專利名稱：一種培育高產(chǎn)水稻的方法及專用分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育高產(chǎn)水稻的方法及專用分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物，近20年來，其在產(chǎn)量方面的潛力沒有取得大的突破。Rangel et al(Rangel PH，Guimaraes EP，Neves PCF.Base genetics DNA cultivatedde arroz(oryza sativa L.)irrigado do Brasil.Pesq Agropec Bras，1996，31349-357)和Tanksley(Tanksleys SD，McCouch SR.Seed banks and molecularmapsUnlocking genetic potential from the wild.Science，1997，2771063-1066)指出育種資源狹窄是造成這種局面的根本原因。因此當(dāng)前作物育種亟待發(fā)掘一批新基因，以拓寬作物遺傳的基礎(chǔ)。而發(fā)掘新基因、利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)水稻產(chǎn)量性狀進(jìn)行選擇正是國內(nèi)外現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著水稻飽和分子連鎖圖的構(gòu)建，利用分子標(biāo)記定位了大量控制水稻產(chǎn)量性狀的數(shù)量性狀基因座(QTL)，然而利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其產(chǎn)量性狀進(jìn)行改良的報(bào)道甚少。
普通野生稻是栽培稻的祖先種，其遺傳多樣性大于栽培稻，野生稻在演化成栽培稻過程中，經(jīng)過自然選擇和人工選擇，基因多樣性降低，等位基因數(shù)減少。據(jù)研究，栽培稻的等位基因數(shù)約為野生稻的60％(Sun CQ，Wang XK，Li ZC，Yoshimura A.Comparison of the genetic diversity of common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice(O.sativa L.)using RFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102157-162)。從野生稻中發(fā)掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的優(yōu)異基因，并把它們應(yīng)用于水稻育種生產(chǎn)中具有十分重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。已經(jīng)克隆的高抗白葉枯病基因Xa21發(fā)現(xiàn)于長花藥野生稻(O.longistaminata)。章琦等(章琦，趙炳宇，趙開軍，王春連，楊文才，林世成，闕更生，周永力，李道遠(yuǎn)，陳成斌，朱立煌.普通野生稻的抗水稻白葉枯病新基因Xa-23(t)的鑒定和分子標(biāo)記定位.作物學(xué)報(bào)，2000，26(5)536-542)從廣西普通野生稻中找到一個(gè)全生育期廣譜高抗基因Xa23。Xiao等(Xiao J，Grandillo S，Ahn SN et al.Gene from wild rice improveyield.Nature，1996，384223-224)從低產(chǎn)的馬來西亞普通野生稻中找到可分別增產(chǎn)17％和18％的兩個(gè)QTL。Li等(Li DJ，Sun CQ，F(xiàn)u YC，Chen L，Zhu ZF，Li C，Cai HW，Wang XK.Identification and mapping of genes for improvingyield from Chinese common wild rice(O.rufipogon Griff.)using advancedbackcross QTL analysis.Chinese Science Bulletin，2002，181533-1537)從我國江西東鄉(xiāng)野生稻中發(fā)現(xiàn)并定位了2個(gè)高產(chǎn)QTL。但對(duì)于水稻產(chǎn)量性狀的基因座(QTL)目前僅停留在定位的階段。
利用分子標(biāo)記對(duì)水稻抗白葉枯病基因、稻瘟病基因的分子標(biāo)記輔助選擇的技術(shù)國內(nèi)外均有報(bào)道，但迄今為止，關(guān)于水稻產(chǎn)量性狀QTLs的分子標(biāo)記選擇技術(shù)還未見報(bào)道。
野生稻是低產(chǎn)植物，但是存在高產(chǎn)基因，如何發(fā)掘野生稻中的高產(chǎn)基因，并且建立野生稻高產(chǎn)基因分子標(biāo)記選擇技術(shù)是世界性的難題。我國野生稻資源豐富，從野生稻中發(fā)掘、定位高產(chǎn)基因，尋找與高產(chǎn)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，建立高產(chǎn)基因分子標(biāo)記選擇技術(shù)并獲得專利保護(hù)，不僅為培育超高產(chǎn)新品種提供新基因和新技術(shù)，而且對(duì)加強(qiáng)我國野生稻基因資源的保護(hù)，將資源優(yōu)勢變成經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育高產(chǎn)水稻的方法及專用分子標(biāo)記。
