專利名稱：轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體和制備轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及將外源核酸引入植物，更特別的涉及轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法。
背景技術(shù)：
質(zhì)體是一類以各種形式存在所有活植物細胞中的密切相關(guān)的細胞器。所有質(zhì)體有幾個共同特征。例如，它們具有小基因組，并且被由雙層膜組成的包膜包裹。所有質(zhì)體來自原生質(zhì)體，是存在于分生組織細胞中的較小的細胞器。質(zhì)體根據(jù)各分化細胞的需要產(chǎn)生。例如，如果葉子在暗處生長，原生質(zhì)體發(fā)育成含有稱為原葉綠素的黃色葉綠素前體的黃化質(zhì)體。如果另一方面，葉子在光線下生長，通過將原葉綠素轉(zhuǎn)化成葉綠素，黃化質(zhì)體發(fā)育成葉綠體。葉綠體是光合作用(植物制造其自身的有機營養(yǎng)物的過程)的部位。質(zhì)體的其它形式是聚集類胡蘿卜素色素的色質(zhì)體。這些質(zhì)體負責許多物種中花瓣和果實的黃-橙-紅色。白色體基本上是增大的前質(zhì)體。它們存在于許多表皮和內(nèi)部組織中，不變成綠色和進行光合作用。造粉體是白色體的常見形式。它們在貯藏組織中貯藏淀粉，在一些莖、葉和根的細胞中作為植物響應(yīng)重力的部分。所有質(zhì)體含有多個質(zhì)體基因組拷貝，大部分能夠在細胞中分裂。缺少其質(zhì)體群的唯一類型的高等植物細胞是一些物種中的雄性精細胞。因此，玉米等植物的質(zhì)體是母體遺傳的。即，它們僅從卵細胞獲得其質(zhì)體。見Alberts等，Molecular Biology of the Cell，Garland Publishing(New York)，1983，pp.1120-1122。
高等植物的質(zhì)體基因組是環(huán)形的雙鏈DNA分子，約120-165kb，在每個葉細胞中可存在2,000-50,000個拷貝。與植物的核基因組相比，質(zhì)體基因組由于幾個理由成為了基因操縱的非常吸引人的目標。由于質(zhì)體中的蛋白質(zhì)以非常高的水平表達，質(zhì)體的分子機制主要是細菌機制。另外，可實現(xiàn)更高程度的屏蔽(不通過花粉傳遞)，并通過同源重組機制整合異源DNA。DNA隨機整合到植物的核基因組中。另一方面，質(zhì)體基因組整合的位置可以通過特定的旁側(cè)序列來控制。沒有基因沉默或所謂的位置效果，因此表達的水平更可預(yù)測。表達的水平也高得多，因為每個植物細胞中有多個DNA拷貝。葉綠體基本上是一種細菌，因此它比基因組DNA更容易容納細菌核酸，而不需要修飾。該優(yōu)點也適用于相關(guān)的調(diào)節(jié)序列，例如細菌啟動子?；鞠嘶蜥尫诺江h(huán)境中的危險(稱為“異型雜交”)，因為葉綠體不移動到花粉中。最后，由于葉綠體是大部分生物合成途徑，例如淀粉、氨基酸和脂肪的位置，它插入基因，并使其在感興趣的細胞器中發(fā)揮作用相對方便，而不需要特定的前導序列。
證明質(zhì)體轉(zhuǎn)化非常難，特別在于農(nóng)業(yè)有價值的作物中。大部分轉(zhuǎn)化方法是物種和變種特異性的。總的說，這些限制反映了復雜和獨特的物種特異性途徑，這些途徑是在體外生長的植物組織中選擇轉(zhuǎn)化的質(zhì)體。僅報道過能育的轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草植株的能再現(xiàn)的生產(chǎn)(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530(1990))。在Sikdar等，Plant Cell Rep.1820-24(1998)中報道了轉(zhuǎn)質(zhì)體的擬南芥屬植物，但這些植株是不育的。在該領(lǐng)域缺乏成功，雖然作了巨大投資，說明了問題的重大。因此，對于產(chǎn)生轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組(transplastomic)植物的方法存在迫切需要。
發(fā)明簡述本發(fā)明的第一個方面針對一種轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法。該方法包括進行步驟(a)將來自第一種植物的細胞的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到第二種通常是基因不同的植物的細胞中；(b)在質(zhì)體中引入感興趣的核酸，因此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化質(zhì)體；和(c)將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到第三種植物的細胞中，其中第一和第三種植物可以是基因上相同或不同的。
