專利名稱：動(dòng)物用飼料添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有具生產(chǎn)酸性酶能力的曲霉屬菌的動(dòng)物用飼料添加劑。

背景技術(shù)：
家畜或?qū)櫸?以下稱為動(dòng)物)等的飼料雖然進(jìn)行了粉碎等加工，但通常并不進(jìn)行加熱處理等，因此有消化吸收率低、飼料效率差的問(wèn)題。另外，最近，已知作為人類疾病的潰瘍性結(jié)腸炎或克隆氏病等炎癥性腸道障礙在動(dòng)物中也有報(bào)道，引起痢疾等癥狀。已知上述炎癥性腸道疾病使飼料吸收低下或妨礙健康的健康育肥。引起動(dòng)物腸道感染癥的病原菌已知有病原性大腸桿菌、沙門氏菌屬細(xì)菌、梭狀芽孢桿菌屬細(xì)菌、彎曲桿菌屬細(xì)菌等。上述病原菌異常繁殖，則生產(chǎn)毒素(腸毒素、細(xì)胞毒素)，在腸道黏膜上引起障礙，引起稀便或嚴(yán)重的痢疾等。另外，球蟲(コクシジウム)是寄生于雞、豬、牛等的腸道內(nèi)的原生動(dòng)物(原蟲)，感染后引起痢疾、食欲不振等。預(yù)防/治療上述炎癥性腸道疾病是使用抗生素，但會(huì)出現(xiàn)抗藥性菌的問(wèn)題。
近年來(lái)，為了改善腸內(nèi)菌群平衡、抑制腸內(nèi)病原菌的增殖，使用益生菌的技術(shù)受到人們的關(guān)注(專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2)。但是，乳酸菌或雙歧桿菌大多在0.3％脫氧膽酸的濃度下死亡，或在pH4或以下死亡，除了總稱為大腸菌群的細(xì)菌之外，膽汁酸中，在對(duì)于微生物具有強(qiáng)的抗菌性的脫氧膽酸存在下無(wú)法生存的菌種還有很多。因此，人們需求在動(dòng)物的消化道內(nèi)不會(huì)死亡、給宿主帶來(lái)有利效果的菌種。
另一方面，有報(bào)道指出在動(dòng)物用飼料的加工階段，用酶或者產(chǎn)酶菌進(jìn)行處理、進(jìn)行一定程度的分解，由此可以減輕動(dòng)物的胃腸負(fù)擔(dān)，該技術(shù)可用于消化系統(tǒng)疾病的預(yù)防或改善(專利文獻(xiàn)3)。還已知有使用曲霉使魚粉在低水分下發(fā)酵，獲得高濃度含有蛋白酶、脂酶等的魚用魚粉發(fā)酵飼料的方法(專利文獻(xiàn)4)。但是，在上述技術(shù)中，在提高飼料中的水分含量進(jìn)行飼料成分分解后，需要進(jìn)行干燥、然后制成成品這樣繁雜的步驟。并且，為成分分解而提高水分含量的飼料有容易產(chǎn)生腐敗菌或霉菌等、難以保持品質(zhì)的問(wèn)題。
有人報(bào)道了通過(guò)將曲霉的孢子口服給予動(dòng)物，使動(dòng)物的糞便改質(zhì)的方法，但是對(duì)于抑制在動(dòng)物的腸內(nèi)引起炎癥等的有毒細(xì)菌的增殖、促進(jìn)體重增加的用途并未進(jìn)行研究，以在曲霉中生產(chǎn)酸性酶的形式給予動(dòng)物也屬未知(專利文獻(xiàn)5)。
還有人報(bào)道在甲殼類的甲殼粉碎物中加入發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)源并混合，向其中接種曲霉屬菌，使殼多糖或脫乙酰殼多糖分解，獲得發(fā)酵物，給予動(dòng)物(專利文獻(xiàn)6)。該方法對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)促進(jìn)效果已得到部分確認(rèn)，但對(duì)于其抑制動(dòng)物腸內(nèi)病原菌的增殖、預(yù)防并治療腸道感染癥并未進(jìn)行研究，上述效果并未得到確認(rèn)。
另一方面，有報(bào)道指出醬油曲霉、塔木里氏曲霉、米曲霉生產(chǎn)曲酸(非專利文獻(xiàn)1)。還報(bào)道，曲酸對(duì)于氣桿菌屬(Aerobacter)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、布魯氏菌屬(Brucella)、色桿菌屬(Chromobacterium)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、雙球菌屬(Diplococcus)、埃伯澤氏菌屬(Eberthella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、微球菌屬(Micrococcus)、奈色氏球菌屬(Neisseria)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、變形菌屬(Proteus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、八疊球菌屬(Sarcina)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、螺菌屬(Spirillum)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、弧菌屬(Vibrio)具有抗菌活性(非專利文獻(xiàn)2)。但是，給予了曲酸的小鼠中可見肝細(xì)胞腫瘤的發(fā)生，在大鼠中也顯示曲酸的肝發(fā)癌性的可能性。另外，對(duì)于是否有遺傳毒性也未明確，無(wú)法否定具有遺傳毒性的可能性。即，對(duì)于飼料中含有曲酸必須小心。
專利文獻(xiàn)1日本特表2005-507670號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)2日本特表2004-523241號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)3日本特開2004-141147號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)4日本特表平6-319464號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)5日本特開平11-171674號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)6日本特開2002-238466號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)1George A，Burdock，Madhusudan G.Soni，和Iona G.Carabin(2001)Regulatory Toxicology and Pharmacology 33，80-101
非專利文獻(xiàn)2Harry E.Morton，Walter Kocholaty，RenateJunowicz-Kocholaty，和Albert Kelner(1945)J.Bacteriol 50，579-584

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供輔助動(dòng)物的消化活動(dòng)、提高飼料效率的安全且簡(jiǎn)便的方法。具體來(lái)說(shuō)，其課題在于提供利用可在動(dòng)物的消化器官內(nèi)增殖的菌，抑制動(dòng)物腸內(nèi)的病原菌或球蟲的增殖，由此預(yù)防并治療感染癥，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的體重增加的方法。
本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉和米曲霉的酸性酶、尤其是酸性淀粉酶的生產(chǎn)能力優(yōu)異；這些菌具有對(duì)于引起腸道感染癥的病原菌的抗菌活性以及對(duì)球蟲的殺原生動(dòng)物活性；以及它們可發(fā)揮益生菌功能。還發(fā)現(xiàn)在以糙米作為營(yíng)養(yǎng)源進(jìn)行培養(yǎng)，這些菌的酸性酶生產(chǎn)能力極為優(yōu)異。將這些菌與由菌體生產(chǎn)的酸性酶組合，與飼料一起被動(dòng)物攝取，可以促進(jìn)消化，預(yù)防并改善腸道感染癥，有助于動(dòng)物的體重增加，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所述。
(1)動(dòng)物用飼料添加劑，該動(dòng)物用飼料添加劑含有選自醬油曲霉(Aspergillus sojae)、塔木里氏曲霉(Aspergillus tamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑色曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一種菌，以及由這些菌生產(chǎn)的、含酸性酶的培養(yǎng)物。
(2)(1)的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述菌是醬油曲霉和/或米曲霉。
(3)(1)或(2)的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述米曲霉IK-05074株(FERM BP-10622)或者具有與其相同的生產(chǎn)酸性酶的能力的該菌株的突變株。
(4)(1)-(3)中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述酸性酶是酸性淀粉酶。
(5)(1)-(4)中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑，其特征在于上述菌對(duì)于引起動(dòng)物腸道感染癥的病原菌具有抗菌活性和/或具有針對(duì)球蟲的殺原生動(dòng)物活性。
(6)(1)-(5)中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述培養(yǎng)物含有植物性營(yíng)養(yǎng)源。
(7)(6)的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述植物性營(yíng)養(yǎng)源是糙米。
(8)飼料，該飼料含有(1)-(7)中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑。
(9)飼料的制備方法，其特征在于在含有使菌增殖的營(yíng)養(yǎng)源的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)選自醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的至少一種菌，使飼料中含有所得培養(yǎng)物。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式 本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中含有的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉是在該技術(shù)領(lǐng)域中通過(guò)在曲霉種鑒定中常用的方法進(jìn)行分類時(shí)分別分類為上述種的菌。菌種的鑒定例如可參照“H.Murakami，The Journal of General and Applied Microbiology，17，281-309頁(yè)，(1971)”、“村上英也，日本釀造協(xié)會(huì)雜志，第74卷，第12號(hào)，849-853頁(yè)，(1979)”、Nikkuni，S.，et al，The Journal of General andApplied Microbiology，44，225-230頁(yè)，(1998)等。