本發(fā)明所提供的培育高產(chǎn)水稻的專用分子標(biāo)記，是由下述引物對(duì)之一經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對(duì)，命名為lrk1；2)由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對(duì)，命名為nPM4。
所述專用分子標(biāo)記位于江西東鄉(xiāng)野生稻第2染色體短臂上的分子標(biāo)記RM279和Indel12之間的209kb范圍內(nèi)，并在此范圍內(nèi)定位到一個(gè)可提高水稻產(chǎn)量的QTL，命名為qGY2-1，實(shí)驗(yàn)證明帶有該QTL的滲入系比超高產(chǎn)品種桂朝2號(hào)還可增產(chǎn)5-12％。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種培育高產(chǎn)水稻的方法。
本發(fā)明所提供的培育高產(chǎn)水稻的方法，是以具有權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的QTL的品種作父本、需改良的品種作母本雜交，雜交種與需改良品種回交，從得到的回交種中篩選出含有所述QTL的單株，再與需改良品種回交至少2次，最后自交，得到高產(chǎn)的水稻品種；其中，從回交種中篩選出含有所述QTL的單株的方法，是以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有812bp大小的條帶，同時(shí)以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有1178bp大小的條帶。
用引物對(duì)lrk1和nPM4進(jìn)行篩選時(shí)，如擴(kuò)增產(chǎn)物中分別有812bp和1178bp大小的條帶，待測水稻中含有可提高水稻產(chǎn)量的基因。
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系可為水稻基因組DNA模板20ng，Taq酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩沖液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％Triton X-100)，100μMdNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。
PCR反應(yīng)條件可為先94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；再72℃10min。
可通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有812bp和1178bp大小的條帶。
本發(fā)明在江西東鄉(xiāng)野生稻QTL精細(xì)定位中開發(fā)的分子標(biāo)記可用于鑒別普通野生稻、栽培稻中是否存在可提高水稻產(chǎn)量的基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)高產(chǎn)水稻植株的選擇。用本發(fā)明的方法培育水稻高產(chǎn)新品種具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用。且因不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可在早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率。本發(fā)明在水稻的品種改良中具有重要意義。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為東鄉(xiāng)野生稻和桂朝2號(hào)的基因組DNA為模板，分別在引物對(duì)lrk1和nPM4的引導(dǎo)下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(分子標(biāo)記)的帶型圖2為在引物對(duì)nPM4引導(dǎo)下對(duì)一些品種的鑒定結(jié)果圖3為在引物對(duì)lrk1引導(dǎo)下對(duì)一些品種的鑒定結(jié)果圖4為超高產(chǎn)品種“桂朝2號(hào)”和轉(zhuǎn)育了QTL qGY2-1的單株的表型具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、可提高水稻產(chǎn)量QTL qGY2-1的發(fā)現(xiàn)及定位首先將江西東鄉(xiāng)普通野生稻與超高產(chǎn)品種“桂朝2號(hào)”進(jìn)行雜交和回交，分別構(gòu)建了以桂朝2號(hào)為遺傳背景的高代回交群體和野生稻基因滲入系，再利用SSR標(biāo)記采用Mapmanage QTX軟件在江西普通野生稻的第2染色體RM233A附近，發(fā)現(xiàn)1個(gè)能使桂朝2號(hào)產(chǎn)量提高的高產(chǎn)QTL(Li DJ，Sun CQ，F(xiàn)u YC，Chen L，Zhu ZF，Li C，Cai HW，Wang XK.Ident ificat ion and mapping of genes for improving yieldfrom Chinese common wild rice(O.rufipogon Griff.)using advanced backcrossQTL analysis.Chinese Science Bulletin，2002，181533-1537)。