在優(yōu)選例中，質(zhì)體從一種植物轉(zhuǎn)移到另一種，是在細胞水平上進行的，涉及體細胞融合。衍生自第一種植物的一個細胞的原生質(zhì)體與衍生自第二種植物的細胞的原生質(zhì)體融合，從而形成胞質(zhì)雜種。在其它優(yōu)選例中，轉(zhuǎn)移的質(zhì)體與第二種植物的質(zhì)體基因重組，導致形成重組質(zhì)體。然后用核酸轉(zhuǎn)化重組質(zhì)體。在其它優(yōu)選例中，第一和第三種植物是同一植物科的成員或更優(yōu)選的，是同一屬中的物種。煙草是優(yōu)選的受體植物(即第二種植物或剪切板(clipboard)植物)，在其中進行核酸的轉(zhuǎn)化。蕓苔屬(Brassica)是另一類優(yōu)選受體植物。
本發(fā)明的第二個和相關(guān)的方面針對一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的方法，包括(a)將質(zhì)體從第一種植物的細胞轉(zhuǎn)移到第二種基因不同的植物的細胞；(b)在質(zhì)體中引入感興趣的核酸，它含有可選擇標記，從而提供轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；(c)將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到第三種植物的細胞中，其中第一和第三種植物可以是彼此基因相同或基因不同的；和(d)從(c)的細胞再生表達標記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。
還提供了轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物本身及其部分，例如葉、根、莖、芽和衍生自植物的種子。在優(yōu)選例中植物是同質(zhì)體基因組的(homoplastomic)。
本發(fā)明的第三個方面針對一種轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法，包括(a)將感興趣的核酸引入第一種植物的細胞的質(zhì)體，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；和(b)將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到第二種植物的細胞，其中第一和第二種植物是基因不同的。
在該方面，質(zhì)體的轉(zhuǎn)化在質(zhì)體轉(zhuǎn)移到另一植株前進行。在優(yōu)選例中，第一和第二種植物是同一科的成員，更優(yōu)選是同一屬的成員。上述的其它與本發(fā)明的第一方面有關(guān)的優(yōu)選例在本這里適用。
本發(fā)明的第四個和相關(guān)的方面針對一種制備轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的方法。該方法包括步驟(a)將含有可選擇標記基因的感興趣的核酸引入第一種植物的細胞的質(zhì)體，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；(b)將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到第二種植物的細胞，其中第一和第二種植物是基因不同的；(c)從(b)的細胞再生表達可選擇標記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。
本發(fā)明的第五個方面針對從植物獲得的植物細胞或原生質(zhì)體，或所述細胞或原生質(zhì)體的培養(yǎng)物，含有從基因不同的植物獲得的質(zhì)體，其中質(zhì)體被感興趣的DNA分子轉(zhuǎn)化。在優(yōu)選例中，植物細胞是煙草屬(Nicotiana)細胞、茄屬(Solanum)細胞、諸葛菜(Orychophragmus)細胞、雷斯克懶勒屬(Lesquerella)細胞或蕓苔屬(Brassica)細胞。在其它優(yōu)選例中，質(zhì)體獲自馬鈴薯、番茄、茄子、枸杞(Licium)屬或蕓苔屬。在其它優(yōu)選例中，受體或剪切板植物細胞是煙草細胞，質(zhì)體來自茄科的另一成員，例如馬鈴薯、番茄、茄和寧夏枸杞(Licuium barbarum L.)獲得(或“供給”)。在其它優(yōu)選例中，受體植物細胞是諸葛菜屬細胞或雷斯克懶勒屬細胞，質(zhì)體是從蕓苔(Brassica napus L.)獲得的。在其它實施例中，受體和供體植物是禾本科的成員。
本發(fā)明的方法是特別有利的，因為它們對于幾乎所有作物物種，特別是經(jīng)濟上重要的變種提供了相對容易和有效的質(zhì)體操縱方法。
附圖簡述


圖1是本發(fā)明實施例的示意性說明。
