專(zhuān)利名稱(chēng)：：增加活生物材料的生存力和脅迫耐性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：在軟骨細(xì)胞、酵母和細(xì)菌中已經(jīng)研究了與增加的脅迫耐性和休克蛋白質(zhì)有關(guān)的流體靜力壓協(xié)迫作用，但是卻沒(méi)有在配子和胚胎中進(jìn)行過(guò)相應(yīng)的研究。范圍為30-50MPa的流體靜力壓通常抑制多種生物的生長(zhǎng)DNA復(fù)制的起始是細(xì)胞內(nèi)對(duì)壓力最為敏感的過(guò)程之一(Abe等人，1999)。取決于壓力的大小和持續(xù)時(shí)間，該影響的嚴(yán)重性是不同的(Murakami和Zimmerman,1973)。注意到細(xì)胞膜是壓力損傷的主要位點(diǎn)(Palou等人，1997)。高流體靜力壓處理可以改變膜的功能性，例如主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)或者被動(dòng)滲透，并因此可以干擾細(xì)胞的物理-化學(xué)平衡(Yager和Chang,1983;Aldridge和B訓(xùn)er，1985^Macdonald,1987;Schuster和Sleytr，2002)Routray等人，2002)。壓力的應(yīng)用可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，包括部分或者完全的解折疊構(gòu)象。壓力可以引起蛋白質(zhì)的變性(Schmid等人，1975;Weber和Drickamer,1983;Jaenicke，1991;Gross和Jaenicke，1994;Silva等人，2001)。最近的報(bào)道表明流體靜力壓提高休克蛋白質(zhì)的生產(chǎn)(Welch等人，1993;Wemekamp-Kamphuis等人，2002)。在改變的壓力條件下生理或者生化過(guò)程服從于LeChatelier原理伴隨體積減小的所有反應(yīng)的速度相當(dāng)大地增加(Murakami和Zimmerman,1973;Welch等人，1993;Palou等人，1997)。超過(guò)一定水平的壓力作用的積累是致死的而在較高的壓力下一些生物分子發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的改變，在300MPa大多數(shù)的細(xì)菌和多細(xì)胞生物死亡。盡管如果緩步動(dòng)物處于脫水狀態(tài)時(shí)，其可以在高達(dá)600MPa的壓力下存活，但是在其活動(dòng)狀態(tài)時(shí)，其在100至200MPa的壓力下死亡(Seki和Toyoshima,1998)。早期的文獻(xiàn)表明只要緩慢地降低壓力，生物系統(tǒng)能夠耐受高壓(Johnson等人，1954)。Pribenszky等人，(2003,2004)也探究了使加壓后的胚胎逐步恢復(fù)的可能性，并發(fā)現(xiàn)逐步的釋放壓力顯著地增加了存活。之前，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)亞致死休克(高流體靜力壓(HHP))顯著地改善了冷凍小鼠胚泡融化后的存活(Pribenszky等人，2005a，WO2005022996)。相似地，在精液深低溫保藏時(shí)，經(jīng)壓力預(yù)處理的每個(gè)加壓后的牛精液與沒(méi)有進(jìn)行在先加壓處理的冷凍樣品相比較，其平均融化后的游動(dòng)性顯著地更好。結(jié)果清楚的表明了在先的壓力處理對(duì)深低溫保藏的公牛精液的融化后游動(dòng)性的有益作用(Pribenszky等人，2005b)。進(jìn)一步地探究在HHP過(guò)程中的生物學(xué)背景和生化改變的研究將揭示其保護(hù)作用的機(jī)制。然而，這些研究包括HHP預(yù)處理后生物材料的深低溫保藏，對(duì)于多種生物材料而言這顯然是不可能的或者是低效的。已經(jīng)良好建立了將精液在0。C之上的溫度冷藏(chill)或儲(chǔ)存的方法，以便短期儲(chǔ)存精子[Hackett,等人，1982;Pinto，1999;O'Shea等人，1964。使用最適的精液處理(稀釋)并儲(chǔ)存在最適的溫度，在收集后1-2天內(nèi)，精液可以用于授精并具有可接受的授精力，但是，與新鮮精液的授精相比較，具有明顯減少的受胎率[Gill等人，1970;Goodman和Cain，1993;Harrop,1954;ljaz和Ducharme,1995;Katila等人，1997。