在此基礎(chǔ)上，選擇含有該QTL區(qū)段的高產(chǎn)滲入系，與桂朝2號(hào)回交，構(gòu)建針對(duì)該QTL區(qū)段的近等基因系，利用疊代定位方法，對(duì)該QTL進(jìn)行精細(xì)定位，將其定位在江西東鄉(xiāng)野生稻第2染色體短臂上的分子標(biāo)記RM279和Indel12之間的209kb范圍內(nèi)，將該QTL命名為qGY2-1，田間栽培實(shí)驗(yàn)證明攜帶該高產(chǎn)基因的植株比沒有該基因的植株增產(chǎn)幅度為5-30％，且?guī)в性換TL的滲入系比超高產(chǎn)品種桂朝2號(hào)還可增產(chǎn)5-12％。對(duì)該209kb的區(qū)間進(jìn)行水稻基因組序列查詢，結(jié)果表明該區(qū)間含有8個(gè)類植物硫代激動(dòng)素受體蛋白(LRR-Kinase)基因，這類基因在胡蘿卜中已被證明具有促進(jìn)細(xì)胞增生的功能(Yoshikatsu M.Mari O.Akiko M.Youji S.An LRR receptor kinase involved inperception of peptide plant hormone.Science，2002，2961470-1472)。
實(shí)施例2、可提高水稻產(chǎn)量QTL qGY2-1的篩選及應(yīng)用1、引物設(shè)計(jì)及帶型分析根據(jù)實(shí)施例1獲得的QTL qGY2-1所在區(qū)域的日本晴基因組序列，利用DNAsist軟件設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)lrk1(序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2)和nPM4(序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4)。
具體方法為以東鄉(xiāng)野生稻和桂朝2號(hào)的基因組DNA為模板，分別在引物對(duì)lrk1和nPM4的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為水稻基因組DNA模板20ng，Taq酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩沖液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg2+，1％Triton X-100)，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。PCR反應(yīng)條件為先94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；再72℃10min。反應(yīng)結(jié)束，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示，lrk1在東鄉(xiāng)野生稻中能擴(kuò)增出812bp的片段，而這個(gè)片段在桂朝2號(hào)中缺失，nPM4在東鄉(xiāng)野生稻中能擴(kuò)增出1178bp的片段，在桂朝2號(hào)中擴(kuò)增出的片段只有609bp。結(jié)合基因型與表型分析，確認(rèn)這兩標(biāo)記與該QTL qGY2-1共分離。因此可依據(jù)用上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物中是否同時(shí)有812bp和1178bp大小的條帶對(duì)水稻品種進(jìn)行篩選。
2、可提高水稻產(chǎn)量QTL qGY2-1的篩選及高產(chǎn)水稻的培育利用本發(fā)明的專用分子標(biāo)記對(duì)所收集到的水稻品種進(jìn)行QTL(qGY2-1)篩選，把篩選到的含有qGY2-1的品種作供體親本，與不含該QTL而需要改良的目標(biāo)品種雜交后回交，利用本發(fā)明的專用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，把該QTL轉(zhuǎn)育到需要改良的目標(biāo)品種去。
具體步驟為首先利用本發(fā)明的專用分子標(biāo)記，用步驟1的方法，對(duì)需改良的優(yōu)良株型的品種和收集到的各種不同來源的水稻品種進(jìn)行鑒定，結(jié)果所收集到的品種中含有而需改良的品種不含該QTL，表明可進(jìn)行轉(zhuǎn)育改良。接下來，把篩選出的含有QTL(qGY2-1)的品種與需改良品種按生育期長短依次種植，調(diào)好花期。在抽穗開花期，以含有QTL(qGY2-1)的品種作父本、需改良的品種作母本雜交，所獲得的雜交種再與需改良品種回交，稱作BC1F1，利用本發(fā)明的分子標(biāo)記在BC1F1群體中篩選出含有該QTL的單株再與需改良品種回交，如此循環(huán)幾次，最后自交一次，選擇出產(chǎn)量更高而其它農(nóng)藝性狀與需改良品種相似的株系，該株系穩(wěn)定后可推廣。
下面就上述方法利用具體實(shí)例來示范可提高水稻產(chǎn)量QTL qGY2-1的篩選及利用收集品種如下K17A，K17B，金23A，金23B，特青，明恢63，瀘恢17，東鄉(xiāng)野生稻，王南25，桂朝2號(hào)，E32，8015s，中作8923，中作123，中作9017，H2W44，Y22s，377-60，C418，粵泰A，勝泰1號(hào)、日本晴、診富11號(hào)，早昭005，鎮(zhèn)88，中粳83-D。