醬油曲霉是在土壤、曲等中發(fā)現(xiàn)的絲狀半知菌類的一種，是用于醬油、醬的釀造的菌。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，只要是具有生產(chǎn)以下詳述的酸性酶中的至少一種、優(yōu)選酸性淀粉酶的能力，且在使動(dòng)物攝食方面為安全的即可，沒(méi)有特別限制，均可使用。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以使用市售的菌株，上述菌可優(yōu)選使用醬油曲霉AOK210株(株式會(huì)社秋田今野商店)。
塔木里氏曲霉是在土壤、曲、食品等中發(fā)現(xiàn)的絲狀半知菌類的一種，是用于醬油、醬的釀造的菌。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，只要是具有生產(chǎn)以下詳述的酸性酶中的至少一種、優(yōu)選酸性淀粉酶的能力，且在使動(dòng)物攝食方面為安全的即可，沒(méi)有特別限制，均可使用。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以使用市售的菌株，上述菌可優(yōu)選使用塔木里氏曲霉AOK43株(株式會(huì)社秋田今野商店)。
臭曲霉是在土壤、曲、谷物殼等中發(fā)現(xiàn)的絲狀半知菌類的一種，是用于酒、醬、醬油的釀造的菌。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，只要是具有生產(chǎn)以下詳述的酸性酶中的至少一種、優(yōu)選酸性淀粉酶的能力，且在使動(dòng)物攝食方面為安全的即可，沒(méi)有特別限制，均可使用。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以使用市售的菌株，上述菌可優(yōu)選使用臭曲霉AOK N4586株(株式會(huì)社秋田今野商店)。
黑色曲霉是在土壤、曲、谷物殼等中發(fā)現(xiàn)的絲狀半知菌類的一種，是在造酒、食品加工、制糖、或制藥等各種情況下使用的菌。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，只要是具有生產(chǎn)以下詳述的酸性酶中的至少一種、優(yōu)選酸性淀粉酶的能力，且在使動(dòng)物攝食方面為安全的即可，沒(méi)有特別限制，均可使用。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以使用市售的菌株，上述菌可優(yōu)選使用黑色曲霉AOK B650株(株式會(huì)社秋田今野商店)。
還可以使用AOK210株、AOK43株、AOK N4586株或AOK B650株的突變株。突變株可以是這些菌株自然變異，也可以是通過(guò)化學(xué)突變劑或紫外線等進(jìn)行突變處理得到菌株，從該菌株中選擇分別與AOK210株、AOK43株、AOK N4586株或AOK B650株同樣具有生產(chǎn)酸性酶能力的菌株。除生產(chǎn)酸性酶的能力之外，也優(yōu)選使用與上述菌株同樣地進(jìn)一步具有抗菌活性、殺原生動(dòng)物活性、膽汁酸耐性、耐酸性的至少一種的上述菌株的突變株。進(jìn)一步優(yōu)選使用上述以外的微生物學(xué)性質(zhì)也與上述AOK210株、AOK43株、AOK N4586株或AOK B650株同樣的突變株。
米曲霉是在土壤、曲等中發(fā)現(xiàn)的絲狀半知菌類的一種，是用于醬油、醬的釀造的菌。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，只要是具有生產(chǎn)以下詳述的酸性酶中的至少一種、優(yōu)選酸性淀粉酶的能力，且在使動(dòng)物攝食方面為安全的即可，沒(méi)有特別限制，均可使用。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以使用市售的菌株，上述菌可優(yōu)選使用米曲霉IK-05074株。IK-05074株是由各種發(fā)酵食品中分離的菌株，于2006年2月15日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6)，保藏號(hào)FERMP-20798，于2006年6月20日根據(jù)布達(dá)佩斯條約轉(zhuǎn)移為國(guó)際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-10622。
IK-05074株的微生物學(xué)性質(zhì)如下。
(1)菌落的性狀(察氏(Czapek-Dox)瓊脂培養(yǎng)基(在25℃下培養(yǎng)7天)) 大小為直徑50-60mm，顏色由黃變化為綠、隨著時(shí)間為褐色。菌絲體不明顯，背面無(wú)色。
(2)形態(tài) 分生孢子梗薄壁-厚壁，滑面-稍有粗面，直徑為20μm或以下，長(zhǎng)度為2mm或以下，頂囊為直徑40-50μm、80μm或以下的球形。
初生小埂在大的分生孢子梗上均存在，長(zhǎng)度12μm或以下。
次生小梗瓶狀，長(zhǎng)度8-12μm，具有短頸部。
分生孢子直徑5-6μm的球形，顏色由黃至綠，表面為滑面-微粗面。
以上推定IK-05074株屬于米曲霉。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，可以使用IK-05074株的突變株。IK-05074株的突變株可以從使IK-05074株自然變異、或進(jìn)行化學(xué)突變劑或紫外線等突變處理得到的菌株中篩選與IK-05074菌株具有相同生產(chǎn)酸性酶能力的菌株。除生產(chǎn)酸性酶的能力之外，優(yōu)選使用與IK-05074株同樣進(jìn)一步具有至少一種抗菌活性、殺原生動(dòng)物活性、膽汁酸耐性、耐酸性的IK-05074株的突變株。進(jìn)一步優(yōu)選使用除上述以外的微生物學(xué)性質(zhì)也與IK-05074株同樣的突變株。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，例如可以在從土壤、曲、食品、谷物殼等中分離的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉中分離具有酸性酶生產(chǎn)能力的菌株使用。
生產(chǎn)酸性酶的能力是指生產(chǎn)酸性酶，其程度為可在培養(yǎng)菌體得到的培養(yǎng)物中檢測(cè)出酸性酶活性的程度。培養(yǎng)物的酸性酶活性的檢測(cè)可按照常規(guī)方法進(jìn)行。例如可按照日本國(guó)稅廳所定分析法(改正第3回稅廳訓(xùn)令第1號(hào))的固體曲的分析方法——葡糖淀粉酶活性測(cè)定法、α-淀粉酶活性測(cè)定法、耐酸性α-淀粉酶活性測(cè)定法、酸性蛋白酶活性測(cè)定法和酸性羧基肽酶活性測(cè)定法測(cè)定。
本發(fā)明中使用的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉優(yōu)選對(duì)于引發(fā)動(dòng)物腸道感染癥的病原菌具有抗菌活性。
上述病原菌通常屬于腸桿菌科。屬于革蘭氏陰性細(xì)菌的病原菌有屬于病原性大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)和彎曲桿菌屬(Campylobacter)的細(xì)菌。屬于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的病原菌有屬于梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、利斯特氏菌屬(Listeria)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)。
病原性大腸桿菌例如有腸侵襲性大腸桿菌(Enteroinvasive E.coli)(EIEC)、產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli)(ETEC)、腸致病性大腸桿菌(Enteropathogenic E.coli)(EPEC)、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin producing E.coli)(STEC)和腸聚集性大腸桿菌(EnteroaggregativeE.coli)(EAEC)等。屬于沙門氏菌屬的細(xì)菌有雛白痢沙門氏菌(S.pullorum)、雞沙門氏菌(S.gallinarum)、傷寒沙門氏菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)、德彼沙門氏菌(S.derby)和都柏林沙門氏菌(S.dublin)。屬于彎曲桿菌屬的細(xì)菌有空腸彎曲桿菌(C.jejuni)、大腸彎曲桿菌(C.coli)、胎兒彎曲桿菌(C.fetus)、胎兒彎曲桿菌腸亞種(C.fetussubsp.Intestinalis)等。
屬于梭狀芽孢桿菌屬的細(xì)菌有產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C.perfringens)、肉毒梭狀芽孢桿菌(C.botulinum)、難辨梭狀芽孢桿菌(C.difficile)等。屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌有蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)等。屬于利斯特氏菌屬的細(xì)菌有單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)等。屬于葡萄球菌屬的細(xì)菌有金黃色葡萄球菌(S.aureus)等。屬于鏈球菌屬的細(xì)菌有豬鏈球菌(S.suis)、化膿鏈球菌(S.pyogenes)等。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中含有的上述曲霉屬菌特別對(duì)于沙門氏菌屬細(xì)菌中的腸炎沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌屬細(xì)菌中的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、水腫病菌等大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有高的抗菌活性。
對(duì)病原菌具有抗菌活性是指與病原菌一起接種于相同的培養(yǎng)基上時(shí)，具有抑制病原菌增殖的能力。具有抗菌活性的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉例如可如下獲得將土壤、曲等分離源添加到接種了腸炎沙門氏菌(SE)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(CP)、大腸桿菌(EC)、金黃色葡萄球菌(SA)等病原菌的瓊脂培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，然后分離形成抑菌圈的菌體。這樣得到的菌具有上述抑制上述病原菌增殖的能力，因此通過(guò)給予動(dòng)物可以預(yù)防并治療動(dòng)物的腸道感染癥。
使引起動(dòng)物腸道感染癥的病原菌的增殖得到抑制，這可通過(guò)例如測(cè)定動(dòng)物盲腸內(nèi)容物或糞便中病原菌的菌體濃度(活菌數(shù))等確認(rèn)。
本發(fā)明中使用的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉優(yōu)選具有針對(duì)引起動(dòng)物腸道感染癥的球蟲的殺原生動(dòng)物活性。