這些方法遵循非常相似的基本步驟101.收集精液。2.在體溫稀釋精液。3.任選的，對(duì)稀釋后的精液離心。再次增容(Re-extending)精液以調(diào)整最適的精子濃度。4.將增容(再次增容)的精液維持在室溫或者4-5。C或者任何高于樣品冰點(diǎn)的溫度。5.以精液進(jìn)行授精。相似地，例如在保藏微生物，例如細(xì)菌(例如冷凍干燥)期間，微生物的生存力將嚴(yán)重遭到損害。隨著生存力改善而帶來(lái)的任何方法效力的改善具有著巨大的科學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)意義。本發(fā)明的發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過(guò)施加流體靜力壓攻擊(challenge)，生物材料的生存力可以被顯著地改善，并且通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的方法，許多現(xiàn)有生物工程方法可以被更有效的完成。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)給出了關(guān)于此發(fā)現(xiàn)的許多實(shí)例將本發(fā)明方法應(yīng)用于胚胎移植或受精后，受胎率和出生率得到提高；通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞應(yīng)用本發(fā)明方法，卵母細(xì)胞的脅迫耐性被極大地提高，這導(dǎo)致提高的卵裂率和更高的胚泡形成率；通過(guò)對(duì)精液應(yīng)用本發(fā)明的方法，然后進(jìn)行本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的稀釋和儲(chǔ)存，精子活力被保存顯著更長(zhǎng)的時(shí)間。還令人驚訝的是，即使當(dāng)在生物材料的儲(chǔ)存和/或操作的任何階段期間，避免使用低于介質(zhì)水點(diǎn)的溫度時(shí)，改善仍是實(shí)質(zhì)性的。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于本發(fā)明和相似的HHP方法的使用具有顯著的實(shí)踐意義。在本申請(qǐng)中，我們必需強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)于可以在輔助生殖技術(shù)(ART)和其它技術(shù)中使用的任何不同的生物技術(shù)/生物工程方法或操作，本發(fā)明的概念均可以等價(jià)地適用，并且對(duì)這些方法或操作的選擇在本發(fā)明中是不受限的。在本發(fā)明改良方法中唯一需要包括的步驟是流體靜力壓攻擊步驟；遵循本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地優(yōu)化其參數(shù)。因此，本發(fā)明涉及用于改善活的生物材料的生存力和/或脅迫耐性以及使用所述材料的方法，其包括U)向所述的活的生物材料施加流體靜力壓；(b)在該流體靜力壓下維持所述的活的生物材料預(yù)定的一段時(shí)間；(c)釋放該流體靜力壓；(d)將所述的材料根據(jù)任何有用的操作方案用于任何期望的目的，條件是所述的用途不包括深低溫冷藏。[24在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中使用的壓力是1至200MPa。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選的壓力是10至100MPa，更優(yōu)選20至75MPa，并且最優(yōu)選30至60MPa。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的流體靜力壓的施加時(shí)間介于"瞬時(shí)，，和300分鐘之間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選施加壓力0.001秒至600分鐘，優(yōu)選1秒至300分鐘，更優(yōu)選10秒至150分鐘，更優(yōu)選20秒至90分鐘，最優(yōu)選30秒至60分鐘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于釋放壓力的時(shí)間期限為10秒至2小時(shí)，或者為1分鐘至1小時(shí)，或者另一種情況是10分鐘至30分鐘。