圖2是溴乙錠染色的凝膠的照片，顯示在各種植物中存在外源DNA。用對aadA基因的內(nèi)部特異性的引物進行了PCR擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物長479bp。轉(zhuǎn)化的煙草(N.tabacum)DNA用作陽性對照。泳道1-馬鈴薯(即馬鈴薯/煙草重組質(zhì)體)，未轉(zhuǎn)化的植株(陰性對照)；2-馬鈴薯，克隆l；3-馬鈴薯，克隆2；4-馬鈴薯，克隆3；5-煙草，轉(zhuǎn)化植株(陽性對照)，478bp；6-煙草(顛茄屬(Atropa))胞質(zhì)雜種；7-煙草(賽莨菪屬(Scopolia))胞質(zhì)雜種；8-煙草(蛾蝶花屬(Salpiglossis))胞質(zhì)雜種；9-1kb DNA序列梯。
圖3是溴乙錠染色的凝膠照片，表明外源DNA在植物中的存在。進行PCR擴增反應(yīng)，其中一個引物對于aadA基因的內(nèi)部部分是特異性的，其它引物對于葉綠體基因組DNA是特異性的。擴增產(chǎn)物的大小是1100-1400bp之間。作為陽性對照，使用了轉(zhuǎn)化的煙草的DNA。泳道1-1kb DNA序列梯；2-煙草，轉(zhuǎn)化的植株(陽性對照)；3-馬鈴薯，克隆1；4-馬鈴薯，克隆2；5-煙草(蛾蝶花屬)胞質(zhì)雜種。
圖4是溴乙錠染色的凝膠照片，顯示馬鈴薯/煙草重組質(zhì)體中質(zhì)體的嵌合性質(zhì)。比較了煙草(泳道2、5、8、11、14)、馬鈴薯(泳道3、6、9、12、15)和馬鈴薯(泳道4、6、10、13、16)的葉綠體基因組。片段trnI-ndhD未消化(泳道2-4)，或用DraI(泳道5-7)、StyI(泳道8-10)、EcoRI(泳道11-13)或HaeIII(泳道14-16)限制性內(nèi)切核酸酶處理。
圖5是優(yōu)選例中質(zhì)體pCB033的圖，用于用含有aadA基因的茄屬植物相關(guān)的質(zhì)體制備轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，該基因用于在16SrRNA啟動子的控制下在大觀霉素/鏈霉素上選擇，側(cè)接用于同源重組整合的序列。
圖6是與pCB033類似的質(zhì)體pCB040的圖，但其中選擇旁側(cè)區(qū)用于經(jīng)同源重組整合入蕓苔物種。
本發(fā)明的優(yōu)選實施模式制備轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的困難不僅與在細胞水平引入外源核酸有關(guān)。事實上，整個挑戰(zhàn)特別困難的方面在于轉(zhuǎn)質(zhì)體細胞缺乏再生性，特別是對于產(chǎn)生同質(zhì)體基因組細胞。見Bilang等，Nature Biotech，16333-334(1998)。術(shù)語“同質(zhì)體基因組”意味著細胞的質(zhì)體中不含野生型質(zhì)體基因組(plastome)(即質(zhì)體基因組)。即，所有質(zhì)體含有感興趣的核酸。除了再生性小，選擇同質(zhì)體基因組植物細胞非常困難。
本發(fā)明克服了這兩個主要障礙，通過將要轉(zhuǎn)化的質(zhì)體移動或重新定位到核環(huán)境中，在其中不難實現(xiàn)同質(zhì)體基因組細胞的選擇。受體細胞提供了對質(zhì)體和外源核酸轉(zhuǎn)化到質(zhì)體中相容和適宜的環(huán)境。轉(zhuǎn)化后，受體或剪切板細胞在更容易轉(zhuǎn)化的核背景中繼續(xù)生長并分裂，促進同質(zhì)體基因組細胞的選擇。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體的方法，其中將感興趣的核酸引入非天然環(huán)境中的質(zhì)體。轉(zhuǎn)化的質(zhì)體被移回原植物或基因不同的植物的細胞中。本文所用的術(shù)語“基因不同”的植物意味著包括相同物種的突變體、不同的物種、屬和科。術(shù)語“植物”意味著包括所有高等植物，優(yōu)選有花植物。類似的，各種植物，例如本文所用的“馬鈴薯”和“番茄”意味著含有馬鈴薯和番茄的所有形式、品系和變種等。本文所用的“轉(zhuǎn)化的”意味著在植物質(zhì)體中通過摻入感興趣的核酸(例如編碼一種蛋白質(zhì))進行基因修飾。一般核酸對于供體植物(即質(zhì)體來源的植物)、受體和/或最終受體是外源性的DNA。“外源性”意味著在要轉(zhuǎn)化的植物中正常情況下找不到該核酸，或在正常情況下發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)與引入的不同。在優(yōu)選例中，核酸對于供體植物是外源性的。