球蟲是指屬于孢子蟲類(孢子蟲(Sporozoasida)亞綱)的原生動(dòng)物。具體有艾美耳球蟲屬(Eimeria)、等孢球蟲屬(Isospora)、弓形蟲屬(Toxoplasma)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)等。屬于艾美耳球蟲屬的原生動(dòng)物有柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲((E.mitis)、邱氏艾美耳球蟲(E.zuernii)、牛艾美耳球蟲(E.bovis)等。屬于等孢球蟲屬的袁蟲有豬等孢球蟲(I.Suis)、貝氏等孢球蟲(I.Belli)、人等孢球蟲(I.Hominis)等。屬于弓形蟲屬的原生動(dòng)物有剛地弓形蟲(T.gondii)等。屬于隱孢子蟲屬的原生動(dòng)物有微小隱孢子蟲(C.parvum)等。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑特別對(duì)于柔嫩艾美耳球蟲、邱氏艾美耳球蟲的感染癥適用。
具有針對(duì)球蟲的殺原生動(dòng)物活性是指在使球蟲的卵囊與菌體的培養(yǎng)物共存時(shí)，具有抑制卵囊的出芽、繁殖，優(yōu)選減少卵囊的能力。具體來(lái)說(shuō)，是指具有使卵囊的細(xì)胞壁變形、溶解，使卵囊崩解的能力。崩解或細(xì)胞壁的狀態(tài)可使用顯微鏡觀察。
具有針對(duì)球蟲的殺原生動(dòng)物活性的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉例如可通過(guò)以下方法獲得。將土壤、曲等分離源加入到培養(yǎng)皿中，該培養(yǎng)皿中加入了使柔嫩艾美耳球蟲或邱氏艾美耳球蟲的卵囊懸浮的無(wú)菌水，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行1-7天的觀察。從可見卵囊的變形或溶解的培養(yǎng)皿中分離菌體，將其再次加入到培養(yǎng)皿中，該培養(yǎng)皿中加入了使柔嫩艾美耳球蟲或邱氏艾美耳球蟲的卵囊懸浮的無(wú)菌水，在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，確認(rèn)卵囊的變形或溶解。這樣，對(duì)在培養(yǎng)皿中含有的菌體進(jìn)行培養(yǎng)，分別選擇具有醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的微生物學(xué)性質(zhì)的菌體，由此可以獲得本發(fā)明中使用的曲霉屬菌。這樣得到的菌體給予動(dòng)物，由此可以預(yù)防、治療動(dòng)物的腸道球蟲感染癥。
給予上述曲霉屬菌是否可使球蟲的增殖受到抑制，這可以通過(guò)例如在顯微鏡下觀察動(dòng)物的盲腸內(nèi)容物或糞便中的球蟲卵囊來(lái)確認(rèn)。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中含有的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉優(yōu)選對(duì)于胃酸或膽汁酸具有耐性。由此，在動(dòng)物的腸道內(nèi)，菌體也可以生產(chǎn)有用的酸性酶，使酸性酶的消化輔助功能持續(xù)。另外，這些曲霉屬菌具有對(duì)上述病原菌的抗菌活性時(shí)，可以抑制引起動(dòng)物腸道感染癥的病原菌的增殖，有助于改善腸內(nèi)菌群的平衡。對(duì)于胃酸或膽汁酸具有耐性是指在通常的消化器官內(nèi)的條件下菌體不會(huì)死亡，可以達(dá)到腸道內(nèi)。通常，人或動(dòng)物的胃內(nèi)部在空腹時(shí)pH達(dá)到2或更低，在攝取食物的狀態(tài)下，胃內(nèi)部的pH在3.5-6的范圍，比空腹時(shí)高。因此，可在本發(fā)明的飼料添加劑中使用的具有耐酸性的菌株例如在pH3.5對(duì)分離源處理2小時(shí)左右時(shí)，可以通過(guò)篩選具有存活能力的菌株來(lái)獲得。并且，通過(guò)將這樣篩選的菌體在10g/L脫氧膽酸濃度的存在下處理24小時(shí)左右，篩選仍具有存活能力的菌株，可以獲得適合用于本發(fā)明的飼料添加劑的、對(duì)于胃酸或膽汁酸具有耐性的菌株。另外，菌體不死亡地到達(dá)腸道，這可例如可以通過(guò)測(cè)定動(dòng)物排泄物中的菌體濃度等來(lái)確認(rèn)。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以在上述菌種中單獨(dú)含有一種菌株，也可以將兩種或以上菌株組合含有。其中，優(yōu)選含有醬油曲霉或米曲霉的至少一種。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中含有的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的菌體濃度只要是在將飼料添加劑給予動(dòng)物時(shí)菌體在消化器官內(nèi)不會(huì)死亡的范圍即可，通常，只要是為了制備具有酸性酶活性的飼料添加劑，培養(yǎng)適當(dāng)濃度的菌體，適當(dāng)調(diào)節(jié)飼料添加劑中酸性酶活性即可。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中含有的酸性酶優(yōu)選為上述菌體所生產(chǎn)的消化酶，只要在胃腸內(nèi)酸性條件下不失活、具有活性即可，沒(méi)有特別限定，其中最佳pH為2.5-5.5。例如可以是酸性的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、高峰淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、核糖核酸酶、核酸酶、木聚糖酶、果膠酶、脂酶等，本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑含有其中的一種或多種。其中特別優(yōu)選含有分解家畜的飼料成分中主要成分之一的淀粉的酸性淀粉酶。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中含有的酸性淀粉酶只要是水解淀粉的酸性酶即可，沒(méi)有特別限定，例如有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶等。其中可優(yōu)選pH在最佳的3附近的耐酸性α-淀粉酶。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以含有醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉所生產(chǎn)的酸性酶的至少一種，可進(jìn)一步含有來(lái)自其它菌種或其它生物種的酶。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中的酸性酶的含量可根據(jù)動(dòng)物的種類、體重等適當(dāng)調(diào)節(jié)。通常，按照日本國(guó)稅廳所定分析法(改正第3回稅廳訓(xùn)令第1號(hào))的固體曲的分析方法測(cè)定酸性酶的活性時(shí)，1g動(dòng)物用飼料添加劑中的酸性酶活性總和優(yōu)選為12,000U或以上，進(jìn)一步優(yōu)選20,000U或以上。特別是1g動(dòng)物用飼料添加劑中的酸性淀粉酶活性優(yōu)選為100U或以上，進(jìn)一步優(yōu)選300U或以上。另外，酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的總和優(yōu)選為10,000U或以上，進(jìn)一步優(yōu)選15,000U或以上。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以通過(guò)培養(yǎng)上述醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉中的至少一種菌、生產(chǎn)酸性酶獲得。本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中使用的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉在通過(guò)在通常的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，由此生產(chǎn)酸性酶。例如培養(yǎng)溫度可在25℃-40℃下進(jìn)行，通常優(yōu)選在28℃-32℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)方法可以采用往復(fù)式振蕩培養(yǎng)、小型發(fā)酵罐培養(yǎng)等液體培養(yǎng)法或固體培養(yǎng)法，在上述菌體所具有的酸性酶生產(chǎn)基因中也存在只在固體培養(yǎng)基中表達(dá)的基因，因此本發(fā)明優(yōu)選使用固體培養(yǎng)法。
培養(yǎng)中所使用的培養(yǎng)基成分可以使用動(dòng)物或植物性的任意成分，優(yōu)選含有植物性的營(yíng)養(yǎng)源，例如優(yōu)選含有植物性的營(yíng)養(yǎng)源，例如優(yōu)選含有糙米、糠、米糠、大豆、大麥等。其中特別優(yōu)選以糙米作為營(yíng)養(yǎng)源。由此可以提高酸性淀粉酶等酸性酶的生產(chǎn)效率。
其它碳源可以添加葡萄糖、蔗糖、糖蜜等糖類，氮源可以添加氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨等銨鹽或硝酸鹽等。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中，可以將上述所得培養(yǎng)物直接作為動(dòng)物用飼料添加劑，還可以從所得培養(yǎng)物中分離含有菌體和酸性酶的一部分，使其包含于動(dòng)物用飼料添加劑中。例如，使用固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌體培養(yǎng)時(shí)，將菌體與培養(yǎng)基一起粉碎，將所得含在動(dòng)物用飼料添加劑中，這從簡(jiǎn)便性方面考慮優(yōu)選。進(jìn)一步優(yōu)選進(jìn)行使培養(yǎng)物干燥、或者進(jìn)一步添加用于提高保存性的任意成分等的加工，提高產(chǎn)品的品質(zhì)穩(wěn)定性。
干燥方法沒(méi)有特別限定，例如可通過(guò)通風(fēng)干燥、自然干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等進(jìn)行，其中優(yōu)選使用通風(fēng)干燥。還可以采用冷凍干燥，此時(shí)可以添加保護(hù)劑。保護(hù)劑的種類沒(méi)有特別限定，優(yōu)選選擇脫脂乳、谷氨酸鈉和糖類的一種或多種使用。使用糖類時(shí)，其種類沒(méi)有特別限定，優(yōu)選使用葡萄糖或海藻糖。
干燥后，向所得干燥物中加入脫氧劑、脫水劑，加入到阻氣性的鋁袋中密封，在比室溫低溫的溫度下儲(chǔ)存。由此可以使菌體長(zhǎng)時(shí)間以存活狀態(tài)保存。
優(yōu)選本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑的曲酸含有濃度低。通常，曲酸的含有濃度優(yōu)選為0.1mg/L或以下，進(jìn)一步優(yōu)選0.01mg/L或以下。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以與通常所使用的動(dòng)物用飼料的成分混合，制成用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的飼料。上述曲霉屬菌進(jìn)一步對(duì)引發(fā)動(dòng)物腸道感染癥的病原菌具有抗菌活性和/或具有針對(duì)球蟲的殺原生動(dòng)物活性時(shí)，可以制成用于預(yù)防、治療病原菌和/或球蟲導(dǎo)致的動(dòng)物腸道感染癥的飼料。
