種。在多種作物中的雜種銷量占全球商業(yè)種子貿(mào)易額的近40%，為約150億美元。由于雜種優(yōu)勢的重要性仍有待被完全地發(fā)現(xiàn)，此市場占有率可能會增加，尤其是在發(fā)展中國家中。玉米(在美國從30年代開始)、棉花(在印度從1970年開始)和稻(在中國從1976 年開始)的雜交品種的產(chǎn)生代表了 20世紀(jì)最顯著和成功的育種工作。在引入雜交育種后， 與前60年中選擇的自由授粉群體的一致表現(xiàn)相比，觀察到美國玉米產(chǎn)量在1930年和1990 年之間提高了 6倍(Stuber，1994)。雜種優(yōu)勢((Zirkle，1952))的概念出現(xiàn)自18世紀(jì)J. G. Koelreuter在煙草屬 OVicoiia/ a)、石竹屬(Dianthus)、毛藍(lán)花屬(Verbascum)、紫茉莉?qū)?IirahVi1S)、曼陀羅屬Ofetora)的種間雜交中的早期觀察，經(jīng)Darwin (Darwin, 1876)在蔬菜中和W. J. Beal 在玉米中(Beal，1880)驗證。之后，當(dāng)生產(chǎn)必需量的種子的工具在雌雄同體的物種中可利用時，此效應(yīng)在植物育種中得到開發(fā)(Shull，1952) :1943年在洋蔥中開發(fā)了首個雄性不育系統(tǒng)(Jones，1943)，在大范圍的物種例如糖用甜菜、玉米、高粱、向日葵、稻、油菜、胡蘿
卜中開發(fā)了其他雄性不育系統(tǒng)(Frankel，1977)。雜種種子的成功商業(yè)生產(chǎn)關(guān)鍵是對雄性不育的授粉過程的充分控制。將雄性不育定義為植物不能夠產(chǎn)生有功能的花藥、花粉或雄配子。雄性不育的首個記錄出現(xiàn)在1763 年，當(dāng)時Kolreuter觀察到在物種內(nèi)的花藥敗育和特定的雜種。玉米具有明顯分離的雄花和雌花，使這種植物很適于人工或機(jī)械去雄。在雄穗能夠散發(fā)花粉之前從種子植物中去除雄穗。盡管目前在生產(chǎn)植物(例如玉米)的雜種種子中使用去雄，就實(shí)際去雄成本和由于雌性親本去雄導(dǎo)致的產(chǎn)量損失兩方面而言，此過程是勞動密集型的并且成本高。大多數(shù)主要目的作物植物在同一朵花中具有功能性雄性和雌性器官，因此，去雄不是一個簡單的程序。盡管有可能在散發(fā)花粉之前手工去除花粉形成器官，此雜種生產(chǎn)的形式是極端勞動密集型的且昂貴。只有當(dāng)收回的種子的價值和量值得花費(fèi)精力時才以此方式生產(chǎn)種子。
另一種生產(chǎn)雜種種子的通常方法是使用殺傷或阻斷活花粉形成的化學(xué)劑。使用這些稱為殺配子劑的化學(xué)劑以賦予短暫的雄性不育。通過使用殺配子劑進(jìn)行的雜種種子的商業(yè)生產(chǎn)受到化學(xué)劑的費(fèi)用和可利用性以及應(yīng)用的可靠性和作用時間長度的限制。殺配子劑的一個嚴(yán)重局限性是它們具有植物毒性作用，其嚴(yán)重度取決于基因型。其他局限性包括這些化學(xué)劑可能不能有效地到達(dá)雄性生殖部分或可能對具有延長的開花期的作物無效，因為產(chǎn)生的新花可能不受影響。因此，需要重復(fù)應(yīng)用化學(xué)劑。目前許多用于大田作物的商業(yè)雜種種子的生產(chǎn)系統(tǒng)依賴授粉控制的遺傳方法。作為雌性使用的植物或者不能生產(chǎn)花粉，或者不能散發(fā)花粉，或者產(chǎn)生生化上不能起自體受精作用的花粉。用于商業(yè)種子生產(chǎn)的引起更廣泛興趣是具有基于花粉控制的導(dǎo)致雄性不育的遺傳機(jī)制的系統(tǒng)。在自然界中觀察到3種主要的雄性不育類型。在商業(yè)育種程序中使用所有3種雄性不育類型以保證異花授粉從而在不同作物中產(chǎn)生雜種種子。雄性不育的一種類型是核編碼的，被稱為遺傳雄性不育。其通常受單個隱性基因 ms控制，但也已知例如在向日葵中有控制雄性不育的顯性基因。因此核雄性不育可為顯性的或隱性的。在玉米中已分離出許多不同的核雄性不育(抓)基因。在稻中已知25個抓。在這樣的基因為純合隱性的植物中，花粉不能發(fā)育成熟。用于育種目的，通過與也包含隱性雄性不育等位基因的雜合雄性可育植物雜交來保持隱性雄性不育親本植物，以使子代為50% 隱性雄性不育植物。另外50%的雄性可育植物必須在遠(yuǎn)交程序中去除，這只有當(dāng)隱性雄性不育等位基因與可選擇或可篩選標(biāo)記一起分離時才可有效地完成。在美國專利4，727，219 中，描述了隱性雄性不育用于生產(chǎn)雜種玉米的方法。與隱性雄性不育植物相比，顯性核雄性不育植物可通過與雄性不育植物雜交保持，以生產(chǎn)50%顯性雄性不育植物的子代。然而，顯性核雄性不育植物的用途是有局限性的，因為在大多數(shù)情況下其顯性雄性不育等位基因不與可選擇或可篩選標(biāo)記緊密連鎖(即，在相同的遺傳基因座中)。只有當(dāng)雌性系繁殖是可能的時(例如，通過體外克隆繁殖)，才可將顯性不育用于雜種種子的形成。在硬質(zhì)小麥和普通小麥中使用藍(lán)色種子標(biāo)記開發(fā)了顯性核雄性不育系(Tian和Liu，2001)。此遺傳雄性不育在植物中廣泛存在，但此不育系統(tǒng)的商業(yè)效用受克隆繁殖和去除自體可育植物的雌性列 (female rows)的費(fèi)用限制。遺傳雄性不育可再分為2個寬范圍的組(1)環(huán)境不敏感的，即 ^基因表達(dá)較少受環(huán)境的影響和(2)環(huán)境敏感的，即基因表達(dá)發(fā)生在特定的溫度范圍和/或光周期條件內(nèi)；此類型的不育在稻、番茄、小麥等中已知。環(huán)境敏感的雄性不育進(jìn)一步分為2個組(1) 溫度敏感的遺傳雄性不育，例如稻TGMS系Pei-Ai645和(2)光周期敏感的遺傳雄性不育， 例如稻5047S。此外，已使用遺傳工程方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雄性不育，針對這點(diǎn)在此文件中討論了一個新方法。雄性不育的第二種類型由細(xì)胞質(zhì)中的遺傳顆粒調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)雄性不育由核外基因組(線粒體或質(zhì)體)引起并顯示母系遺傳。這類雄性不育體現(xiàn)可以為或者完全受細(xì)胞質(zhì)因子的控制，或者通過細(xì)胞質(zhì)和核因子的相互作用控制。其顯示了非孟德爾的遺傳。這在植物界不是很常見的雄性不育系統(tǒng)類型。種子系的細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)可通過與作為雌性親本的天然發(fā)生的CMS種質(zhì)雜交獲得。在這里不育僅通過雌性傳遞且所有子代都是不育的。