壓力的釋放可以是瞬時(shí)的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)預(yù)定的壓力曲線施加、維持和釋放壓力的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中所述的生物材料是微生物培養(yǎng)物的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的微生物培養(yǎng)物是細(xì)菌培養(yǎng)物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述的任何方法，其中所述的生物材料的使用可以結(jié)合可用于輔助生殖技術(shù)、生物技術(shù)和/或生物工程操作領(lǐng)域中的任何4支術(shù)、^Mt。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中使用的操作是冷凍干燥。[35]再一方面，本發(fā)明的方法用于改善活的生物材料的脅迫耐性，其中抗增加的溫度的耐受性被改善。[36作為高度發(fā)育的真核生物，小鼠胚胎比緩步動(dòng)物和細(xì)菌對(duì)流體靜力壓的作用更敏感。因此，第一個(gè)目的是建立小鼠胚胎在壓力下有關(guān)其形態(tài)學(xué)和存活的基本特征。10[41實(shí)施仔細(xì)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)以研究小鼠胚胎的壓力耐受性。所用壓力和時(shí)間范圍的選棒故限定為可以為以后的實(shí)踐應(yīng)用提供最寬的可應(yīng)用范圍。因此，在本發(fā)明的方法中使用的壓力在從lMPa至150MPa的范圍中選擇。更特別地，可以應(yīng)用于擴(kuò)展的胚泡期胚胎的流體靜力壓是l、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150MPa或者介于這些中間范圍之間的任何值。相似地，對(duì)于將小鼠胚胎保持在高流體靜力壓下的時(shí)間期限，可以有寬的選擇。更特別地，將小鼠胚胎保持在選定的壓力下的時(shí)間期限是1秒至6小時(shí)，更特別地，ls、5s、10s、20s、30s、40s、50s、1min、2min、3min、4min、5min、6min、8min、10min、15min、20min、30min、40miii、50min、60min、70min、80min、90min、120min、150min、180min、210min、240min、300min或360min。胚胎在壓力下生存的時(shí)間隨著壓力的增加而降l氐。越高的壓力，胚胎存活的時(shí)間越短。超出特定大小和持續(xù)時(shí)間的壓力沖擊引起不可逆轉(zhuǎn)的改變?cè)隗w外培養(yǎng)2小時(shí)之后胚胎分解或者在解壓之后胚胎已經(jīng)分解(例如用卯Mpa攻擊胚胎2h或者用30Mpa攻擊5h)?；谒褂玫木唧w生物材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定這些壓力限制和時(shí)間限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是根據(jù)本發(fā)明的壓力處理可以根據(jù)4壬^T期望的壓力曲線而實(shí)施。因此，才艮據(jù)不同的時(shí)間-壓力曲線，壓力施加、保持和釋放時(shí)壓力對(duì)時(shí)間的M關(guān)系可以改變，包括壓力處理的所有時(shí)間點(diǎn)，即，在施加壓力期間、在最大壓力期間，以及在壓力釋放階段。顯然，基于本發(fā)明的教導(dǎo)，在不需要過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下，根據(jù)容易實(shí)施的預(yù)實(shí)驗(yàn)，可以優(yōu)化和設(shè)置任何給定時(shí)間點(diǎn)的壓力水平。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以根據(jù)預(yù)定的溫度曲線實(shí)施本發(fā)明的方法。