煙草是一種感興趣的質(zhì)體的優(yōu)選受體(或剪切板)。設(shè)計了一系列遠緣胞質(zhì)雜種，它們組合了煙草核和其它經(jīng)濟上重要的茄科物種(馬鈴薯、番茄、胡椒、茄、曼陀羅)的質(zhì)體。然后測試這些胞質(zhì)雜種的質(zhì)體轉(zhuǎn)化性，將得到的轉(zhuǎn)化的質(zhì)體返回其原始核背景，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。同樣的方法用于十字花科，由此說明發(fā)明的廣泛實用性。一般可用以下方法選擇在本發(fā)明的方法中使用的植物配對。受體(或“剪切板”)的候選植物是突變的。篩選含有不合成葉綠素的質(zhì)體的突變株(“白色突變株”)。處理，例如輻照來自候選質(zhì)體供體的原生質(zhì)體，殺死核。使衍生自白色突變株的原生質(zhì)體與衍生自候選供體的經(jīng)處理的葉綠體融合。選擇綠色集落和再生的胞質(zhì)雜種或體細胞雜種。綠色集落含有從供體轉(zhuǎn)移來的功能性質(zhì)體。輻照確保唯一可能的轉(zhuǎn)化事件涉及質(zhì)體，而不是核。綠色集落的形成證明供體和受體植株是相容的，至少在質(zhì)體的范圍內(nèi)。
從一種植物將質(zhì)體轉(zhuǎn)移到另一種植物可以通過融合衍生自供體和受體細胞的原生質(zhì)體最方便的進行，然后從受體移到最終植物。質(zhì)體的重組是隨機事件，但用分子生物學中的標準技術(shù)可鑒定該事件。可以通過有性雜交實現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)移，其中花粉提供了非天然的核環(huán)境。
引入感興趣的核酸的優(yōu)選方法是通過基因槍(biolistics)或PEG-介導的基因轉(zhuǎn)移。見Daniell，Methods Enzymol.217536-556(1993)；Ye等，Plant Mol.Biol.15809-819(1990)；Daniell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8788-92(1990)；Daniell等，Plant Cell Reports 9615-619(1991)和Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917(1993)。核酸包括用于鑒定轉(zhuǎn)化體的標記。選擇方案包括由于質(zhì)體16S核糖體RNA基因突變，或表達工程改造的細菌aadA得到的大觀霉素抗性(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530(1990)；Svab和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917(1993))和由于表達新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的卡那霉素抗性(Carrer等，Mol.Gen.Genet.24149-56(1993))。標記基因不需要與DNA(例如編碼感興趣的蛋白質(zhì)的)物理上相連；它可以通過另一種載體傳遞。見Carrer等，BIO/TECHNOLOGY 13791-794(1995)。優(yōu)選但不必要把核酸整合到質(zhì)體基因組中。為了促進感興趣的核酸有效和定向整合到質(zhì)體基因組中，核酸側(cè)接靶質(zhì)體中存在的DNA序列。實施例中列出了特定的序列。另見國際專利出版物WO 00/28014(“茄科植物的質(zhì)體轉(zhuǎn)化”)和WO 00/39313(“蕓苔屬的質(zhì)體轉(zhuǎn)化”)。
感興趣的核酸變化很廣，并包含從任何觀點看有價值的植物中編碼表達的任何蛋白質(zhì)的DNA。本發(fā)明特別適合在轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中顯示需要非常高的表達水平的新性狀。根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，在每一個細胞中含有數(shù)千個DNA拷貝，導致非常高的基因表達水平。DNA和蛋白質(zhì)屬于作物保護、作物改良、產(chǎn)生包括特定化學物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)和其它與食物質(zhì)量有關(guān)的產(chǎn)物的特定化合物，例如改性淀粉、油和蛋白質(zhì)成分，總的來說需要一組協(xié)同基因的表達，因此需要特別的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來使植物顯示感興趣的性狀。外源基因可用于改進植物的輸入需求，例如它們對環(huán)境的反應(yīng)，它們保護自身不受蟲害的能力，保護自身不受生物異源物質(zhì)的傷害，或改變其它性狀，例如總產(chǎn)量，產(chǎn)生營養(yǎng)平衡的蛋白質(zhì)，質(zhì)量更好的淀粉，高質(zhì)或高產(chǎn)量的油或維生素水平?