對例如洋蔥或胡蘿卜的作物來說這不是問題，其中從Fl代收獲的產(chǎn)品在營養(yǎng)生長中產(chǎn)生。但在不可能進(jìn)行克隆繁殖的其他情況中，CMS系必須通過與姐妹系(被稱為保持系)的重復(fù)雜交保持，所述姐妹系與CMS系在遺傳上是相同的，除了其具有正常的細(xì)胞質(zhì)因此是雄性可育的?；诩?xì)胞質(zhì)不育在種子系引起雄性不育的這種方法在稻、高粱、向日葵和黍中應(yīng)用。 但是只有當(dāng)子代的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品不是用作種子而是植物(例如觀賞植物和甜菜)時，此類型的植物子代才具有商業(yè)價值。當(dāng)用于育性恢復(fù)O /)的核基因可在任意作物中用于CMS系統(tǒng)中時，將其稱為細(xì)胞質(zhì)遺傳雄性不育(CGMS)。育性恢復(fù)O /)基因與遺傳雄性不育基因是不同的。此第三種雄性不育系統(tǒng)是核編碼的雄性不育與細(xì)胞質(zhì)編碼的雄性不育二者組合的結(jié)果。在這里不育體現(xiàn)為受到核和細(xì)胞質(zhì)基因二者的影響。正如且當(dāng)發(fā)現(xiàn)用于細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)系基因時， 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的情況可被包括在細(xì)胞質(zhì)-遺傳系統(tǒng)中。如果進(jìn)行全面的搜索，有可能找到用于所有細(xì)胞質(zhì)雄性不育情況的恢復(fù)系基因。通常具有2種細(xì)胞質(zhì)類型，N (正常)和S (不育)。除非存在不育細(xì)胞質(zhì)，否則基因沒具有任何自我表達(dá)。在導(dǎo)致不育的S細(xì)胞質(zhì)中恢復(fù)育性需要W/基因。因此N細(xì)胞質(zhì)和rfrf與S細(xì)胞質(zhì)和的組合生產(chǎn)可育；而S 細(xì)胞質(zhì)和r/r/僅生產(chǎn)雄性不育。N細(xì)胞質(zhì)和ΤΡ/r/最適于穩(wěn)定的育性。美國專利6320098 描述了生產(chǎn)細(xì)胞質(zhì)-遺傳雄性不育大豆的方法和生產(chǎn)雜種大豆的方法。美國專利5773680 在雜種野生稻的生產(chǎn)中利用細(xì)胞質(zhì)-遺傳雄性不育系統(tǒng)。通常CMS用于商業(yè)種子生產(chǎn)的用途涉及3種育種系的保持雄性不育系(雌性親本)，與雄性不育系同基因的但包含完全功能的線粒體的保持系和具有用于育性恢復(fù)的核基因O /基因)的恢復(fù)系?？筛淖冎参锇l(fā)育的顯性失活基因的發(fā)現(xiàn)對開發(fā)誘發(fā)雄性不育的遺傳方法特別有用，因為其他可用的方法(包括細(xì)胞質(zhì)雄性不育和核雄性不育)具有缺點(diǎn)。顯性失活基因是這樣的基因，即當(dāng)其表達(dá)時在植物中引起顯性表型。Herskowitz (1987)使用術(shù)語“顯性失活”表示編碼突變多肽的基因，當(dāng)該突變多肽過表達(dá)時破壞野生型基因的活性。野生型基因是突變體從其來源的基因。在本說明書中，對編碼產(chǎn)物的基因應(yīng)用顯性失活基因，其破壞接受所述基因的宿主細(xì)胞的內(nèi)源遺傳過程，并以單拷貝有效或可由于基因的過表達(dá)或通過提高的基因產(chǎn)物的產(chǎn)生起作用。顯性失活基因種類的實(shí)例為細(xì)胞毒性基因、甲基化酶基因和生長抑制基因。顯性失活基因包括白喉毒素A鏈基因(Czako和An，1991)，細(xì)胞周期分裂突變體例如玉米中的CDC(Colasanti,等人，1991)，WT基因(Farmer,等人，1994)和 P68 (Chen,等人，1991)。生物技術(shù)已使可用于雜種種子生產(chǎn)的一些新的授粉控制系統(tǒng)得以發(fā)展。自從首個轉(zhuǎn)基因雄性不育系統(tǒng)被描述后(Mariani，1990)，已報導(dǎo)了許多生產(chǎn)雄性不育植物的策略。 引起顯著興趣的是使用剔除系統(tǒng)用于控制植物生殖發(fā)育。通過遺傳剔除已經(jīng)在幾種植物物種中實(shí)現(xiàn)了生殖控制，其需要將生殖優(yōu)選的啟動子與顯性失活基因連接以剔除生殖細(xì)胞。 有關(guān)該計劃的發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)如下
專利EP344(^9、EP1135982和W089/10396描述了通過用在絨氈層特異性啟動子控制下編碼芽孢桿菌RNA酶的DNA轉(zhuǎn)化植物生產(chǎn)雄性不育植物的系統(tǒng)。芽孢桿菌RNA酶是來源于解淀粉芽胞桿菌(feciBM卯e/acie/^)的RNA酶。此酶具有110個氨基酸殘
基并水解RNA。當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時，此酶降解細(xì)胞中的RNA并因此抑制細(xì)胞的功能，在許多情況下最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此通過使用此特征，希望通過在植物的特定位點(diǎn)表達(dá)芽孢桿菌RNA酶基因可選擇性地控制特定位點(diǎn)的功能。用這樣的啟動子-基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草和油菜植物阻止植物產(chǎn)生可育的花粉(Mariani等人，1990)。當(dāng)使用A9和A6啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中驅(qū)動芽孢桿菌RNA酶基因的表達(dá)時也觀察到類似的絨氈層的萎陷(Hird等人， 1993; Paul 等人，1992)。·然而當(dāng)應(yīng)用芽孢桿菌RNA酶基因作為雄性不育基因時，經(jīng)常觀察到得到的雄性不育轉(zhuǎn)基因植物展示不利的特征。PCT國際公開1096/^26283提到了在稻中的此問題。還有報導(dǎo)，不僅在稻中而且在萵苣中觀察到類似的現(xiàn)象(Reymaerts等人，1993)。專利申請 20020166140報導(dǎo)了至少部分突變的芽孢桿菌RNA酶基因，之后將這樣得到的具有減弱的作用的突變芽孢桿菌RNA酶基因在植物中進(jìn)行花藥特異性表達(dá)以使植物基本上雄性不育且對花藥以外的組織基本上沒有任何不利影響。在此專利中，要求保護(hù)了高效率的沒有任何不利特征的雄性不育植物的生產(chǎn)?！＠?US 5763243、US 6072102、US 5792853、US 5837851 和 US 5795753 已使用了從大腸桿菌coli)中分離的DNA腺嘌呤甲基化酶(DAM)基因作為顯性失活基因。 