術(shù)語(yǔ)"溫度曲線"指在壓力處理的過(guò)程中可檢測(cè)的或者設(shè)立的時(shí)間-溫度曲線，并且其可以獨(dú)立于施加的壓力進(jìn)行控制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，盡管可以在單一的溫度實(shí)施壓力處理，然而，目的生物材料可以要求在壓力處理的不同階段或者不同的階段部分使用不同的溫度。設(shè)立的溫度可以是任何溫度，例如室溫、環(huán)境溫度、生物材料所來(lái)源自的天然體溫、稍孩史高于所述天然體溫的溫度等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)分析壓力處理相比較于對(duì)照實(shí)驗(yàn)的效率，可以容易地確定任何給定的溫度曲線的適用性。不局限于理論，這個(gè)特征的一個(gè)可能解釋是在壓力下相當(dāng)量的C02會(huì)產(chǎn)生(Abe和Horikoshi1995)。提高的壓力可以促進(jìn)C02的7jC合和離子化(HC(V和H+)，這是因?yàn)樵摲磻?yīng)以依賴(lài)于所用壓力的大小的方式伴隨著體積的減少(-0.26ml/mol)(Palou等,1997，Welch等，1993)。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的二氧化碳迅速溶解，并且然后解離以產(chǎn)生HC(V和H+,由此也降低了細(xì)胞內(nèi)pH(Abe和Horikoshi1995,1997，1998,Abe等人，1999)?？梢韵氲剑诖髿鈮合?，通過(guò)提高的壓力維持的該平衡對(duì)于胚胎是致死性的。也可以假設(shè)壓力的瞬時(shí)降低會(huì)引起co2從細(xì)胞質(zhì)中從其水合和離子化形式被提高的釋放出來(lái)，從而引，胎的迅速的死亡。在某解壓時(shí)間的條件下，通過(guò)提高的流體靜力壓可逆失活的質(zhì)膜蛋白質(zhì)(H、ATPase)開(kāi)始重新發(fā)揮功能(與被動(dòng)擴(kuò)散一起)，從而使該平衡逐步的轉(zhuǎn)向生理狀態(tài)(Schmid等人,1975,Pequeux和Gilles1978)。相似于胚胎的處理，對(duì)公牛和公豬的精液進(jìn)行加壓以檢測(cè)精子的壓力耐受性。然后，使用小心地選擇的參數(shù)，對(duì)精液預(yù)處理并在不同的溫度下體外保存。在收集精液后不同時(shí)間點(diǎn)的游動(dòng)精子數(shù)目，用壓力處理的比沒(méi)有經(jīng)過(guò)壓力處理的高。壓力處理的公豬精液的授精產(chǎn)生比在該機(jī)構(gòu)中常規(guī)可獲得的更高的胎仔數(shù)。相似于上述的處理，對(duì)大腸桿菌(五sc^/7Wi/flco/z')和植物乳桿菌(Z^icto^"7/"s/7/"wtom柳)樣品加壓以檢測(cè)在冷凍干燥之后細(xì)菌的存活是否可以^皮提高。在選定的壓力/時(shí)間參數(shù)下用壓力處理的細(xì)菌在冷凍干燥后比沒(méi)有上述處理的細(xì)菌具有更高的存活數(shù)。[53本發(fā)明書(shū)通過(guò)使用小鼠胚泡、豬卵母細(xì)胞、公豬和公牛精子和兩個(gè)細(xì)菌物種作為模型系統(tǒng)，證實(shí)了流體靜力壓攻擊對(duì)生物材料的生存力/存活能力的改善。這可以分別通過(guò)下述方式進(jìn)行評(píng)估加壓處理之后，移植加壓處理后的胚胎至培養(yǎng)基中和/或假孕受體中；或者體外激活；或者授精該處理后的精液或者在冷凍干燥之后計(jì)數(shù)存活的細(xì)菌。體外發(fā)育、移植和進(jìn)一步的子宮發(fā)育、和卵裂以及進(jìn)一步的發(fā)育是胚胎和卵母細(xì)胞生存力的明顯證據(jù)。相似地，精液的體外儲(chǔ)存和授精，產(chǎn)生較高數(shù)目的游動(dòng)精子(體外)和較高數(shù)目的妊娠率也支持所述方法的適用性。可以通過(guò)使用任何可獲得的加壓裝置(其可以適用于本發(fā)明的方法)而實(shí)現(xiàn)加壓。這種裝置的非限制性實(shí)例是，例如W02005022996中描述的裝置或者本申請(qǐng)中描述的裝置。從超排卵的6-8周齡的CB6F1供體收集一細(xì)胞期的小鼠胚胎，并培養(yǎng)在G1.2和G2.2培養(yǎng)基(Vitrolife,G6teborg)中(37。C，5%C02，最大空氣濕度)，直到擴(kuò)展的胚泡期。