飼料的種類或成分只要不會(huì)使本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑中含有的菌體死亡、且酸性酶不失活即可，沒(méi)有特別限定，通?？梢蕴砑拥郊倚蟮娘暳匣?qū)櫸锸称贰?dòng)物用飼料補(bǔ)充劑等動(dòng)物飼料中使用。
本發(fā)明的飼料可通過(guò)將本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑添加到飼料成分中制備。本發(fā)明的飼料中含有的動(dòng)物用飼料添加劑的含量可根據(jù)所要給予的動(dòng)物的種類、體重、年齡、性別、使用目的、健康狀態(tài)、飼料成分等適當(dāng)調(diào)節(jié)，并沒(méi)有特別限定，通常，相對(duì)于飼料總量可以以干燥狀態(tài)制成10-5000ppm，優(yōu)選50-1000ppm。
本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑可以直接添加到飼料成分中混合，添加并混合粉末狀、固體形狀的動(dòng)物用飼料添加劑時(shí)，為了容易混合到飼料中，可以以液體狀或凝膠狀的形式使用。這種情況下，可以使用水、大豆油、菜籽油、玉米油等植物油，液體動(dòng)物油、聚乙烯基醇或聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸等水溶性高分子化合物作為液體載體。為了保持飼料中均體濃度的均勻性，優(yōu)選配合海藻酸、海藻酸鈉、占噸膠、酪氨酸鈉、阿拉伯樹膠、瓜耳膠、羅望子多糖類等水溶性多糖類。為了防止雜菌的繁殖，可以配合有機(jī)酸，使液體活菌劑為酸性。
攝取本發(fā)明的飼料的動(dòng)物種類沒(méi)有特別限定，例如有哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類、魚類等。其中，特別適合用于家禽、家畜。被動(dòng)物攝取的飼料的量可根據(jù)動(dòng)物的種類、體重、年齡、性別、使用目的、健康狀態(tài)、飼料的成分等適當(dāng)調(diào)節(jié)。
實(shí)施例 (1-1)耐酸性、膽汁酸耐性曲霉屬菌的篩選 將馬鈴薯右旋糖瓊脂培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為5，在121℃下滅菌15分鐘。在該瓊脂培養(yǎng)基的溫度降低至60℃時(shí)，以1L培養(yǎng)基10g的濃度添加脫氧膽酸鈉，接種保存于株式會(huì)社秋田今野商店(日本國(guó)秋田縣大仙市刈和野248)的曲霉菌，醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉在培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)。其中，醬油曲霉AOK210株、塔木里氏曲霉AOK43株、臭曲霉AOK N4586株、黑色曲霉AOK B650株生長(zhǎng)發(fā)育特別良好。
(1-2)耐酸性、耐膽汁酸性曲霉菌的篩選 與上述同樣，在含有脫氧膽酸鈉的培養(yǎng)基中接種以各種發(fā)酵食品作為分離源的多種曲霉菌，從在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)發(fā)育的菌株中篩選生長(zhǎng)發(fā)育最為良好的菌株。該菌株為米曲霉IK-05074株，保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心。
IK-05074株的微生物學(xué)性質(zhì)如上所述。
(2-1)菌種的比較試驗(yàn) (a)菌體的培養(yǎng)和酸性酶活性的測(cè)定 以糙米為固體培養(yǎng)基，進(jìn)行(1-1)中篩選的AOK 210株、AOK 43株、AOK N4586株和AOK B650株的培養(yǎng)。即，將100g糙米在水中浸泡一晝夜，使其溶脹，然后加入到在蓋子上具有無(wú)菌濾器的直徑14cm、深10cm的聚碳酸酯制容器中，厚度為2cm，在高壓釜中、在121℃下滅菌15分鐘。向該容器中接種上述各菌體，在28℃下培養(yǎng)5天，制備種菌。
接著，將與上述同樣溶脹的糙米層合在30×40×10cm的不銹鋼盤中，厚度為1.5cm，蓋上具有用20×25cm的濾器覆蓋的通氣孔的蓋子，放入大型高壓釜中，在121℃下滅菌25分鐘。將該盤冷卻后，將預(yù)先培養(yǎng)的上述種菌全量接種。將該盤放入28℃的孵卵器中培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)后在35℃下通風(fēng)干燥，用噴射磨粉碎，得到各菌種的固體培養(yǎng)物。對(duì)于川地曲霉(Aspergillus kawachii)AOK 1006s株(株式會(huì)社秋田今野商店)也與上述同樣地得到固體培養(yǎng)物。
測(cè)定各1g固體培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性、和酸性蛋白酶活性、以及酸性羧基肽酶活性的總和。結(jié)果如表1所示。上述酸性酶的測(cè)定按照國(guó)稅廳所定分析法(改正第3回稅廳訓(xùn)令第1號(hào))的固體曲的分析方法中的耐酸性α-淀粉酶活性測(cè)定法、酸性蛋白酶活性測(cè)定法和酸性羧基肽酶活性測(cè)定法進(jìn)行。
(b)給予試驗(yàn) 進(jìn)行將上述得到的菌株給予雛雞的試驗(yàn)。將上述得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的固體培養(yǎng)物以相對(duì)于飼料(SD肉雞早后期用、日本配合飼料株式會(huì)社制備)的總質(zhì)量為100ppm、150ppm的濃度混合到飼料中，作為實(shí)施例1-8。AOK1006s株的固體培養(yǎng)物同樣地混合到飼料中，作為比較例1和2。還進(jìn)行高壓釜滅菌，不添加菌，而以150ppm的濃度將糙米混合到飼料中，作為對(duì)照組。給予試驗(yàn)是以10只為一組，使孵化后第一周的雛雞自由攝取上述飼料28天，進(jìn)行肥育。孵化后第35天的各組雛雞的平均體重如表1所示。
[表1] AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的固體培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性是培養(yǎng)AOK1006s得到的培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性的4倍或以上。酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的總和也約為2.5倍-6倍。由此可知，上述四種菌體的酸性淀粉酶、酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶的生產(chǎn)能力優(yōu)異。其中特別是AOK210株的酸性淀粉酶、酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶的全部的生產(chǎn)能力均優(yōu)異。
給予含有本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑的飼料的實(shí)施例1-8組的雛雞體重比比較例1和2組的雛雞體重增加。由此可知，含有本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑的飼料的促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的效果優(yōu)異。特別是使用AOK210株制備的含有動(dòng)物用飼料添加劑的飼料，其促進(jìn)動(dòng)物體重增加的效果優(yōu)異。
(2-2)菌種的比較試驗(yàn) (a)菌體的培養(yǎng)和酸性酶活性的測(cè)定 以糙米為固體培養(yǎng)基，進(jìn)行(1-2)中篩選的IK-05074株的培養(yǎng)。培養(yǎng)是培養(yǎng)10天、制備種菌，以及將該種菌全量接種、培養(yǎng)10天，除此之外均與上述同樣進(jìn)行。川地曲霉AOK1006s株的培養(yǎng)也同樣進(jìn)行。培養(yǎng)后，與上述同樣地得到它們的固體培養(yǎng)物。
接著，將馬鈴薯右旋糖液體培養(yǎng)基在121℃下滅菌15分鐘，然后降低至60℃，將脫氧膽酸鈉以每1L培養(yǎng)基中5g的濃度添加，在該培養(yǎng)基中接種IK-05074株，在28℃下培養(yǎng)6天。將該培養(yǎng)物用0.4μm的濾器過(guò)濾，收集菌體。向收集的菌體中通入培養(yǎng)前的培養(yǎng)基，洗滌三次，出去菌體以外的酶，接著向菌體中添加培養(yǎng)基成分，在36℃下通風(fēng)干燥24小時(shí)，得到不含有酸性酶的IK-05074株的固體培養(yǎng)物。
按照與(2-1)(a)同樣的方法測(cè)定每1g各固體培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性、以及酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的總和。結(jié)果如表2所示。
(b)給予試驗(yàn) IK-05074株對(duì)雛雞的給予試驗(yàn)如(2-1)(b)同樣的方法進(jìn)行。將上述得到的IK-05074株的固體培養(yǎng)物以100ppm、150ppm的濃度混合到飼料中，將其分別作為實(shí)施例9和10。將川地曲霉的固體培養(yǎng)物同樣地混合到飼料中，將其作為比較例3和4，將除去了酸性酶的IK-05074株的固體培養(yǎng)物以150ppm的濃度混合到飼料中，以此作為比較例5。還將進(jìn)行高壓釜滅菌、不添加菌的干燥的糙米以150ppm的濃度混合到飼料中，以此作為對(duì)照組。給予試驗(yàn)是以10只為一組，使孵化后第一周的雛雞自由攝取上述飼料48天，進(jìn)行肥育。孵化后第55天各組雛雞的平均體重如表2所示。
[表2] 培養(yǎng)IK-05074株所得到的培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性是培養(yǎng)川地曲霉所得到的培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性的約57倍。酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的總和也約為6倍。由此可知，IK-05074株的酸性淀粉酶、酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶的生產(chǎn)能力優(yōu)異，特別是酸性淀粉酶的生產(chǎn)能力優(yōu)異。
給予含有本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑的飼料的實(shí)施例9和10的雛雞體重與比較例3-5組的雛雞體重相比增加。由此可知，含有動(dòng)物用飼料添加劑的飼料具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的效果，其中，該動(dòng)物用飼料添加劑含有本發(fā)明的米曲霉和其生產(chǎn)的酸性酶。