特定基因或啟動子的DNA甲基化模式的改變是基因表達(dá)改變的原因。DNA甲基化是在植物和動物二者的發(fā)育中調(diào)控基因的一種因素。通過例如使用甲基敏感性含CpG的啟動子(基因)的方法建立甲基化模式。通?；钴S轉(zhuǎn)錄的序列是處于甲基化狀態(tài)的。在動物中，甲基化位點(diǎn)在CpG位點(diǎn)(殘基)被修飾。腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C) (DNA中存在的核苷酸)的甲基化的遺傳控制受細(xì)菌和哺乳動物物種中的基因的影響。然而在植物中，甲基部分存在于序列 CXG中，其中X可為A、C或T，其中C為甲基化殘基。在植物還未發(fā)現(xiàn)由于A甲基化而引起的失活，特別是在其他系統(tǒng)中已知是被甲基化的GATC位點(diǎn)中。大腸桿菌DNA腺嘌呤甲基化酶(DAM) (GATC是其的一個靶)使對花粉形成或功能關(guān)鍵的遺傳區(qū)域失活，由此導(dǎo)致雄性不育植物的形成。 ·專利EP0942965、專利US 6177616和專利US 6384304使用編碼脫乙酰酶或具有脫乙酰酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的DNA分子。通過脫乙酰酶基因的特異性表達(dá)，這些分子可用于生產(chǎn)具有可有意破壞的部分的植物，即具有雄性不育的植物(Kriete等人1996， Bartsch 2001)。來自產(chǎn)綠色鏈霉菌(份^卬如耶⑶·^ ririt/ocArofflo^^M)的脫乙酰酶基因[N-乙?；?L-草銨膦基丙氨酰丙氨酸(N-acetyl-L-phosphinothricylalanylalanin e，N-乙?；?PTT)脫乙酰酶，dea]和來自大腸桿菌的argE (N-乙?；?L-鳥氨酸脫乙酰酶)編碼具有針對N-乙酰基-L-PPT特異性的蛋白質(zhì)。在用N-乙?；?L-PPT處理各個芽 (buds)之后，2種基因都有可能在植物的絨氈層特異性表達(dá)的情況下顯示雄性不育花的發(fā)生。為了此系統(tǒng)的成功使用，特別是在實(shí)際相關(guān)條件下用N-乙?；?PPT處理整個植物中成功使用此系統(tǒng)，能夠應(yīng)用具有高底物親和力的脫乙酰酶是有利的。因此研究了對N-乙酰基-PPT具有高親和力的其他脫乙酰酶。在專利US 6177616和專利US 6384304中使用了來自寡養(yǎng)單胞菌屬Q(mào)Stenotrophomonas)物種的N-乙酰基-PPT脫乙酰酶基因用于生產(chǎn)雄性不育植物。·專利EP0455690報導(dǎo)了通過使用可在植物花藥中表達(dá)的抑制線粒體功能的基因來抑制植物細(xì)胞的呼吸的方法，其導(dǎo)致細(xì)胞死亡和不能產(chǎn)生活花粉，因此賦予雄性不育。 破壞基因(disrupter gene)選自從哺乳動物(通常是大鼠)褐色脂肪組織克隆的哺乳動物解偶聯(lián)蛋白(UCP)。建議的破壞蛋白UCP在哺乳動物褐色脂肪組織的生熱作用中起作用，其以二聚體形式存在于線粒體內(nèi)膜中形成質(zhì)子通道，并因此通過消耗跨膜的質(zhì)子電化學(xué)勢差來解偶聯(lián)氧化磷酸化。·專利US 5254801報導(dǎo)了磷酸單酯酶基因(/^似)，發(fā)現(xiàn)其適于例如在植物的雜種種子生產(chǎn)中引起雄性不育的目的。評估了細(xì)菌磷酸單酯水解酶在植物中作為條件致死基因用于細(xì)胞剔除和負(fù)選擇。從草甘膦代謝細(xì)菌石竹伯克霍爾德氏菌Ofe^AoAferia caryophilli) Q2^2中克隆了磷酸單酯酶基因(/^似)，其編碼的酶將膦酸酯(包括甘油基草甘膦)水解為草甘膦和甘油。作為組織特異性細(xì)胞剔除的實(shí)例，通過使用絨氈層特異性啟動子表達(dá)似基因和用甘油基草甘膦處理成熟植物證明了沒有植物毒性的花不育。 (Dotson 等人 1996)?！?WO 99/04023報導(dǎo)了通過使用編碼抗生物素蛋白(一種糖蛋白)的DNA分子控制植物育性的方法?？股锼氐鞍谆蛟诨ㄋ幹械母咚奖磉_(dá)可誘發(fā)雄性不育?？股锼氐鞍?一種糖蛋白)具有對生物素(維生素H)的非常高的親和力，具有約10_15 M_1[1]的Kd(解離常數(shù))，是在任意蛋白質(zhì)及其配體之間已知最高的親和力。這種結(jié)合是基本上不可逆的。 通過使用生物素溶液噴灑植物可恢復(fù)育性。 ·專利US 5955653公開了來自甘藍(lán)型油菜(Sral5lSica /？即狀)和包括擬南芥(A thaliana)的十字花科其他成員的絨氈層特異性愈創(chuàng)葡聚糖酶(callase) (β_1，3_葡聚糖酶)基因，將其命名為Α6。Α6基因編碼53 kDa的甘藍(lán)型油菜愈創(chuàng)葡聚糖酶和其他十字花科成員的等同蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^合適的啟動子驅(qū)動基因的編碼序列以在植物中誘發(fā)雄性不育。小孢子釋放是這樣的過程，即未成熟的小孢子通過此過程從小孢子形成細(xì)胞在減數(shù)分裂前形成的(laid down) β (1,3)葡聚糖(愈創(chuàng)葡聚糖)保護(hù)層中釋放(Rowley，(1959)； Heslop-Harrison (1968))。花藥表達(dá)的負(fù)責(zé)溶解此愈創(chuàng)葡聚糖層(callose coat)的葡聚糖酶被稱為愈創(chuàng)葡聚糖酶。愈創(chuàng)葡聚糖酶由絨氈層細(xì)胞合成并分泌至子房室。酶活性的出現(xiàn)被發(fā)育調(diào)控以與小孢子發(fā)育的特定階段精確吻合。使用葡聚糖酶作為不育DNA的基礎(chǔ)是基于以下事實(shí)，即愈創(chuàng)葡聚糖酶活性出現(xiàn)的錯誤時機(jī)與雄性不育的特定類型相關(guān)(Warmke 和Overman，1972)。葡聚糖酶作為潛在不育DNA的一個重要的吸引力之處在于其已經(jīng)存在于天然系統(tǒng)中。但是愈創(chuàng)葡聚糖酶活性出現(xiàn)的時機(jī)是至關(guān)重要的?！＠鸘S 7230168描述了用編碼細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，其中細(xì)胞分裂素氧化酶的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植物中抑制花粉形成或雄性器官的發(fā)育。通過應(yīng)用細(xì)胞分裂素或細(xì)胞分裂素氧化酶抑制劑例如細(xì)胞分裂素氧化酶1抑制劑恢復(fù)正常細(xì)胞分裂素水平后可在植物中實(shí)現(xiàn)育性恢復(fù)。特定細(xì)胞分裂素氧化酶氧化地去除細(xì)胞分裂素側(cè)鏈以得到腺嘌呤和相應(yīng)的異戊烯醛的hear ability用于產(chǎn)生雄性不育?！