；蜻€可以使植物進行它們通常不實現(xiàn)的功能，例如產(chǎn)生藥物，例如蛋白質(zhì)(如促生長素等生長激素)、抗原和小分子。例如，文獻報道了帶有賦予抗昆蟲性和除草劑，以及胞質(zhì)雄性不育性的轉(zhuǎn)基因的經(jīng)基因工程改造的質(zhì)體。見McBride等，Bio/Technology 13362-365(1995)(含有“先前未有的”3-5％ cryIAC蛋白的轉(zhuǎn)質(zhì)體煙草葉)；Kota等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961840-1845(1999)(報道在葉綠體中表達BtCry2Aa2蛋白降低昆蟲抗性)；McBride和Maliga，PCT專利，WO 95/24492；McBride和Stalker，PCT專利WO 95/24493；Daniell等，Nature/Biotechnology16345-348(1998)；Blowers等，PCT專利WO 99/05265；Maliga，PCT專利WO95/25787。
本發(fā)明的一個實施例在
圖1中示意說明。最初可產(chǎn)生一個宿主(剪切板)，它由于葉綠體功能受損是白色的。選擇容易轉(zhuǎn)化和再生的剪切板。將來自感興趣的物種的葉綠體通過原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)移到剪切板植物中，產(chǎn)生了穩(wěn)定的中間物。從含有剪切板物種的核和靶物種的質(zhì)體的融合產(chǎn)物再生出的植物是正常和穩(wěn)定的。在這些胞質(zhì)雜種中進行轉(zhuǎn)化。胞質(zhì)雜種與靶物種的融合可以用衍生自同質(zhì)體基因組胞質(zhì)雜種植物的原生質(zhì)體進行，從而產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的靶植物?？梢詮倪@些細胞再生出完整植物。
在本發(fā)明的另一個方面，質(zhì)體在其天然環(huán)境中轉(zhuǎn)化，然后轉(zhuǎn)化入基因不同的植物。當供體植物能對許多相關(guān)的受體植物(例如茄科的成員)提供質(zhì)體時該方法特別有利?？梢愿鶕?jù)標準技術(shù)分離或制備含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的細胞(或原生質(zhì)體)(其中質(zhì)體對于基因不同的植物是天然的)、細胞的培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。
一旦轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移入或在最終受體植株的細胞中形成，可從表達可選擇標記基因的細胞再生出轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。在優(yōu)選例中，植物是從同質(zhì)體基因組的細胞再生的。同質(zhì)體基因組性可以根據(jù)標準技術(shù)實現(xiàn)，例如在選擇培養(yǎng)基上重復細胞分裂的過程中選擇性消除野生型質(zhì)體基因組拷貝。DNA(即引入序列)的拷貝數(shù)指示了是否實現(xiàn)了同質(zhì)體基因組性。見Daniell等(1998)，見上，Kanevski等，Plant Physiol.119133-141(1999)(通過在相同的選擇培養(yǎng)基上從葉子再生出芽的重復循環(huán)，然后在無抗生素的Murashige-Skoog瓊脂上令芽生根獲得同質(zhì)體基因組的大觀霉素抗性植物)。一旦獲得同質(zhì)體基因組受體細胞，將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到供體植物的細胞中。受體的同質(zhì)體性質(zhì)促進了轉(zhuǎn)移后的選擇。優(yōu)選轉(zhuǎn)移是通過融合衍生自各細胞的原生質(zhì)體進行的。能育植物可以根據(jù)標準技術(shù)從原生質(zhì)體再生。用標準方法也實現(xiàn)了獲得各種植物部分，例如根、芽、葉和莖，和從植物得到的種子。