(3)固體培養(yǎng)基的比較試驗(yàn) (a)菌體的培養(yǎng)和耐酸性α-淀粉酶活性的測(cè)定 以糙米、大麥和破碎大豆作為固體培養(yǎng)基，進(jìn)行AOK210株的培養(yǎng)。即，分別將100g糙米、大麥和破碎大豆在水中浸泡過(guò)夜，使其溶脹，然后分別鋪在30×40×5cm的不銹鋼盤中，厚度為2.0cm，將表面用濾紙覆蓋，然后進(jìn)一步蓋上不銹鋼的蓋子，放入大型高壓釜中，在121℃下滅菌30分鐘。將該盤冷卻后，將(2-1)(a)中培養(yǎng)的種菌總量分開接種于各培養(yǎng)基中。將該盤放入28℃的孵卵器中培養(yǎng)5天。
培養(yǎng)后，在35℃下通風(fēng)干燥，通過(guò)噴射磨粉碎，得到固體培養(yǎng)物。測(cè)定各固體培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性。結(jié)果如表3所示。耐酸性α-淀粉酶活性的測(cè)定與上述同樣。
(b)給予試驗(yàn) 進(jìn)行將上述得到的干燥固體培養(yǎng)物給予雛雞的試驗(yàn)。將上述固體培養(yǎng)物以相對(duì)于飼料(SD肉雞早后期用、日本配合飼料株式會(huì)社制備)總質(zhì)量為50ppm、100ppm的濃度混合到飼料中，以此作為實(shí)施例11-16。將高壓釜滅菌、不添加菌的干燥的糙米以100ppm的濃度混合到飼料中，作為對(duì)照組。給予試驗(yàn)以10只為一組，使孵化后第一周的雛雞自由攝取上述飼料35天，進(jìn)行肥育。孵化后第42天各組雛雞的平均體重如表3所示。
[表3] 以糙米為固體培養(yǎng)基成分得到的培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性與以大豆、大麥為固體培養(yǎng)基成分得到的培養(yǎng)物的耐酸性α-淀粉酶活性相比約為1.5倍，明顯高。由此可知，使用糙米作為固體培養(yǎng)基成分時(shí)，特別是酸性淀粉酶的生產(chǎn)能力增大。
給予含有本發(fā)明的動(dòng)物用飼料添加劑的飼料的實(shí)施例11-16的雛雞體重與對(duì)照組的雛雞體重相比增加。特別是含有以糙米作為固體培養(yǎng)基成分制備的動(dòng)物用飼料添加劑的本發(fā)明的飼料其促進(jìn)體重增加的效果優(yōu)異。
(4-1)曲霉菌的培養(yǎng)物的抗菌活性測(cè)定 通過(guò)將AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株與病原菌共同培養(yǎng)，試驗(yàn)這些菌對(duì)病原菌的抗菌活性。
對(duì)于腸炎沙門氏菌(SE)，使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基、在37℃下進(jìn)行24小時(shí)好氧培養(yǎng)。刮取在平板上生長(zhǎng)的菌落，使其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中。制備500ml腦心浸液“日水”，高壓釜滅菌后無(wú)菌加入到1L容量的三角燒瓶中，SE的終濃度為約1.0×104-1.0×105CFU/ml。向三角燒瓶中分別無(wú)菌加入各5g(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOKN4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物，以此作為實(shí)施例17-20。將無(wú)菌加入5g AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例6，以未加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。將各三角燒瓶在37℃的恒溫箱中、在好氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。
對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(CP)，使用Anaero Pack Kenki(三菱氣體化學(xué)(株)制備)，在加入了蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制備)中、在37℃下進(jìn)行24小時(shí)的厭氧培養(yǎng)。刮取在平板上生長(zhǎng)的菌落，使其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中。制備500ml腦心浸液“日水”，高壓釜滅菌后無(wú)菌加入到1L容量的三角燒瓶中，CP的終濃度為約1.0×104-1.0×105CFU/ml。向三角燒瓶中分別無(wú)菌加入各5g(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物，以此作為實(shí)施例21-24。將無(wú)菌加入5g AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例7，以未加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。將各三角燒瓶在37℃的恒溫箱中、使用Anaero Pack Kenki、在厭氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。
試驗(yàn)開始后，在第0天、3天、7天實(shí)施SE和CP的活菌數(shù)測(cè)定。SE的活菌數(shù)測(cè)定方法是將收集的培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋10倍后，將各0.1ml稀釋梯度液涂布在X-SAL瓊脂培養(yǎng)基“日水”上，在37℃下進(jìn)行24小時(shí)好氧培養(yǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的特征性菌落。CP的活菌數(shù)測(cè)定是將采集的培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋為10倍，然后將各0.1ml梯度稀釋液涂布在加入了蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制備)上，使用Anaero Pack Kenki、在37℃下進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的特征性菌落。
為了同時(shí)對(duì)曲酸濃度進(jìn)行定量，將培養(yǎng)液以8,000rpm離心10分鐘，將該上清用混合有纖維素的酯型膜濾器(孔徑0.45μm、ADVANTEC MFS，INC.制備)過(guò)濾。HPLC裝置是使用Waters600(多溶劑傳輸系統(tǒng)(Multisolvent Delivery system))和Waters490E(Programmable multiwavelength Detector)。柱是使用YMC-PackODS-AM 6.0mm×150mm(YMC(ワイエムシイ)制造)。流動(dòng)相使用0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH3.0)-甲醇(97∶3)，流速為1.0ml/分鐘，柱溫為40℃，測(cè)定波長(zhǎng)為270nm，進(jìn)行曲酸的檢測(cè)。校正曲線是使用曲酸(試劑特級(jí)，和光純藥工業(yè)(株)產(chǎn)品)制備。
表4表示SE的活菌數(shù)，表5表示SE共培養(yǎng)試驗(yàn)的培養(yǎng)物的曲酸濃度，表6表示CP的活菌數(shù)，表7表示CP的共培養(yǎng)試驗(yàn)的培養(yǎng)物的曲酸濃度。
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
如實(shí)施例17-20所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固體培養(yǎng)物與比較例6所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的對(duì)SE的抗菌活性。特別是與AOK210株共培養(yǎng)時(shí)，SE的活菌數(shù)從試驗(yàn)第3天以后為檢測(cè)下限或以下，可見最高的抗菌活性。對(duì)于AOK43株，試驗(yàn)第7天，SE的活菌數(shù)為檢測(cè)下限或以下。在對(duì)照組中，至試驗(yàn)第7天仍可見活菌數(shù)的升高，第7天顯示2.8×108CFU/ml。
在任何一種懸浮液中，曲酸含量均為檢測(cè)下限或以下。
如實(shí)施例21-24所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固體培養(yǎng)物與比較例7所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的對(duì)CP的抗菌活性。特別是與AOK210株共同培養(yǎng)時(shí)，CP的活菌數(shù)自試驗(yàn)第3天以后為檢測(cè)下限或以下，可見最高的抗菌活性。對(duì)于對(duì)照組，可見至試驗(yàn)第7天菌數(shù)仍升高，在第7天顯示1.0×106CFU/ml。
在任何一種懸浮液中，曲酸含量均為檢測(cè)下限或以下。
對(duì)于大腸桿菌(EC)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制備)、在37℃下好氧培養(yǎng)24小時(shí)。刮取在平板上生長(zhǎng)的菌落，使其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中。制備500ml腦心浸液“ニツスイ”(日水制藥(株)制備)，高壓釜滅菌后無(wú)菌加入到1L容量的三角燒瓶中，EC的終濃度為約1.0×105-1.0×106 CFU/ml。向三角燒瓶中無(wú)菌加入各5g(2-1)(a)中得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物，以此作為實(shí)施例25-28。將無(wú)菌加入5g AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例8，將不加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。各三角燒瓶在37℃的恒溫箱中、在好氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。
對(duì)于金黃色葡萄球菌(SA)，在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基、在37℃下好氧培養(yǎng)24小時(shí)。刮取在平板上生長(zhǎng)的菌落，使其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中。制備500ml腦心浸液“ニツスイ”(日水制藥(株)制備)，高壓釜滅菌后無(wú)菌加入到1L容量的三角燒瓶中，SA的終濃度為約1.0×105-1.0×106CFU/ml。向三角燒瓶中無(wú)菌加入各5g(2-1)(a)中得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物，以此作為實(shí)施例29-32。將無(wú)菌加入5g AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例9，將不加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。各三角燒瓶在37℃的恒溫箱中、在好氧條件下緩慢攪拌培養(yǎng)。