ぴ趧游锵到y(tǒng)中，對凋亡的研究已揭示了 Bcl-2家族蛋白質(zhì)發(fā)揮關(guān)鍵作用的途徑。Bcl-2家族包括促凋亡(例如Bax、Bak和Bid)和抗凋亡(例如Bcl-2、Bcl_xl和Ced_9) 成員，其似乎通過線粒體控制凋亡的起始(Gross等人1999)。Bax基因已顯示在植物細(xì)胞中誘發(fā)PCD(Lacomme和Cruz 1999，Kawai-Yamada等人2001)。將小鼠Bax基因與絨氈層特異性啟動子連接，所述Bax基因的表達(dá)引起細(xì)胞死亡導(dǎo)致花粉敗育(Tsuchiya等人 1994，Ariizumi等人2002)。在植物中已鑒定了 Bax誘發(fā)的細(xì)胞死亡的抑制子。在四分體階段在絨氈層中表達(dá)AtBI-I (哺乳動物Bax抑制物的同系物)抑制絨氈層退化并隨后導(dǎo)致花粉敗育，而在較晚階段激活A(yù)tBI-I則沒有此功能(專利JP2006345742-A，Kawanabe等人 2006)。
·白喉毒素A鏈(DTA)基因在絨氈層中表達(dá)，由于特定細(xì)胞剔除其導(dǎo)致顯性雄性不育(Koltimow等人，1990)。類似的，當(dāng)將蕓薹屬(Sra^ica) S-基因座糖蛋白基因啟動子與DTA基因融合并轉(zhuǎn)入煙草(Thorness等人，1991)和擬南芥(Thorness等人 1993)中時，由于在雌蕊和花藥二者中的基因表達(dá)其導(dǎo)致自花不育植物。APETALA3 (AP3) 啟動子-DTA融合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草中的花瓣和雄蕊的完全剔除(Day等人，1995)。在擬南芥中也使用溫度敏感的白喉毒素A鏈(DTA)基因賦予條件雄性不育(Guerineau F等人， 2003)?！?0，Kefee 等人(1994)描述了 R7402/P450sUl 系統(tǒng)，其中 P450SU1 (編碼除草劑代謝細(xì)胞色素的淺灰鏈霉菌(份griMo^As)基因)表達(dá)和R7402處理可作為負(fù)選擇系統(tǒng)在植物中使用。在由絨氈層特異性啟動子表達(dá)P450SU1的煙草中，用R7402處理未成熟的花芽導(dǎo)致劇烈降低的花粉存活力。這樣的處理可作為化學(xué)雜交劑的基礎(chǔ)。這可能為雜種種子生產(chǎn)提供了開發(fā)化學(xué)雄性不育劑的策略。·使用來自Λ分/^/^is的核糖體失活蛋白(RIP)作為細(xì)胞毒性基因在煙草植物中引起雄性不育(Cho HJ等人2001)。核糖體失活蛋白使真核細(xì)胞核糖體失活并抑制一般的蛋白質(zhì)合成。事實(shí)上其抑制自身的蛋白質(zhì)合成(Boness等人1994)。由于其自殺性作用，其被Cho HJ建議用于遺傳細(xì)胞剔除和遺傳改進(jìn)?！?Hofig等人Q006)在轉(zhuǎn)基因煙草OVicoiiaaa ia力ac腫)植物的花藥中表達(dá)了芪合酶(stilbene synthase)基因(^化)，導(dǎo)致70%的轉(zhuǎn)化植物中的完全雄性不育。葡萄藤芪合酶(STS)已顯示與酶查耳酮合酶(CHS)競爭底物丙二?；o酶A和香豆酰基輔酶A。 認(rèn)為STS在煙草中誘發(fā)的不育是由于降低或完全破壞的黃酮醇生物合成。這被下述實(shí)驗驗證，其中對STS-不育的煙草植物定期噴灑黃酮醇，部分恢復(fù)了育性。當(dāng)在非絨氈層細(xì)胞中表達(dá)時，不期望STS具有毒性作用，因為沒有競爭CHS的存在。自噬是真核細(xì)胞中的廣泛存在的過程，其中細(xì)胞質(zhì)的部分被隔離在雙層膜的囊泡中以遞送至降解細(xì)胞器，液泡或溶酶體(Reggiori等人2002)。在正常生理條件下自噬已知在基礎(chǔ)水平下有活性；其可被很多壓力包括細(xì)胞損傷、營養(yǎng)缺乏和病原體感染激發(fā) (Levine和Klionsky，2004)。已良好確定的是在營養(yǎng)缺乏時自噬通過降解和再循環(huán)營養(yǎng)物促進(jìn)細(xì)胞存活(Seay M.等人2006)。自噬相關(guān)MT^)基因?qū)ψ允审w的形成是非常重要的。在近10年中，隨著在釀酒酵母和其他真菌中的約30個義爪基因的鑒定(Klionsky等人2003)，已逐漸闡明了自噬的分子機(jī)制((Klionsky等人2005)。自噬在所有真核細(xì)胞中是保守的，最近已在多種真核系統(tǒng)中鑒定出許多酵母JW基因的同系物，并且自噬的分子機(jī)制也是保守的(Yang Cao等人2007)。自噬體的形成是復(fù)雜的過程，每種Atg蛋白已顯示在酵母自噬體形成中的特定階段發(fā)揮功能(Tsukada等人1993)。許多Atg蛋白聚集成被稱為前自噬體結(jié)構(gòu)(PAS)的泡周結(jié)構(gòu)(Kim等人2002)。在JT^基因中，JTi^是相對獨(dú)特的，因為其不是自噬特異性的(Yang Cao等人2007)。例如，釀酒酵母J7 / ^^ 基因產(chǎn)物是唯一在自噬和通過Vps途徑分選液泡駐留水解酶羧肽酶Y二者中都需要的蛋白質(zhì) (Kametaka等人1998)。酵母Atg6/Vps30是2種不同的III類磷脂酰肌醇(PtdIns) 3-激酶復(fù)合體途徑的亞基(Kihara等人2001)。復(fù)合體I在自噬中發(fā)揮功能，而復(fù)合體II涉及 Vps，這解釋了為什么Atg6/Vps30參與2種在其他方面分離的途徑。BECLIN 1 (酵母JTi^的哺乳動物同源物)是首個被鑒定出在介導(dǎo)自噬中起作用的哺乳動物基因(Liang等人，1999)。BECLIN 1最初在使用人Bcl_2作為誘餌的小鼠腦 cDNA文庫的酵母雙雜交篩選中被發(fā)現(xiàn)(Liang等人1998)。過表達(dá)人他’7在人MCF7 乳腺癌細(xì)胞中引起自噬性細(xì)胞死亡(Liang等人，1999)。最近發(fā)現(xiàn)i^ai 7參與經(jīng)胱天蛋白酶-9的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此Mai 1可能是關(guān)鍵的“分子開關(guān)”并在微調(diào)自噬和凋亡中發(fā)揮重要作用(Wang等人2007)。7在高等真核生物中保守。人Beclin 1蛋白與煙草Beclin 1共有36%的同一性和52%的相似性(Liang等人，1999)。如果植物能夠在感染中存活，必須小心控制超敏反應(yīng)(HR)細(xì)胞死亡(PCD)從而使其不在整個植物中擴(kuò)散并殺死植物。最早在本氏煙草GVicoiiaz7a知/^feffiiaz7a)植物中研 %飛BECLIN 1的植物直向同源物(Liu Y.等人200 并發(fā)現(xiàn)其在疾病抵抗過程中對HR PCD限制很重要(Seay M. 等人2006，Liu Y.等人2005，Patel S.等人2006)。植物