據(jù)信本發(fā)明的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物具有可跟蹤的基因差異，可將它們在基因水平上與通過直接質(zhì)體轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的植物區(qū)別開來。最令人注意的區(qū)別在于討論的物質(zhì)的線粒體DNA組成(GLEBA，Y.Y.，SYTNIK，K.M.(1984)原生質(zhì)體融合，Springer，Berlin，Heidelberg，New York，1-220)。高等植物的線粒體DNA是多形性的，任何種間細胞雜交始終產(chǎn)生非常獨特的重排，大部分沒有表型效應(yīng)(GLEBA，Y.Y.，SHLUMUKOV，L.R.(1990)體細胞雜交和胞質(zhì)雜交，于Bhojwani，S.S.編，PlantTissue CultureApplication and Limitations，Elsevier，Amsterdam，OxfordNew York，316-344)。但是它們可方便的通過線粒體DNA分析的標準分子生物學方法被識別，例如親本物種跟細胞雜交第一和第二輪產(chǎn)生的材料的限制性分布或聚合酶鏈式反應(yīng)。因此，“剪切板”介導的質(zhì)體轉(zhuǎn)化爾得的材料通常是獨特的，在該方面不同于用其它技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)質(zhì)體材料。
除了線粒體組成，從含有對植物為非天然的轉(zhuǎn)化質(zhì)體的細胞再生的植物完全可以與通過直接的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)質(zhì)體作物植物區(qū)分開來。例如，本發(fā)明的方法產(chǎn)生含有來自Solanum rickii、Solanum cardiophyllum或Solanum papita的轉(zhuǎn)化葉綠體的具有完整功能的馬鈴薯(Solanum tuberosum)。還描述了馬鈴薯與這些質(zhì)體基因組的功能性胞質(zhì)雜種Sidorov、Samoylov、Samoylov、Glagotskaya、Gleba，Proc Academy of Sci USSR 308，741-744(1989)和Sidorov、Yevtushenko、Shakhovsky和Gleba，Theor.Appl.Genet.88525-529(1994)。
在優(yōu)選例中，植物細胞是煙草屬細胞、茄屬細胞、諸葛菜屬細胞、雷斯克懶勒屬細胞或蕓苔屬細胞。在其它優(yōu)選例中，從馬鈴薯、番茄、茄、枸杞屬或蕓苔屬獲得質(zhì)體。在其它優(yōu)選例中，受體或剪切板植物細胞是煙草細胞，質(zhì)體從茄科，例如馬鈴薯、番茄、茄和寧夏枸杞等另一個成員獲得(“或供給”)。在其它優(yōu)選例中，受體植物細胞是諸葛菜屬細胞或雷斯克懶勒屬細胞，質(zhì)體從蕓苔獲得。在其它實施例中，受體和供體植物是禾本科的成員。
下面一種和多種出版物描述了本領(lǐng)域有關(guān)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化，包括本文所用的技術(shù)和遺傳因子的狀態(tài)。
Daniell和McFadden，美國專利5,693,507McBride和Maliga，美國專利5,545,818McBride和Maliga，PCT專利WO 95/24492；McBride和Stalker，PCT出版物WO 95/24493；McBride和Stalker，PCT出版物WO 95/16783；Maliga，PCT出版物WO 95/25787；Maliga，Allison和Haydukiewicz，PCT出版物WO 97/06250；Maliga，Carrer和Chaudhuri，PCT出版物WO 97/47771；Maliga和Maliga，美國專利5,45l,513；Maliga，Sikdar和Reddy，PCT出版物WO97/32977；Baldev，Gaikwad，Kirti，Mohapatra，Prakash和Chopra，Mol.Gen.Genet，260357-361(1998)；Boynton，Gillham，Harris，Hosler，Johnson，Jones，Randolph-Anderson，Robertson，Klein，Shark和Sanford，Science，2401534-1537(1988)；Carrer，Hockenberry，Svab和Maliga，Molec.Gen.Genet.24149-56(1993)；Daniell，Datta，Gray，Varma和Lee，Bio/Technology 16345-348(1998)；Eigel和Koop，Mol.Gen.Genet.233479-482(1992)；Fahleson，Eriksson，Landgren，Stymne和Glimelius，Theor.Appl.Genet.87795-804(1994)。
Gleba和Sytnik，Monogr.Theor.Appl.Genet.81-220(12984)。
Jarvis，Chen，Li，Peto，F(xiàn)abkhauser和Chory，Science 282100-103(1998)；Kermickle，Science 1661422-1424(1969)；Kindiger，Crop Sci，34321-322(1994)；Koop，Steinmueller，Wagner，Roessler，Eibl，Sacher，Planta199193-201(1996)；