試驗(yàn)開始后，在第0天、3天、7天實(shí)施EC和SA的活菌數(shù)測(cè)定。SE的活菌數(shù)測(cè)定方法是將收集的培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋10倍后，將各0.1ml稀釋梯度液涂布在腸桿菌培養(yǎng)基(chromocult coliformagar)“Merck”(Merck制備)上，在37℃下進(jìn)行24小時(shí)好氧培養(yǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的特征性菌落。SA的活菌數(shù)測(cè)定是將采集的培養(yǎng)液用無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋為10倍，然后將各0.1ml梯度稀釋液涂布在加入了蛋黃的甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基“榮研”(榮研器材(株)制備)上，在37℃下進(jìn)行48小時(shí)好氧培養(yǎng)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的特征性菌落。
表8表示SE的活菌數(shù)，表9表示SA的活菌數(shù)。
[表8]
[表9]
如實(shí)施例25-28所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固體培養(yǎng)物與比較例8所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的對(duì)EC的抗菌活性。特別是與AOK210株共培養(yǎng)時(shí)，EC的活菌數(shù)從試驗(yàn)第3天以后為檢測(cè)下限或以下，可見最高的抗菌活性。對(duì)于AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株，試驗(yàn)第7天，EC的活菌數(shù)為檢測(cè)下限或以下。在對(duì)照組中，至試驗(yàn)第7天仍可見活菌數(shù)的升高，第7天顯示1.0×107CFU/ml。
如實(shí)施例29-32所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固體培養(yǎng)物與比較例9所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的對(duì)SA的抗菌活性。特別是與AOK210株共培養(yǎng)時(shí)，SA的活菌數(shù)從試驗(yàn)第3天以后為檢測(cè)下限或以下，可見最高的抗菌活性。對(duì)于AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株，試驗(yàn)第7天，SA的活菌數(shù)為檢測(cè)下限或以下。在對(duì)照組中，至試驗(yàn)第7天仍可見活菌數(shù)的升高，第7天顯示7.2×107CFU/ml。
(4-2)米曲霉培養(yǎng)物的抗菌活性的測(cè)定 通過(guò)將IK-05074株與病原菌共培養(yǎng)，按照與(4-1)同樣的方法測(cè)試IK-05074株對(duì)于病原菌的抗菌活性。
將加入了腸炎沙門氏菌(SE)和(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為實(shí)施例33，將加入了SE和AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例10，將未加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。
將加入了產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(CP)和(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為實(shí)施例34，將加入了CP和AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例11，將未加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。
試驗(yàn)開始后，在第0天、3天、7天實(shí)施SE和CP的活菌數(shù)測(cè)定。同時(shí)對(duì)曲酸濃度進(jìn)行定量。
表10表示SE的活菌數(shù)，表11表示SE的共培養(yǎng)試驗(yàn)中培養(yǎng)物的曲酸濃度，表12表示CP的活菌數(shù)，表13表示CP共培養(yǎng)試驗(yàn)的培養(yǎng)物的曲酸濃度。
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
如實(shí)施例33所示，與IK-05074株共培養(yǎng)時(shí)，在試驗(yàn)第3天以后SE的活菌數(shù)為檢測(cè)下限或以下，與比較例10所示的AOK1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的對(duì)SE的抗菌活性。在對(duì)照組中，試驗(yàn)后可見菌數(shù)的升高，在第3天顯示為3.3×108CFU/ml。
在任何懸浮液中，曲酸含量均在檢測(cè)下限或以下。
如實(shí)施例34所示，與IK-05074株共培養(yǎng)時(shí)，在試驗(yàn)第3天以后CP的活菌數(shù)在檢測(cè)下限或以下，與比較例11所示的AOK1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的抗CP的抗菌活性。對(duì)于對(duì)照組，在至試驗(yàn)第7天菌數(shù)升高，在第7天顯示1.3×106CFU。
在任何懸浮液中曲酸含量均為檢測(cè)下限或以下。
將加入了大腸桿菌(EC)和(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為實(shí)施例35，將加入了EC和AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例12，將未加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。
將加入了金黃色葡萄球菌(SA)和(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為實(shí)施例36，將加入了EC和AOK1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的三角燒瓶作為比較例13，將未加入曲霉培養(yǎng)物的三角燒瓶作為對(duì)照組。
試驗(yàn)開始后，在第0天、3天、7天實(shí)施EC和SA的活菌數(shù)測(cè)定。
表14表示EC的活菌數(shù)，表15表示SA的活菌數(shù). [表14]
[表15]
如實(shí)施例35所示，與IK-05074株共培養(yǎng)時(shí)，在試驗(yàn)第3天以后EC的活菌數(shù)為檢測(cè)下限或以下，與比較例12所示的AOK1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的對(duì)EC的抗菌活性。在對(duì)照組中，試驗(yàn)后可見菌數(shù)的升高，在第3天顯示為4.0×108CFU/ml。
如實(shí)施例36所示，與IK-05074株共培養(yǎng)時(shí)，在試驗(yàn)第3天以后EC的活菌數(shù)為檢測(cè)下限或以下，與比較例13所示的AOK1006s株的固體培養(yǎng)物相比，顯示明顯高的對(duì)SA的抗菌活性。在對(duì)照組中，試驗(yàn)后可見菌數(shù)的升高，在第3天顯示為3.7×108CFU/ml。
(5-1)腸炎沙門氏菌對(duì)雛雞的攻擊試驗(yàn) 相對(duì)于雛雞的飼料(SD肉雞早期用，日本配合飼料(株)制備，未添加抗菌性物質(zhì)的飼料)的總質(zhì)量，將(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料分別作為實(shí)施例37-40。將12只來(lái)自肉種雞(商品名Chunky)的種蛋孵化的雛雞作為一組，給予實(shí)施例37-40的飼料14天。另一方面，將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料作為比較例14。將混合100ppm乳糖代替曲霉培養(yǎng)物所得的飼料作為對(duì)照組，同樣地進(jìn)行試驗(yàn)。在7日齡，每只雛雞口服給予1.8×105CFU腸炎沙門氏菌(SE)。SE使用由在群馬縣養(yǎng)雞業(yè)者農(nóng)場(chǎng)死亡的雞的盲腸內(nèi)容物中分離的菌株。在14日齡，用棉棒擦試盲腸內(nèi)容物和總排泄腔，采集糞便。
盲腸內(nèi)容物的SE活菌數(shù)按以下方法測(cè)定，計(jì)算感染指數(shù)和防御指數(shù)。
將1g盲腸內(nèi)容物加入滅菌磷酸緩沖生理鹽水，稀釋為10倍，充分混合，制備試樣原液。接著將試樣原液用無(wú)菌生理鹽水以10倍分梯度稀釋，制成梯度稀釋液。將試樣原液和梯度稀釋液分別各以0.1ml涂抹在SS瓊脂平板培養(yǎng)基“日水”(日水制藥(株)制備)和亮綠瓊脂平板培養(yǎng)基(Difco Laboratories制備)上，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定在各平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的典型的SE菌落數(shù)。并且由菌落鉤取菌體，接種于賴氨酸脫羥酶試驗(yàn)用的SIM瓊脂培養(yǎng)基“日水”(日水制藥(株)制備)和TSI瓊脂培養(yǎng)基“日水”(日水制藥(株)制備)上，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行性狀的確認(rèn)。
其中可以確認(rèn)為SE的菌落數(shù)乘以稀釋液的稀釋倍率，計(jì)算1g盲腸內(nèi)容物中的SE活菌數(shù)。根據(jù)該結(jié)果如下計(jì)算感染指數(shù)和防御指數(shù)。感染指數(shù)是表示病原菌的感染率的程度的值，防御指數(shù)是與給予不含有曲霉的飼料進(jìn)行比較時(shí)，各飼料的防御病原菌感染的能力的值。
感染指數(shù)各個(gè)體盲腸內(nèi)容物中的SE活菌數(shù)的對(duì)數(shù)平均值(logCFU/g的平均值) 防御指數(shù)對(duì)照區(qū)的感染指數(shù)/各試驗(yàn)組的感染指數(shù) 由總排泄腔采集的糞便是按以下方法、按個(gè)體進(jìn)行定性培養(yǎng)，由此確認(rèn)SE的性狀。即，將附著于棉棒上的糞便懸浮于10ml無(wú)菌磷酸緩沖生理鹽水中，制成試樣原液，然后各以0.1ml涂抹在SS瓊脂平板培養(yǎng)基和亮綠瓊脂平板培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，判定是否形成在各平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的典型的SE的菌落。并且由菌落鉤取菌體，接種于LIM瓊脂培養(yǎng)基“日水”(日水制藥(株)制備)、SIM瓊脂培養(yǎng)基和TSI瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，進(jìn)行性狀的確認(rèn)。
結(jié)果如表16所示。
[表16]