7缺陷的植物展示了響應(yīng)病原體感染的無限制的HR PCD (Liu Y.等人2005)。在用 TMV感染后，在植物他’α/Λ/7沉默的植物細(xì)胞中很少觀察到自噬體(Liu Y.等人2005)。 在HR PCD過程中在TMV感染的位點(diǎn)誘發(fā)自噬體，在病原體感染的細(xì)胞和未感染的相鄰細(xì)胞中誘發(fā)自噬都需要植物IlATGb以將HR P⑶限制在感染位點(diǎn)(Liu Y.等人2005)。 因此，受自噬負(fù)調(diào)控的死亡前信號從病原體感染區(qū)域移動至相鄰組織和遠(yuǎn)端組織。這些發(fā)現(xiàn)提供了 J爪基因可作為HR PCD的負(fù)調(diào)控子在體內(nèi)發(fā)揮功能的遺傳學(xué)證據(jù)。這些結(jié)果與從哺乳動物研究中的發(fā)現(xiàn)相矛盾，在哺乳動物中需要JT^基因在缺乏完整凋亡機(jī)制的細(xì)胞中促進(jìn)PCD (Liu Y.等人2005)。最近有報導(dǎo)，植物中的HATG^具有自噬以外的不同功能囊泡運(yùn)輸和花粉萌發(fā)(Fujiki Y.等人2007，Qin G.等人2007)。研究人員報導(dǎo)Ji^TZ/yV 的缺失特異性影響雄性配子體而不影響雌性生殖結(jié)構(gòu)。l^lAtBECLIN 1/ATG&的花粉不能萌發(fā)。在花粉萌發(fā)和花粉管生長中，細(xì)胞運(yùn)輸對細(xì)胞壁的沉積和細(xì)胞形狀的重塑是關(guān)鍵的 (Parton RM 等人 2003，Parton RM 等人 2001 和 Helper PK 等人 2001)。有可能的缺失改變了細(xì)胞運(yùn)輸系統(tǒng)從而導(dǎo)致花粉萌發(fā)的失敗Olin G.等人2007)。AtBECLIN 1/ ATG&缺陷的植物展示了延遲的生長、矮小和提前衰老，這提示IfATG^是正常植物發(fā)育所需的Olin G.等人2007)。絨氈層是花藥壁孢子體層的最內(nèi)層并包圍小孢子。已知絨氈層為發(fā)育中的小孢子尤其是花粉粒的外膜(花粉臂的主要結(jié)構(gòu)組成)提供營養(yǎng)。絨氈層在花粉發(fā)育的較晚階段退化。已推測絨氈層退化是程序性細(xì)胞死亡(P⑶)事件OVu和Cheun 2000)。[Wang等人 (1999)在絨氈層細(xì)胞核和花藥壁組織中發(fā)現(xiàn)TUNEL (末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記)陽性]。在絨氈層中細(xì)胞死亡的合適時機(jī)對正常的小孢子形成至關(guān)重要。 Kawanabe等人Q006)已顯示在花粉發(fā)育的早期階段在絨氈層中表達(dá)小鼠Bax基因可導(dǎo)致絨氈層的過早退化從而導(dǎo)致花粉敗育。在本發(fā)明中，在花粉發(fā)育的第2和第3階段在絨氈層中表達(dá)AtBECLIN IfATG^基因(以前未報導(dǎo)過)。這導(dǎo)致絨氈層正常細(xì)胞死亡程序的破壞并在誘發(fā)絨氈層程序性細(xì)胞死亡(P⑶)中發(fā)生延遲。因此，形成的花粉是異常的，其具有完整絨氈層，導(dǎo)致雄性不育。發(fā)明目的
本發(fā)明的主要目的是通過在花粉發(fā)育的早期階段在花藥的絨氈層中表達(dá)植物 ι基因提供生產(chǎn)雄性不育植物的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種方法，其中在絨氈層中的BECLIN 1基因的表達(dá)破壞絨氈層的正常細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致具有完整絨氈層的異?；ǚ?。 本發(fā)明的另一個目的是提供包含表達(dá)盒TA29J^ai 1的表達(dá)載體，其是產(chǎn)生多種作物植物的雄性不育系的有用工具。本發(fā)明的另一個目的是提供當(dāng)置于農(nóng)桿菌(^ro如cterii/ )感染的植物細(xì)胞中時，能夠?qū)⑺霰磉_(dá)盒UECLIN 1引入植物細(xì)胞基因組中的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個目的是通過在選自煙草、棉花、稻、小麥、玉米、馬鈴薯、番茄、油菜、苜猜、向日葵、洋蔥、三葉草、大豆、豌豆的植物中引起轉(zhuǎn)化來誘發(fā)雄性不育。本發(fā)明的另一個目的是得到雄性不育作物植物的種子。本發(fā)明的另一個目的是使用植物來源的基因產(chǎn)物在植物中引起雄性不育，這克服了與為了相同的目的表達(dá)其他細(xì)菌、病毒、哺乳動物蛋白質(zhì)相關(guān)的生物安全問題。本發(fā)明的另一個目的是表達(dá)BECLIN 1基因，其編碼無細(xì)胞毒性的多肽，因此如果發(fā)生泄露到其他細(xì)胞中不會造成任何問題。發(fā)明概述
由此，本發(fā)明提供了通過在花粉發(fā)育的早期階段在花藥的絨氈層中表達(dá)植物7 基因生產(chǎn)雄性不育植物的方法。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟
a)分離約3周大的擬南芥植物的第三和第四片蓮座葉(rosetteleaves)并使它們漂浮在培養(yǎng)皿中的去離子水上，近軸側(cè)向上；
b)將步驟(a)中得到的蓮座葉在22士 1°C和黑暗中孵育約48小時以人工誘發(fā)自噬；
c)如本文描述的從步驟(b)中得到的已誘發(fā)自噬的葉中提取總RNA；
d)通過已知方法從步驟(c)中提取的總RNA制備cDNA；
e)使用基因特異性引物通過PCR從步驟(d)中制備的cDNA中擴(kuò)增植物1/ ATG&基因；
f)如本文描述的將步驟(e)中得到的擴(kuò)增的植物BECLIN1/ATG6基因克隆至載體；
g)通過具有SeqID no. 3的絨氈層特異性啟動子和從步驟(f)中得到的具有Seq ID no. 1的植物Sedi/ 7以爪6基因和Nos終止子序列之間的基因融合在克隆載體中構(gòu)建表達(dá)盒；
h)如本文描述的將步驟(g)中構(gòu)建的表達(dá)盒亞克隆至雙元載體；
i)將攜帶所述表達(dá)盒的步驟(h)得到的雙元載體引入根癌農(nóng)桿菌如cteri tumefaciens )；
j)用步驟(i)中得到的重組根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化待誘發(fā)雄性不育的植物； k)培育獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，其中在選自煙草、棉花、稻、小麥、玉米、馬鈴薯、番茄、油菜、苜蓿、向日葵、洋蔥、三葉草、大豆、豌豆的植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，其中通過上述方法得到植物、細(xì)胞、組織。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，用于在植物中通過轉(zhuǎn)化誘發(fā)雄性不育的重組載體包含