Kota，Daniell，Varma，Garczynski，Gould和Moar，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961840-1845(1999)；Kushnir，Shlumukov，Pogrebnyak，Berger和Gleba，Mol.Gen.Genet.209159-163(1987)；McBride，Svab，Schaaf，Hogan，Stalker和Maliga，Bio/Technology13362-365(1995)；Ramulu，Dijkhuis，F(xiàn)amelaer，Cardi和Verhoeven，Planta 190190-198(1993)；Sidorov，Yevtushenko，Shakhovsky和Gleba，Theor.Appl.Genet.88525-529(1994)；Sidorov，Kasten，Pang，Hajdukiewicz，Staub，Nehra，The PlantJ.19209-216(1999)；Sikdar，Serino，Chaudhuri和Maliga，Plant Cell Rep，1820-24(1998)；Strepp，Scholz，Kruse，Speth和Reski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA954368-4373(1998)；Svab，Hajdukiewicz和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530(1990)；Svab和Maliga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90913-917(1993)；Thanh和Medgyesy，Plant Mol.Biol.1287-93(1989)；Thanh，Smith，Medgyesy和Marton，Mol.Gen.Genet.213186-190(1988)；Verhoeven，van Eck.Blaas和Dijkhuis，Plant Cell Rep.14781-785(1995)；Wolters，Vergunst，van der Werff和Koorneef，Mol.Gen.Genet.241707-718(1993)；Zubko和Day，Plant J.15265-271(1998)；Zubko，Zubko，Patskovsky，Rhvedynych，F(xiàn)isahn，Gleba和Schieder，J.Exp.Botany 471101-1110(1996)。
下文所述的實驗基于使用具有利于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的核背景的系統(tǒng)，提供了重要作物物種(馬鈴薯、番茄、胡椒、曼陀羅、顛茄和十字花科植物)成功的質(zhì)體轉(zhuǎn)化的例子。
實施例I蛾蝶花屬質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和蛾蝶花屬轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的產(chǎn)生如Sidorov等，Theor.Appl.Genet.88525-529(1994)所述，體外培養(yǎng)喇叭舌草(Salpiglossis sinuata L.)植株和具有質(zhì)體基因組編碼的葉綠素缺陷(Kushnir等，Mol.Gen.Genet.209159-163(1987))的煙草突變植株。根據(jù)Gleba和Sytnik，Monogr.Theor.Appl.Genet.81-220(1984)所述的標準方法分離和融合葉肉原生質(zhì)體。再生綠色重組株，選擇綠色煙草樣的小植株。選出了幾種獨立的光合作用品系并進一步分析。以基于PEG-介導的基因傳遞的公開方法(Koop，Steinmueller，Wagner，Roessler，Eibl，Sacher，Planta 199193-201(1996))，，與大觀霉素和鏈霉素篩選(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 878526-8530(1990))組合，用含有喇叭舌草質(zhì)體和煙草核的重組株進行質(zhì)體轉(zhuǎn)化。選出了幾種獨立的推測已轉(zhuǎn)化株，進一步測試。在產(chǎn)生的植物材料中，鑒定出真實穩(wěn)定的質(zhì)體轉(zhuǎn)化株。見圖2和3。然后分離這些植株的葉肉原生質(zhì)體，將喇叭舌草品系的體細胞與其融合。不需要白化的突變株，因為可以輕易的鑒定str/spm抗性葉綠體。獲得了許多進行光合作用的大觀霉素/鏈霉素抗性再生株，它們是喇叭舌草樣的植物，含有轉(zhuǎn)質(zhì)體喇叭舌草質(zhì)體(照片未顯示)。