給予了含有實(shí)施例37-40的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的飼料的雛雞，其盲腸內(nèi)容物的SE菌體濃度極低，SE的感染指數(shù)極低。特別是在實(shí)施例37中可得到高的防御指數(shù)。給予了含有比較例14的AOK 1006s株的飼料的雛雞與對(duì)照組相比，SE的活菌數(shù)沒(méi)有變化。由此顯示醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生產(chǎn)的含有酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防SE感染癥的效果。
(5-2)腸炎沙門氏菌對(duì)于雛雞的攻擊試驗(yàn) 將(2-2)(a)所得的IK05074株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得雛雞的飼料作為實(shí)施例41，將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合為100ppm，將所得飼料作為比較例15，將混合100ppm乳糖代替曲霉培養(yǎng)物所得的飼料作為對(duì)照組，使用這些飼料培養(yǎng)培育雛雞，進(jìn)行SE攻擊試驗(yàn)。試驗(yàn)方法是口服給予2.0×105 CFU的SE，除此之外與上述同樣。
結(jié)果如表17所示。
[表17]
給予了含有實(shí)施例41的IK-05074株的飼料的雛雞，其盲腸內(nèi)容物的SE菌體濃度極低，SE感染指數(shù)極低。給予了含有比較例15的AOK1006s株的飼料的雛雞與對(duì)照組相比，SE活菌數(shù)幾乎沒(méi)有變化。由此顯示，含有本發(fā)明的米曲霉所生成的酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防SE感染癥的效果。
(6-1)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌對(duì)于雛雞的攻擊試驗(yàn) 相對(duì)于雛雞的飼料(SD肉雞早期用，日本配合飼料(株)制備，未添加抗菌性物質(zhì)的飼料)的總質(zhì)量，將(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料分別作為實(shí)施例42-45。將12只來(lái)自肉種雞(商品名Chunky)的種蛋孵化的雛雞作為一組，給予實(shí)施例42-45的飼料14天。另一方面，將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料作為比較例16。將混合100ppm乳糖代替曲霉培養(yǎng)物所得的飼料作為對(duì)照組，同樣地進(jìn)行試驗(yàn)。在7日齡，每只雛雞口服給予1.1×109CFU產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(CP)。CP使用由在群馬縣養(yǎng)雞業(yè)者農(nóng)場(chǎng)死亡的雞的盲腸內(nèi)容物中分離的菌株。在14日齡，用棉棒擦試盲腸內(nèi)容物和總排泄腔，采集糞便。
盲腸內(nèi)容物的CP活菌數(shù)按以下方法測(cè)定，計(jì)算感染指數(shù)和防御指數(shù)。
將1g盲腸內(nèi)容物加入滅菌磷酸緩沖生理鹽水，稀釋為10倍，充分混合，制備試樣原液。接著將試樣原液用無(wú)菌生理鹽水以10倍分梯度稀釋，制成梯度稀釋液。將試樣原液和梯度稀釋液分別各以0.1ml涂抹在梭狀芽孢桿菌測(cè)定用培養(yǎng)基(日水制藥(株)制備)上，使用AnaeroPack Kenki，在35℃下厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，判定是否形成在各平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的黑色菌落。并且由菌落鉤取菌體，接種于加入了蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制備)上，在35℃下進(jìn)行24-48小時(shí)的好氧和厭氧培養(yǎng)，進(jìn)行性狀的確認(rèn)。
其中確認(rèn)的CP的菌落數(shù)乘以稀釋液的稀釋倍率，計(jì)算1g盲腸內(nèi)容物中的CP活菌數(shù)。根據(jù)該結(jié)果如上計(jì)算感染指數(shù)和防御指數(shù)。
由總排泄腔采集的糞便是按以下方法、按個(gè)體進(jìn)行定性培養(yǎng)，由此確認(rèn)CP的性狀。即，將附著于棉棒上的糞便懸浮于10ml無(wú)菌磷酸緩沖生理鹽水中，制成試樣原液，將試樣原液以0.1ml涂抹在梭狀芽孢桿菌測(cè)定用培養(yǎng)基(日水制藥(株)制備)上，使用Anaero Pack Kenki，在35℃下厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，判定是否形成在各平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的黑色菌落。并且由菌落鉤取菌體，接種于加入了蛋黃的CW瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥(株)制備)上，在35℃下進(jìn)行24-48小時(shí)的好氧和厭氧培養(yǎng)，進(jìn)行性狀的確認(rèn)。
結(jié)果如表18所示。
[表18]
給予了含有實(shí)施例42-45的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的飼料的雛雞，其盲腸內(nèi)容物的CP菌體濃度極低，SE的感染指數(shù)極低。特別是在實(shí)施例42中可得到高的防御指數(shù)。給予了含有比較例16的AOK 1006s株的飼料的雛雞與對(duì)照組相比，CP的活菌數(shù)沒(méi)有變化。由此顯示醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生產(chǎn)的含有酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防CP感染癥的效果。
(6-2)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌對(duì)于雛雞的攻擊試驗(yàn) 將(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得的雛雞的飼料作為實(shí)施例46。將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得的飼料作為比較例17。將混合100ppm乳糖代替曲霉培養(yǎng)物所得的飼料作為對(duì)照組，使用這些飼料飼養(yǎng)雛雞，進(jìn)行CP攻擊試驗(yàn)。除了口服給予1.5×109CFU的CP之外，試驗(yàn)方法均與上述同樣。
結(jié)果如表19所示。
[表19]
給予了含有實(shí)施例46的IK-05074株的飼料的雛雞，其盲腸內(nèi)容物的CP菌體濃度極低，CP的感染指數(shù)極低。給予了含有比較例17的AOK1006s株的飼料的雛雞與對(duì)照組相比，CP的活菌數(shù)幾乎沒(méi)有變化。由此顯示本發(fā)明的米曲霉所生產(chǎn)的含有酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防CP感染癥的效果。
(7-1)大腸桿菌對(duì)于犢牛的攻擊試驗(yàn) 將出生后1周齡的雄犢牛(荷斯坦)以8頭為一組進(jìn)行飼養(yǎng)。相對(duì)于犢牛用混合飼料(ミラクルメイト(株)科學(xué)飼料研究所制備)的總質(zhì)量，將(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料分別作為實(shí)施例47-50。喂這些犢牛用混合飼料飼養(yǎng)至4周齡。另一方面，將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料作為比較例18?；旌?00ppm的乳糖代替曲霉培養(yǎng)物，將所得的飼料作為對(duì)照組，進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。在2周齡，以每頭1.2×106CFU對(duì)所有犢?？诜o予大腸桿菌(EC)。喂飼至4周齡，計(jì)算各組犢牛的死亡率。
另外采集小腸內(nèi)容物，按以下方法測(cè)定小腸內(nèi)容物的EC活菌數(shù)。
將1g小腸內(nèi)容物加入滅菌磷酸緩沖生理鹽水，稀釋為10倍，充分混合，制備試樣原液。接著將試樣原液用無(wú)菌生理鹽水以10倍梯度稀釋，制成梯度稀釋液。將試樣原液和梯度稀釋液分別各以0.1ml涂抹在腸桿菌培養(yǎng)基(chromocult coliform agar)“Merk”上，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定在各平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的典型的EC菌落數(shù)。確認(rèn)為EC的菌落數(shù)乘以稀釋液的稀釋倍率，計(jì)算1g小腸內(nèi)容物中的EC活菌數(shù)。根據(jù)該結(jié)果如上計(jì)算感染指數(shù)和防御指數(shù)。
結(jié)果如表20所示。
[表20]
給予含有實(shí)施例47-50的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的飼料的犢牛，其死亡率為0％。小腸內(nèi)容物的EC感染指數(shù)低。特別在實(shí)施例47中得到了高的防御指數(shù)。給予了含有比較例18的AOK 1006s株的飼料的犢牛的死亡率為13％。與對(duì)照組比較，EC的活菌數(shù)沒(méi)有變化。由此顯示醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生產(chǎn)的含有酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防EC感染癥的效果。
(7-2)大腸桿菌對(duì)犢牛的攻擊試驗(yàn) 將IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得的犢牛用混合飼料作為實(shí)施例51。將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得的飼料作為比較例19。將混合100ppm乳糖代替曲霉培養(yǎng)物所得的飼料作為對(duì)照組，使用這些飼料飼養(yǎng)犢牛，進(jìn)行EC攻擊試驗(yàn)。除了口服給予1.5×106CFU的EC之外，試驗(yàn)方法與上述EC攻擊試驗(yàn)同樣。
結(jié)果如表21所示。
[表21]
給予含有實(shí)施例51的IK-05074株的飼料的犢牛，其死亡率為0％。小腸內(nèi)容物的EC感染指數(shù)低。給予了含有比較例19的AOK 1006s株的飼料的犢牛的死亡率為13％。與對(duì)照組比較，EC的活菌數(shù)沒(méi)有變化。由此顯示本發(fā)明的米曲霉所生產(chǎn)的含有酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防EC感染癥的效果。