分別提取上述不同水稻品種的基因組DNA，用步驟1的方法，分別在引物對(duì)lrk1和nPM4的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2和圖3所示(圖2中泳道A為K17A，泳道B為K17B，泳道C為金23A，泳道D為金23B，泳道E為特青，泳道F為明恢63，泳道G為瀘恢17，泳道H為東鄉(xiāng)野生稻，泳道I為王南25，泳道J為桂朝2號(hào)，泳道K為E32，泳道L為8015s，泳道M為中作8923，泳道N為中作123，泳道0為中作9017，泳道P為H2W44，泳道Q為Y22s，泳道R為377-60，泳道S為C418，泳道T為粵泰A，泳道U為勝泰1號(hào)，泳道V為日本晴；圖3中泳道A為診富11號(hào)，泳道B為早昭005，泳道C為鎮(zhèn)88，泳道D為中粳83-D，泳道E-V與圖2中品種相同)，恢復(fù)系特青、明恢63、瀘恢17和優(yōu)良不育系8015s、Y22s及粵泰A在引物對(duì)lrk1和nPM4的引導(dǎo)下，可分別擴(kuò)增出812bp和1178bp的片段，具有和東鄉(xiāng)野生稻相同的基因型，表明這些水稻品種中含有可提高水稻產(chǎn)量的QTL qGY2-1。
已知東鄉(xiāng)普通野生稻中含有而秈稻品種“桂朝2號(hào)”中不含QTL qGY2-1，把東鄉(xiāng)普通野生稻與“桂朝2號(hào)”進(jìn)行雜交和回交，利用本發(fā)明的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，在東鄉(xiāng)普通野生稻為供體的BC4F5群體中選擇到一個(gè)含有QTL qGY2-1而其它背景為“桂朝2號(hào)”的株系，該株系與“桂朝2號(hào)”的農(nóng)藝性狀相似，但長勢更旺，產(chǎn)量更高，其表型如圖4所示。
序列表<160>4<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tcgaggttgg agatgctggt t21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aaatgatctg aattggtgtt cgg 23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atttcatcgt tggcttatca gtc 23<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4aatcgttcta tgcgcaaagg tt 2權(quán)利要求
1.一種培育高產(chǎn)水稻的專用分子標(biāo)記，是由下述引物對(duì)之一經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對(duì)；2)由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對(duì)。
2.一種培育高產(chǎn)水稻的方法，是以具有權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的QTL的品種作父本、需改良的品種作母本雜交，雜交種與需改良品種回交，從得到的回交種中篩選出含有所述QTL的單株，再與需改良品種回交至少2次，最后自交，得到高產(chǎn)的水稻品種；其中，從回交種中篩選出含有所述QTL的單株的方法，是以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有812bp大小的條帶，同時(shí)以待測水稻基因組DNA為模板，用由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有1178bp大小的條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為水稻基因組DNA模板20ng，Taq酶0.5U，2.0μl 10×PCR緩沖液，100μM dNTPs，正向引物0.2μM，反向引物0.2μM，用DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先94℃30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)；再72℃ 10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為1％瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育高產(chǎn)水稻的方法及專用分子標(biāo)記。該分子標(biāo)記是由下述引物對(duì)之一經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1)由序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2組成的引物對(duì)；2)由序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4組成的引物對(duì)。用本發(fā)明的方法培育水稻高產(chǎn)新品種具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用。且因不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，可在早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率。本發(fā)明在水稻的品種改良中具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H1/04GK1765915SQ20051010500
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月26日
發(fā)明者孫傳清, 羅小金, 田豐, 李德軍, 朱作峰, 付永彩, 何光明, 楊金水 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)