加壓處理盡管公牛精液通常冷凍儲(chǔ)存，M是在工業(yè)重要的系統(tǒng)中進(jìn)一步檢測(cè)了本發(fā)明方法的可行性。[64]4吏用AndroMed增容劑(MiniTi3b，Tiefenbach,德國(guó))將13頭公牛的精液稀釋到精子的濃度為8x107/mL25°C將稀釋的精子裝載入0.25mL吸管。將吸管分為處理組和非處理對(duì)照組。使用9種不同曲線以計(jì)算機(jī)控制的壓力機(jī)器(Cryo-Innovation，布達(dá)佩斯，匈牙利)對(duì)處理組加壓處理。對(duì)于總/進(jìn)程性的游動(dòng)性檢測(cè)，使用CASA裝置，SpermVisionVersion3.0(Mini憂b，Tiefenbach,德國(guó))。結(jié)論是低于600bar的壓力處理對(duì)精子存活沒(méi)有副作用。室溫儲(chǔ)存精液8小時(shí)之后，再次對(duì)處理的樣品/未處理的樣品的游動(dòng)性進(jìn)行分析處理樣品中的游動(dòng)的細(xì)胞的比例較高。實(shí)施例3.在室溫不同壓力下7>豬精子的存活，壓力處理對(duì)防止精子活力下降的作用每周兩次收集公豬的精液。通過(guò)帶手套的手將過(guò)濾的富M子的級(jí)分收集在250ml絕緣的真空瓶中，然后評(píng)估精子(Hancock和Hovell,1959)。使用具有大于70。/。的游動(dòng)精子的射出精液的富含精子的級(jí)分。精液制備20分鐘孵育之后，兩滴5jil液滴轉(zhuǎn)移到載玻片上，并il/f吏用兩個(gè)22mmx22mm的蓋玻片。將樣品插入到配備有37。C顯孩史鏡載物臺(tái)和相差光學(xué)物鏡(20X,Olympus,日本)的顯微鏡(OlympusBX30)中，從每個(gè)液滴通過(guò)CASA裝置，SpermVisionVersion3.0(Miniti3b，Tiefenbach,德國(guó))對(duì)5-5視野進(jìn)行評(píng)估。具有VSL>10jim/s和AOC>10的精子被j人為是前進(jìn)性游動(dòng)的(Progressivemotile)。結(jié)果表l不同壓力處理之后的游動(dòng)性參數(shù)(平均游動(dòng)性(標(biāo)準(zhǔn)誤))<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>[79]tm:總游動(dòng)性；pm:前進(jìn)性游動(dòng)性。在40、80和120分鐘的時(shí)間間隔，每個(gè)壓力處理分別有4、3和2個(gè)重復(fù)。超聲波檢測(cè)證明5頭母豬都懷孕。經(jīng)過(guò)正常分娩，出生58頭健康的小豬。小豬沒(méi)有任何的缺陷和畸形。得出結(jié)論使用的壓力處理維持了公豬精子的受精能力，并且在后代中沒(méi)有引起任何的缺陷和畸形。農(nóng)場(chǎng)平均的胎仔數(shù)是9.8頭小豬/母豬，而使用壓力處理導(dǎo)致100%的妊娠率和11.6的平均胎仔數(shù)。因此，也得出結(jié)論使用的壓力處理也提高了可獲得的平均胎仔數(shù)。實(shí)施例5.不同壓力處理之后豬卵母細(xì)胞的存活(體外激活之后的卵裂)三百至六百個(gè)體外成熟的卵母細(xì)胞(每日)被分為處理組(n=15-20卵母細(xì)胞/組)和對(duì)照組。在24。C使用200-800bar對(duì)0.5ml人造吸管中TCM-HEPES培養(yǎng)基中(使用礦物油和金屬球?qū)⑽苊芊?的具有卵丘細(xì)胞的組加壓處理30-120min。將對(duì)照保持在相同的環(huán)境中，并且一個(gè)對(duì)照組在恒溫器中于IVM培養(yǎng)基中保留相應(yīng)的時(shí)間。處理之后，使用渦旋使卵母細(xì)胞棵露，然后使用比最佳值強(qiáng)IO倍的電脈沖體外激活卵母細(xì)胞，并且將其置于38.5°C恒溫器中于培養(yǎng)基中以用于進(jìn)一步發(fā)育。激活之后48小時(shí)檢測(cè)卵裂。在第6天檢測(cè)胚泡的形成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。93表4.使用10x電脈沖體外激活之后，在不同的組中卵裂和進(jìn)一步發(fā)育的卵母細(xì)胞的百分比。將樣品填充到0.5ml無(wú)菌的人造吸管中，并使用無(wú)菌鐵球密封。在Edwards冷凍千燥設(shè)備上進(jìn)行冷凍干燥。