i.花藥特異性啟動子；ii.植物召萬位7}￥7基因；
iii.Nos終止子序列。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，使用的花藥特異性啟動子為SEQ ID NO: 3所示的絨氈層特異性啟動子。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，植物他’α/Λ/ 7基因具有SEQ ID NO: 1并編碼具有SEQ ID NO: 2或其同源物的多肽。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，表達(dá)盒包含在絨氈層特異性啟動子和植物 7以爪6基因之間的嵌合基因融合，表達(dá)盒具有SEQ ID NO: 4所示的多核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，使用如上所述的重組載體轉(zhuǎn)化植物、細(xì)胞、組織。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，其提供了在其花藥中表達(dá)/過表達(dá)植物BECLIN 1 基因的轉(zhuǎn)基因植物。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述方法用于在上面所列的植物中誘發(fā)雄性不育。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，涉及重組載體用于在上面所列的植物中誘發(fā)雄性不育的用途。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，其提供了在植物中誘發(fā)雄性不育的試劑盒，其包含
a.具有花藥特異性啟動子和植物1基因的載體；
b.合適的試劑；
c.說明手冊。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及通過在花粉發(fā)育的早期階段在花藥的絨氈層中表達(dá)植物ι基因生產(chǎn)雄性不育植物的方法。其也涉及AtBECLIN 7以爪6基因在植物中誘發(fā)雄性不育的用途。在本發(fā)明中，在花粉發(fā)育的第2和第3階段在絨氈層中表達(dá)IlATGb基因。這導(dǎo)致絨氈層正常細(xì)胞死亡程序的破壞并在誘發(fā)絨氈層程序性細(xì)胞死亡(P⑶)中發(fā)生延遲。因此，形成的花粉是異常的，具有完整絨氈層，導(dǎo)致雄性不育。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系與野生型煙草植物相比顯示了嚴(yán)重降低的花粉產(chǎn)生。產(chǎn)生的花粉是畸形的且它們中的大多數(shù)為空的。甚至在體外花粉萌發(fā)實(shí)驗中，這些轉(zhuǎn)基因系的花粉粒也不能萌發(fā)，并且萌發(fā)的花粉粒顯示短花粉管。這是首次證明了在花藥細(xì)胞中表達(dá)植物自噬相關(guān)基因(4爪6基因)可導(dǎo)致雄性不育。我們報導(dǎo)在合適的階段在絨氈層中表達(dá)的合適啟動子驅(qū)動下的植物7以爪6基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因煙草中導(dǎo)致雄性不育。本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)化植物以賦予雄性不育的重組構(gòu)建體，其中表達(dá)盒包含與如 SEQ ID NO: 1所示的植物他’α/Λ/7以爪6或其功能性變體的多核苷酸序列可操作連接的調(diào)控序列。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述植物在表達(dá)所述基因后具有可被特異性破壞的植物部分。此外，本發(fā)明提供了通過在絨氈層中表達(dá)所述基因產(chǎn)物生產(chǎn)雄性不育轉(zhuǎn)基因植物的方法。在本發(fā)明中，術(shù)語在植物中的雄性不育表示約90-100%的不育和在花藥中產(chǎn)生 0-10%的活花粉。
“克隆載體”為在宿主細(xì)胞中具有自主復(fù)制能力的DNA分子，例如質(zhì)粒、黏端質(zhì)?；蚴删w?？寺≥d體通常包含一個或少數(shù)限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)以及適用于鑒定和選擇用克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記基因，外來DNA序列可以確定的方式在限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)插入而不丟失載體的基本生物學(xué)功能。標(biāo)記基因通常包括提供抗生素或除草劑抗性的基因。“表達(dá)盒”是包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因和驅(qū)動其表達(dá)的啟動子的DNA分子。通常將基因表達(dá)置于特定的組織特異性調(diào)控元件的控制下。術(shù)語“表達(dá)”指基因產(chǎn)物的生物合成。例如，在結(jié)構(gòu)基因的情況下，表達(dá)包括將結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為mRNA和將mRNA翻譯為一種或多種多肽。

“重組載體”是已插入外來DNA的載體?！氨磉_(dá)載體”是其中表達(dá)盒已被遺傳工程化的載體。“雙元載體”能夠在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌二者中復(fù)制。其通常包含代替T-DNA的外來DNA，左和右T-DNA邊界，用于在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌二者中選擇和保持的標(biāo)記，用于植物的可選擇標(biāo)記。由于已去除了位于T-DNA中的其腫瘤誘發(fā)基因，此質(zhì)粒被認(rèn)為是無害的。“合適的啟動子”包括在特定組織的那些特定細(xì)胞中控制基因表達(dá)的組織特異性或細(xì)胞特異性啟動子?！盎ㄋ幪禺愋詥幼印笔桥c植物的一些或所有其他組織相比，引導(dǎo)相關(guān)基因在花藥組織中較高水平轉(zhuǎn)錄的DNA序列。在本發(fā)明中合適的啟動子僅在對花粉形成或功能關(guān)鍵的細(xì)胞中(包括絨氈層細(xì)胞、花粉母細(xì)胞和早期小孢子)引導(dǎo)表達(dá)。“植物他’α 1以爪6的功能性變體”是保留自噬誘發(fā)性能和與如SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有80%相似性的變體。陳述以下實(shí)施例作為本發(fā)明的特定和優(yōu)選實(shí)施方案的代表，不應(yīng)將其解釋為用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