(8-1)水腫病菌對(duì)仔豬的攻擊試驗(yàn) 相對(duì)于仔豬的飼料(SD仔豬人工乳早期用，日本配合飼料(株)制備，未添加抗菌性物質(zhì)的飼料)的總質(zhì)量，將(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料分別作為實(shí)施例52-55。將30頭35日齡的仔豬(大約克夏)作為一組，飼育19天。另一方面，將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得飼料作為比較例20。將混合100ppm乳糖代替曲霉培養(yǎng)物所得的飼料作為對(duì)照組，同樣地進(jìn)行試驗(yàn)。在40日齡，每頭口服給予2.3×105CFU水腫病菌(大腸桿菌)，使其感染。飼養(yǎng)至54日齡，計(jì)算各組仔豬的死亡率。
與上述同樣，采集小腸內(nèi)容物，測(cè)定小腸內(nèi)容物的EC活菌數(shù)，計(jì)算感染指數(shù)和防御指數(shù)。
結(jié)果如表22所示。
[表22]
給予含有實(shí)施例52-55的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的飼料的仔豬，其死亡率約為20-30％左右，與給予比較例20的飼料的組的死亡率相比較小。另外，小腸內(nèi)容物的EC感染指數(shù)低，特別在實(shí)施例52中，得到了高的防御指數(shù)。另外，與對(duì)照組比較，浮腫病菌的活菌數(shù)幾乎沒(méi)有變化。由此顯示含有本發(fā)明的醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生成的酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防水腫病的效果。
(8-2)水腫病菌對(duì)仔豬的攻擊試驗(yàn) 將(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得的仔豬用飼料作為實(shí)施例56。將AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物混合成100ppm，將所得的飼料作為比較例21。將混合100ppm乳糖代替曲霉培養(yǎng)物所得的飼料作為對(duì)照組，使用這些飼料飼養(yǎng)仔豬，進(jìn)行水腫病菌攻擊試驗(yàn)。除了口服給予1.8×105CFU的水腫病菌之外，試驗(yàn)方法與上述水腫病菌攻擊試驗(yàn)同樣。
結(jié)果如表23所示。
[表23]
給予含有實(shí)施例56的IK-05074株的飼料的仔豬，其死亡率為約20％左右，與給予了比較例21的飼料的組的死亡率相比較小。小腸內(nèi)容物的EC感染指數(shù)低。與對(duì)照組相比，水腫病菌的活菌數(shù)幾乎沒(méi)有變化。由此顯示本發(fā)明的米曲霉所生產(chǎn)的含有酸性酶的培養(yǎng)物具有預(yù)防水腫病的效果。
(9-1)球蟲防除試驗(yàn) (a)柔嫩艾美耳球蟲防除試驗(yàn) 收集自然感染柔嫩艾美耳球蟲的雞糞，在實(shí)體顯微鏡下分離卵囊，用生理鹽水洗滌。向直徑9cm的培養(yǎng)皿中加入5ml生理鹽水，加入約4000個(gè)/ml洗凈的卵囊。將(2-1)(a)得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物以各50mg加入到培養(yǎng)皿中，分別作為實(shí)施例57-60。將加入了50mg AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為比較例22，將不加入曲霉培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為對(duì)照組。將各培養(yǎng)皿在37℃下振蕩(150rpm)。7天后在實(shí)體顯微鏡下進(jìn)行卵囊個(gè)數(shù)的測(cè)定、細(xì)胞壁的變形或溶解狀態(tài)的觀察，計(jì)算卵囊減少率和溶解變性率。
結(jié)果如表24所示。
[表24]
1)第7天殘留的卵囊中的比例。
如實(shí)施例57-60所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固體培養(yǎng)物與比較例22的所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，柔嫩艾美耳球蟲的卵囊數(shù)目明顯減少，并且顯示高的溶解變性活性。特別是在AOK210株中，通過(guò)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的卵囊進(jìn)行處理，可以得到極高的卵囊減少率和溶解變性率。
(b)邱氏艾美耳球蟲防除試驗(yàn) 收集自然感染邱氏艾美耳球蟲的牛痢疾糞便，在實(shí)體顯微鏡下分離卵囊，用生理鹽水洗滌。向直徑9cm的培養(yǎng)皿中加入5ml生理鹽水，加入約2000個(gè)/ml洗凈的卵囊。將(2-1)(a)得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固體培養(yǎng)物以各50mg加入到培養(yǎng)皿中，分別作為實(shí)施例61-64。將加入了50mg AOK 1006s株的粉碎固體培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為比較例23，將不加入曲霉培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為對(duì)照組。將各培養(yǎng)皿在37℃下振蕩(150rpm)。7天后在實(shí)體顯微鏡下進(jìn)行卵囊個(gè)數(shù)的測(cè)定、細(xì)胞壁的變形或溶解狀態(tài)的觀察，計(jì)算卵囊減少率和溶解變性率。
結(jié)果如表25所示。
[表25]
1)第7天殘留的卵囊中的比例。
如實(shí)施例61-64所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固體培養(yǎng)物與比較例23的所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，邱氏艾美耳球蟲的卵囊數(shù)目明顯減少，并且顯示高的卵囊溶解變性活性。特別是在AOK210株中，通過(guò)對(duì)邱氏艾美耳球蟲的卵囊進(jìn)行處理，可以得到極高的卵囊減少率和溶解變性率。
(9-2)球蟲防除試驗(yàn) (a)柔嫩艾美耳球蟲防除試驗(yàn) 將加入了(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為實(shí)施例65，按照與上述同樣的方法進(jìn)行柔嫩艾美耳球蟲防除試驗(yàn)。另外以加入了AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為比較例24，同樣進(jìn)行試驗(yàn)。
結(jié)果如表26所示。
[表26]
1)第7天殘留的卵囊中的比例。
如實(shí)施例65所示，IK-05074株的固體培養(yǎng)物與比較例24所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，柔嫩艾美耳球蟲的卵囊數(shù)目明顯減少，并且顯示高的卵囊溶解變性活性。
(b)邱氏艾美耳球蟲防除試驗(yàn) 將加入了(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固體培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為實(shí)施例66，按照與上述同樣的方法進(jìn)行邱氏艾美耳球蟲防除試驗(yàn)。另外以加入了AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿作為比較例25，同樣進(jìn)行試驗(yàn)。
結(jié)果如表27所示。
[表27]
1)第7天殘留的卵囊中的比例。
如實(shí)施例66所示，IK-05074株的固體培養(yǎng)物與比較例25所示的AOK 1006s株的固體培養(yǎng)物相比，邱氏艾美耳球蟲的卵囊數(shù)目明顯減少，并且顯示高的卵囊溶解變性活性。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性 將動(dòng)物用飼料添加劑與飼料混合，使動(dòng)物攝取，由此可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收，提高飼料效率。其中所述動(dòng)物用飼料添加劑含有本發(fā)明的曲霉菌和含該菌所生產(chǎn)的酸性酶的培養(yǎng)物。動(dòng)物腸道內(nèi)，由于曲霉菌菌體濃度增加，腸內(nèi)菌群平衡得到改善。并且可以抑制病原菌或球蟲的增殖，預(yù)防并改善動(dòng)物的腸道感染癥。本發(fā)明的飼料也適用于雞、豬、牛等家禽家畜的飼養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.動(dòng)物用飼料添加劑，該動(dòng)物用飼料添加劑含有選自醬油曲霉(Aspergillus sojae)、塔木里氏曲霉(Aspergillus tamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑色曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一種菌，以及由這些菌生產(chǎn)的含酸性酶的培養(yǎng)物。
2.權(quán)利要求1的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述菌是醬油曲霉和/或米曲霉。
3.權(quán)利要求1或2的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述米曲霉是保藏號(hào)為FERM BP-10622的米曲霉IK-05074株或者具有與之相同的生產(chǎn)酸性酶的能力的該菌株的突變株。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述酸性酶是酸性淀粉酶。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑，其特征在于上述菌對(duì)于引起動(dòng)物腸道感染癥的病原菌具有抗菌活性和/或具有針對(duì)球蟲的殺原生動(dòng)物活性。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述培養(yǎng)物含有植物性營(yíng)養(yǎng)源。
7.權(quán)利要求6的動(dòng)物用飼料添加劑，其中，上述植物性營(yíng)養(yǎng)源是糙米。
8.飼料，該飼料含有權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的動(dòng)物用飼料添加劑。
9.飼料的制備方法，其特征在于在含有使菌增殖的營(yíng)養(yǎng)源的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)選自醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的至少一種菌，使飼料中含有所得培養(yǎng)物。
全文摘要
為了輔助動(dòng)物的消化活動(dòng)、提高飼料效率、預(yù)防并改善炎癥性腸道障礙等動(dòng)物腸道感染癥，可以將選自醬油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的至少一種菌與這些菌所生成的酸性酶組合，使動(dòng)物攝取。
文檔編號(hào)A23K1/16GK101312657SQ200680043368
公開日2008年11月26日 申請(qǐng)日期2006年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者門田明彥, 鈴木源士, 伊藤真治, 杉本康明, 望月正己 申請(qǐng)人:出光興產(chǎn)株式會(huì)社