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。下表中列出了相應(yīng)的結(jié)果。表6.在冷凍干燥之前和之后活大腸桿菌細(xì)胞的數(shù)目(c.f.u,/0.4ml)(兩次重復(fù))(處理之前的最初細(xì)胞數(shù)(c.f.u./ml):4.08x108-4.10x108)[102<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>受精培養(yǎng)基補(bǔ)充有BSA、青霉胺(penicilamin)、亞牛磺酸(hipotaurin)、腎上腺素和肝素的TALP,使用礦物油覆蓋。[106室溫下，通過(guò)在Percoll不連續(xù)密度梯度(2ml的45%Percoll覆蓋2ml的90%Percoll)中700g離心20分鐘從冷凍-融化的精子獲得游動(dòng)的精子。重懸精子之后，將其加入到授精液滴中。在39。C，5%C02的濕潤(rùn)空氣中孵育板19小時(shí)。然后在39。C，5%<:02的濕潤(rùn)大氣中，在礦物油下面的SOF小滴中體外培養(yǎng)惟測(cè)的受精卵。加壓處理經(jīng)性別決定的胚胎或者活檢后的胚胎的存活率，^^用特定選擇的壓力處理的比沒(méi)有處理的顯著地更高。實(shí)施例9.有/無(wú)壓力處理情況下基因轉(zhuǎn)移之后牛胚胎的存活本實(shí)驗(yàn)的目的是證明如果卵母細(xì)胞在先使用流體靜力壓處理后，其將以高非常多的效率耐受任何方法(包括體外儲(chǔ)存/成熟)。使用流體靜力壓處理卵母細(xì)胞并且在釋放壓力之后，將樣品保持在體外。與在先沒(méi)有使用壓力處理的樣品相比較，該卵母細(xì)胞的體外和體內(nèi)存活都被增強(qiáng)。實(shí)施例12.壓力處理之后，體外儲(chǔ)存的胚胎干細(xì)胞的存活由于在公豬(以及馬)中精液冷凍產(chǎn)生差的融化后精子存活，在這些物種中的最常用的育種方法是用新鮮的、增容的、增容的和冷卻的或者增容的和冷藏的精液進(jìn)行授精。通過(guò)使用HHP預(yù)處理，精液在給定的溫度可以獲得顯著更好地保存，并且具有較高質(zhì)量的儲(chǔ)存時(shí)間也被相當(dāng)大地延長(zhǎng)。GoodmanMF，CainJt.(1993)使用冷藏的擴(kuò)散的精液在狗中進(jìn)行人工受精的回顧評(píng)價(jià)(Retrospectiveevaluationofartificialinseminationwithchilledextendedsemeninthedog).JReprodFertil1993;47:554.abstr。Hackett,AJ;Wolynetz,MS(1982):使用在乳糖-卵黃-甘油緩沖液中擴(kuò)充并且儲(chǔ)存在5度的精液育種的總的分娩綿羊的生殖性能(Reproductiveperformanceoftotallyconfinedsheepbredwithsemenextendedinalactose-eggyolk-glycerolbufferandstoredat5degrees),CCanadianJournalOfComparativeMedicine.RevueCanadienneDeM.edecineComparee,Volume46,Issue3，July1982，Pages327-333。127HancockJ丄.，和HovellG.L.R.，1959，公豬精液的收集(Thecollectionofboarsemen),Vet.Res.71:664-669。Jaenicke,R.(1991)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)、定性和分子對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)(Proteinstabilityandmolecularadaptationtoextremeconditions)，EurJBiochem202,715-728。130JohnsonF.H.，EyringH.,PolissarM.J.，1954，分子生物學(xué)的運(yùn)動(dòng)勤出(TheCineticBasisofMolecularBiology),Wiley,NewYork。LaTeimA.，BrandiA.，F(xiàn)alconiM.，SpurioR.，PonC丄.，和GualerziCO.