從擬南芥中分離編碼1/ATG&基因的cDNA
植物材料在這里描述的實(shí)驗中均使用擬南芥的哥倫比亞生態(tài)型(Col-Ο)。植物在具有16小時光/8小時黑暗的光循環(huán)和23°C白天/18°C夜晚的溫度循環(huán)的生長箱中在蛭石 /泥炭蘚/珍珠巖(1:1:1)的復(fù)合土壤混合物上生長。自噬的人工誘發(fā)分離3周大的植物的第三和第四片蓮座葉并使它們漂浮在培養(yǎng)皿中的去離子水上，近軸側(cè)向上。將葉在22 士 1°C和黑暗中孵育48小時。植物BECLIN 1/ATG6基因的克隆使用TRI試劑(Sigma)從誘發(fā)自噬的擬南芥葉中提取總RNA。使用NanoDrop ND-1000 UV-Vis分光光度計測量總RNA的量。通過在紫外光下顯像溴化乙錠著色的瓊脂糖凝膠中的rRNA檢查RNA的質(zhì)量。10微克總RNA用于cDNA 制備。使用superscript 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明書生成cDNA。
ffliiiliffl一^E弓L5，_ct已 gtc tag aat gag gaa aga gga gat tcc 已g已_3，禾口5，_cgt cga get cct aag ttt ttt tac atg aag get ta_3’，使用 cDNA 作為模板擴(kuò)增植物他’1/ 基因。PCR反應(yīng)由30個循環(huán)的94°C 30秒，58°C 30秒和72°C 90秒組成。將1. 5kb 的 PCR 產(chǎn)物克隆至 pBluescript SK+ 載體(Stratagene, La Jolla, CA)。通過使用 Big Dye Terminator v3. 1循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems)測定克隆的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列。使用BLAST程序分析序列同源性。
實(shí)施例2
絨氈層特異性啟動子和植物1/ATG&之間的嵌合基因融合的構(gòu)建在早期階段，絨氈層特異性Ikb BamHl/Xbal啟動子與1. 5 kb Xbal/Sacl植物他’α/Λ7 基因和250 bp Sacl/EcoRl Nos終止 子在BamHl/EcoRl Sk+克隆載體中融合。將包含片段BamHl/EcoRl的整個表達(dá)盒進(jìn)一步亞克隆至雙元載體ρΒΙΙΟΙ。得到的攜帶表達(dá)盒的PBIlOl根據(jù)修改的實(shí)驗方案引入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404(Cangelosi等人，1991)。實(shí)施例3 煙草植物的轉(zhuǎn)化
如在實(shí)施例2中描述的，使用攜帶表達(dá)盒的重組根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化珀蒂哈瓦那煙草 iNicotina tabacum cv. Peiii湯)，使用Horsch等人在1985年描述的實(shí)驗方案。簡而言之，將包含具有上述表達(dá)盒的雙元載體的根癌農(nóng)桿菌LBA 4404的單個分離菌落接種至含有抗生素鏈霉素(250mg/ml)、利福平(50mg/ml)和卡那霉素(100mg/ml)的 YEP培養(yǎng)基中并使其生長(200 rpm，過夜，28°C)。50微升過夜培養(yǎng)物在YEP培養(yǎng)基中稀釋至IOOml并使其生長至OD6tltl達(dá)到0. 8。通過在SS34旋轉(zhuǎn)器(5，000 rpm, 10 min, 4°C )中離心回收細(xì)胞。將沉淀在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS鹽，2%葡萄糖，10 mM MES和100 mM乙酰丁香酮 (acetosyrengone), pH 5. 6)中懸浮至0D_ 0.6。將煙草葉圓片與根癌農(nóng)桿菌在黑暗中共培養(yǎng)2天。共培養(yǎng)后，將葉圓片轉(zhuǎn)移至添加氨噻廂頭孢菌素(250 mg/ml)和卡那霉素(100 mg/ ml)的再生培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物在25°C在16小時光和8小時黑暗的循環(huán)下培養(yǎng)4周時間。 在這之后，收獲轉(zhuǎn)基因幼苗并轉(zhuǎn)移至包含卡那霉素(50 mg/ml)的生根培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)2_4 周后，將預(yù)測的轉(zhuǎn)基因小植物轉(zhuǎn)移至Hoagland溶液以適應(yīng)環(huán)境，然后轉(zhuǎn)移至蛭石中鍛煉3周。 將植物從蛭石轉(zhuǎn)移至溫室的土壤中。培育攜帶表達(dá)盒(嵌合基因融合)的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系。實(shí)施例4
轉(zhuǎn)基因系的轉(zhuǎn)基因整合分析
通過DNA提取的CTAB法分離轉(zhuǎn)基因系和對照植物中基因組DNA。使用基因組DNA作為模板，通過使用一組弓I物 5，CgC gga tcc aga tct tcc aac att tact cc aag gg 3，禾口 5，cgt cga get cct aag ttt ttt tac atg aag get ta 3，來擴(kuò)增包含 TA29 啟動子禾口植 % BECLIN 1基因的2. 5kb片段。PCR反應(yīng)由94°C 4分鐘，94°C 1分鐘，60°C 1分鐘和 720C 2分鐘，進(jìn)入第2步循環(huán)30次和72°C 5分鐘組成。在轉(zhuǎn)基因系和陽性對照的PCR 中得到2. 5kb的預(yù)期條帶，而在對照植物和陰性對照(無模板)中沒有此條帶。重復(fù)此實(shí)驗 3次以確認(rèn)。實(shí)施例5
轉(zhuǎn)基因系的雄性不育分析