，1991，鑒定大腸桿菌主要的冷休克基因編碼的核苷酸蛋白H-NS的冷休克轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(Identificationofacold-shocktranscriptionalenhanceroftheEscherichiacolimajorcoldshockgeneencodingnucleotideproteinH-NS)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，10907-10911。ljazA,DucharmeR.(1995)多種增容劑和taunne對(duì)冷卻到5°C的種馬的精子存活的影響(Effectofvariousextendersandtaunneonsurvivalofstallionspermcooledto5'C)，Theriogenology1995，44:1039-1050。MaxwellW.M.C.，和JohnsonL.A.，1997，冷卻或者低溫冷凍之后的公豬精子的膜狀態(tài)(Membranestatusofboarspermatozoaaftercoolingorcryopreservation)，Theriogenology48:209-219。0'SHEA，T;WALES,RG(1964):在冷卻至并且儲(chǔ)存在5度的過(guò)程中鉀對(duì)精子的影響(EFFECTSOFPOTASSIUMONRAMSPERMATOZOADURINGCHILLINGTOANDSTORAGEAT5DEGREESC)，JournalOfReproductionAndFertility,Volume53，August1964，Pages121-132。Pequeux，A.,和Gilles，R.(1978),高流體靜力壓對(duì)一些涉及hydromineral調(diào)節(jié)的器官的膜的ATPases活性的影響(EffectsofhighhydrostaticpressuresontheactivityofthemembraneATPasesofsomeorgansimplicatedinhydromineralregulation)，CompBiochemPhysiolBBiochemMoIBio159,207-212。PribenszkyC，MoInarM.,CsehS.,SoltiL.，2005a，通過(guò)流體靜力壓攻擊而改善的深低溫保藏小鼠胚泡的融化后存活(Improvingpost-thawsurvivalofcryopreservedmouseblastocystsbyhydrostaticpressurechallenge),Anim.Reprod.Sci.87，143-150。Schuster,B.，Sleytr,U.B.(2002)，流體靜力壓對(duì)S-層-支持的脂膜的影響(TheeffectofhydrostaticpressureonS-layer-supportedlipidmembranes)，BiochimBiophysActa1563，29-34。Wemekamp-Kamphuis，H.H.，Karatzas,A.K.，Wouters,J.A.，Abee,T.(2002)，當(dāng)暴露于低溫和高流體靜力壓時(shí)，單核細(xì)胞增多性李斯特菌中被增加水平的冷休克蛋白質(zhì)(EnhancedlevelsofcoldshockproteinsinListeriamonocytogenesL028uponexposuretolowtemperatureandhighhydrostaticpressure),ApplEnvironMicrobiol68，456-63。Wouters,J.A.，Jeynov，B.，Rombouts，F(xiàn).M.,deVos，W.M.,Kuipers，O.P.，Abee，T.(1999),在低溫保藏的乳酸乳桿菌MG1363的7kDa冷休克蛋白質(zhì)的作用的分析(Analysisoftheroleof7kDacold-shockproteinsofLactobacilluslactisMG1363incryoprotection)，Microbiology145,3185-3194。Yager,P.，Chang,E丄.(1983)，通過(guò)高壓的脂質(zhì)非雙層相的去穩(wěn)、定4匕(Destabilizationofalipidnon-bilayerphasebyhighpressure),BiochimBiophysActa731，491-494。[156Yamanaka，K.，F(xiàn)ang,L.，Inouye，M.(1998)，大腸桿菌中的CspA家族用于協(xié)迫適應(yīng)的多基因重復(fù)(TheCspAfamilyinEscherichiacoli:multiplegeneduplicationforstressadaptation)，MolMicrobiol27，247-255。權(quán)利要求的方法，包括(a)向所述的生物材料施加流體靜力壓；(b)將所述的活生物材料保持在該流體靜力壓下預(yù)定的一段時(shí)間；(c)釋放該流體靜力壓；(d)將所述的材料依照任何有用的操作方案用于任何所需要的目的，M是所述的使用不包括深低溫冷藏。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述的流體靜力壓是l至200MPa,優(yōu)選10至100MPa，更優(yōu)選20至75MPa，最優(yōu)選30至60MPa。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中施加所述的流體靜力壓0.001秒至600分4中，優(yōu)選1秒至300分鐘，更優(yōu)選10秒至150分鐘，更優(yōu)選20秒至90分^t，最優(yōu)選30秒至60分鐘。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該壓力經(jīng)過(guò)介于瞬時(shí)釋》文與6小時(shí)之間的一段時(shí)間被逐步釋放。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的壓力根據(jù)預(yù)定的壓力曲線進(jìn)行施加、維持和釋放。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的壓力根據(jù)預(yù)定的溫度曲線進(jìn)行施加、維持和釋放。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的生物材料是配子或者胚胎，并且優(yōu)選選自脊推動(dòng)物的卵母細(xì)胞、精子、受精卵、桑椹胚、胚泡、胚胎、干細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的脊推動(dòng)物是魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)或者哺乳動(dòng)物，優(yōu)選牛、馬、山羊、綿羊、豬、其他家畜、寵物、包括人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)。9.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的生物材料是微生物的培養(yǎng)物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該微生物培養(yǎng)物是細(xì)菌培養(yǎng)物。11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生物材料的使用與可用于輔助生殖技術(shù)、生物技術(shù)和/或生物工程操作領(lǐng)域中的任何技術(shù)、操作方案相結(jié)合。12.根據(jù)權(quán)利要求l至ll中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的使用是冷凍干燥。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述的脅迫耐性是抗增加的溫度的耐受性。全文摘要本發(fā)明涉及用于改善活生物材料的生存力和/或脅迫耐性以及使用所述材料的方法，其包括向所述的生物材料施加流體靜力壓；將所述的活生物材料在該流體靜力壓下維持預(yù)定的一段時(shí)間；釋放該流體靜力壓；和將所述材料依照任何有用的操作方案用于任何所需要的目的。所述生物材料的使用可以與適用于輔助生殖技術(shù)、生物技術(shù)和/或生物工程操作領(lǐng)域中的任何技術(shù)或操作方案相結(jié)合。文檔編號(hào)A01N1/02GK101312646SQ200680043439公開(kāi)日2008年11月26日申請(qǐng)日期2006年11月21日優(yōu)先權(quán)日2005年11月22日發(fā)明者A·霍瓦特,C·普里本茨基,M·莫爾納申請(qǐng)人:森珀里有限公司