轉(zhuǎn)基因植物良好地生長至可見的成熟并顯示正常的開花。在花藥中表達(dá)自噬基因沒有導(dǎo)致任何形態(tài)學(xué)的異常，除了無法存活的花粉和極差或沒有的結(jié)籽。因此轉(zhuǎn)基因植物是雄性不育的。通過二乙酸熒光素染色評估了花粉的生存力(Heslop-Harrison，1970)。在開花期收集花粉樣品并通過熒光染料程序(FCR)檢測其質(zhì)量，F(xiàn)CR主要檢測植物細(xì)胞原生質(zhì)膜的完整性。此完整性看起來與生存力緊密聯(lián)系。轉(zhuǎn)基因植物的大多數(shù)花粉是不能存活的。 如表1所示，3個轉(zhuǎn)基因系的植物具有5至14%的存活的花粉，其余的植物花粉沒有顯示熒光(


圖1)。另一方面，對照植物(攜帶包含在絨氈層特異性啟動子驅(qū)動下的⑶S報告基因的表達(dá)盒的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系)顯示了 80至92%的花粉生存力(表2，
圖1)。使用Kwack (1964)建議的人工液體培養(yǎng)基進(jìn)行了體外花粉萌發(fā)檢測。在培養(yǎng)的對照植物(攜帶包含在絨氈層特異性啟動子驅(qū)動下的GUS報告基因的表達(dá)盒的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系)的一個花藥的花粉中觀察到大量花粉萌發(fā)，而轉(zhuǎn)基因系的花粉或者不能萌發(fā)，或者即使萌發(fā)也顯示了嚴(yán)重延遲的花粉管生長。與對照植物中的62-75%相比，在4個不同系的轉(zhuǎn)基因植物(攜帶包含在絨氈層特異性啟動子驅(qū)動下的植物1/ATG^基因的表達(dá)盒的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系)中觀察到0-1%的花粉萌發(fā)(表1和表2)。此外，在掃描電鏡下觀察了花粉粒。轉(zhuǎn)基因系的花粉粒顯示了外壁蝕刻模式和缺乏萌發(fā)孔的差異(圖3)。在所有6個系的轉(zhuǎn)基因植物中果實(shí)成形是正常的，但鱗莖具有較小的尺寸。在轉(zhuǎn)基因植物的鱗莖中結(jié)籽受到嚴(yán)重影響。12個不同系的轉(zhuǎn)基因植物的每個莢果的種子重量為 0至32. 07mg，而在對照植物中每個莢果的種子重量為36. 6mg至113. 34mg (表3和表4)。表1 花粉生存力和花粉萌發(fā)的評估
權(quán)利要求
1. 一種通過在花粉發(fā)育的早期階段在花藥的絨氈層中表達(dá)植物ι基因生產(chǎn)雄性不育植物的方法。
2.權(quán)利要求1要求保護(hù)的方法，其包括以下步驟a.分離約3周大的擬南芥(Jriii/oAsh植物的第三和第四片蓮座葉并使它們漂浮在培養(yǎng)皿中的去離子水上，近軸側(cè)向上；b.將步驟(a)中得到的所述蓮座葉在22士 1°C在黑暗中孵育約48小時以人工誘發(fā)自噬；c.如本文描述的從步驟(b)中得到的誘發(fā)自噬的葉中提取總RNA；d.通過已知方法從步驟(c)中提取的總RNA制備cDNA；e.使用基因特異性引物通過PCR從步驟(d)中制備的cDNA中擴(kuò)增植物他’ 基因；f.如本文描述的將步驟(e)中得到的擴(kuò)增的植物BECLIN1/ATG6基因克隆至載體；g.通過具有^^ID no. 3的絨氈層特異性啟動子和從步驟(f)中得到的具有％(1 ID no. 1的植物Sedi/ 7以爪6基因和Nos終止子序列之間的基因融合在克隆載體中構(gòu)建表達(dá)盒；h.如本文描述的將步驟(g)中構(gòu)建的表達(dá)盒亞克隆至雙元載體；i.將攜帶所述表達(dá)盒的步驟(h)得到的雙元載體引入根癌農(nóng)桿菌如cteri tumefaciens )；j.用步驟(i)中得到的重組根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化待誘發(fā)雄性不育的植物；k.培育獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系。
3.權(quán)利要求1要求保護(hù)的方法，其中在選自煙草、棉花、稻、小麥、玉米、馬鈴薯、番茄、 油菜、苜蓿、向日葵、洋蔥、三葉草、大豆、豌豆的植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
4.通過權(quán)利要求1的方法得到的一種植物、細(xì)胞、組織。
5.一種用于在植物中通過轉(zhuǎn)化誘發(fā)雄性不育的重組載體，其由以下組成i.花藥特異性啟動子；ii.植物召萬位7}￥7基因；iii.Nos終止子序列。
6.權(quán)利要求5要求保護(hù)的重組載體，其中使用的所述花藥特異性啟動子為SEQID NO: 3所示的絨氈層特異性啟動子。
7.權(quán)利要求5要求保護(hù)的重組載體，其中植物他’α/Λ/7基因具有SEQID NO: 1并編碼具有SEQ ID NO: 2或其同源物的多肽。
8.權(quán)利要求5要求保護(hù)的重組載體，其中所述表達(dá)盒包含在絨氈層特異性啟動子和植觀Beclin 7以爪6基因之間的嵌合基因融合，表達(dá)盒具有SEQ ID NO: 4所示的多核苷酸序列。
9.使用權(quán)利要求5的所述重組載體轉(zhuǎn)化的一種植物、細(xì)胞、組織。
10.一種在其花藥中表達(dá)/過表達(dá)植物1基因的轉(zhuǎn)基因植物。
11.權(quán)利要求1要求保護(hù)的方法在選自權(quán)利要求3所列植物的植物中誘發(fā)雄性不育的用途。
12.權(quán)利要求5要求保護(hù)的重組載體在選自權(quán)利要求3所列植物的植物中誘發(fā)雄性不育的用途。
13. 一種在植物中誘發(fā)雄性不育的試劑盒，其由以下組成a.具有花藥特異性啟動子和植物1基因的載體；b.合適的試劑；c.說明手冊。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)雄性不育植物的方法。其包括通過使用自噬相關(guān)基因植物BECLINI/ATG6選擇性殺傷植物的生殖細(xì)胞。受絨氈層特異性啟動子調(diào)控的包含植物BECLINI/ATG6的表達(dá)盒可誘發(fā)對絨氈層細(xì)胞的殺傷。特別的目的領(lǐng)域是用所述遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物并在花藥發(fā)育的早期階段在絨氈層中表達(dá)植物BECLINI基因以導(dǎo)致絨氈層的過早瓦解從而生產(chǎn)不能存活的花粉，因此賦予植物雄性不育。
文檔編號A01H5/00GK102257143SQ200980147541
公開日2011年11月23日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者圖利 R., P. 辛 S., V. 薩萬特 S. 申請人:科學(xué)及工業(yè)研究委員會