實施例II番茄質(zhì)體的轉(zhuǎn)化在這些實驗中，使用了體外生長的正常番茄(Lycopersicon esculentum L.)植株和龍葵(Solanum nigrum)的卡那霉素和潮霉素抗性植株。所用的培養(yǎng)條件和融合方法基本如Wolters等，Mol.Gen.Genet.241707-718(1993)所述。通過在番茄和輻照過的龍葵之間融合獲得了剪切板品系。產(chǎn)生的植株具有花，但是雄性不育的。產(chǎn)生的綠色再生株含有番茄葉綠體和來自原始的兩個親本的雜交核物質(zhì)。轉(zhuǎn)化和推測的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的選擇如實施例I所述。用正常番茄植株對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物授粉。獲得種子，長出具有轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的番茄樣植株。
實施例III茄(Solanum melongena)質(zhì)體的轉(zhuǎn)化如Sidorov等，Theor.Appl.Genet.88525-529(1994)所述，體外培養(yǎng)茄植株和具有質(zhì)體基因組編碼的葉綠素缺陷(Kushnir等，Mol.Gen.Genet.209159-163(1987))的煙草突變植株。根據(jù)Gleba和Sytnik，Monogr.Theor.Appl.Genet.81-220(1984)所述的標準方法分離和融合葉肉原生質(zhì)體。再生綠色重組株，選擇綠色煙草樣的小植株。分離和選擇了幾種獨立的光合作用品系并進一步分析。以基于PEG-介導的基因傳遞的已出版的方法(Koop等，Planta 199193-201(1996))，與大觀霉素和鏈霉素篩選(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA878526-8530(1990))組合，處理含有茄質(zhì)體和煙草核的幾種重組植株，來獲得轉(zhuǎn)化的質(zhì)體。選出了幾種獨立的推測已轉(zhuǎn)化株，進一步測試。如圖2和3所述，從植物材料中鑒定出穩(wěn)定的質(zhì)體轉(zhuǎn)化株。然后分離這些植株的葉肉原生質(zhì)體，與茄品系的體細胞融合。由于葉綠體具str/spm抗性，不需要白化的突變株。獲得的許多進行光合作用的大觀霉素/鏈霉素抗性再生株是茄樣的植物，含有轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的茄質(zhì)體(照片未顯示)。
實施例IV顛茄質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和顛茄轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的產(chǎn)生不用喇叭舌草而使體外培養(yǎng)的顛茄(Atropa belladonna L.)的正常植株生長。再次使用具有質(zhì)體基因組編碼的葉綠素缺陷的煙草突變植株作為這些實驗的受體。所有其它條件和實驗基本如實施例I中所述。顛茄原生質(zhì)體與煙草融合后，轉(zhuǎn)化和融合，使轉(zhuǎn)化的質(zhì)體從煙草移回顛茄綠色植株，獲得了顛茄樣的植株。
實施例V枸杞質(zhì)體轉(zhuǎn)化和枸杞轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的產(chǎn)生在該實驗中代替喇叭舌草使用體外培養(yǎng)的寧夏枸杞的正常植株，和質(zhì)體基因組編碼的葉綠素缺陷的煙草突變植株作為受體。所有其它條件和實驗如實施例I所述。
實施例VI馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)質(zhì)體的轉(zhuǎn)化在該實驗中使用體外生長的正常和白化馬鈴薯植株代替喇叭舌草。作為受體物種，使用野生型茄屬物種Solanum rickii L.為了培養(yǎng)S.rickii體外生長的植株的葉肉原生質(zhì)體，如Thanh等，Plant Mol.Biol.1287-93(1989)所述使用含有維生素和氨基酸的富集培養(yǎng)基。所有其它條件和實驗基本如實施例I中所述。
實施例VII
蕓苔(Brassica napus)質(zhì)體的轉(zhuǎn)化如Zubko等(1998)，見上)所述體外培養(yǎng)蕓苔(歐洲油菜)的正常植株和具有質(zhì)體基因組編碼的葉綠素缺陷的諸葛菜屬或雷斯克懶勒屬突變植株。根據(jù)標準方法(Fahleson等，Theor.Appl.Genet.87795-804(1994))分離和融合葉肉或胚芽鞘原生質(zhì)體。再生綠色重組株，選擇綠色諸葛菜和雷斯克懶勒樣的小植株。選出了幾種獨立的進行光合作用的品系并進一步分析。用基于基因槍的基因傳遞的已發(fā)表方法，和大觀霉素和鏈霉素選擇組合，對組合蕓苔質(zhì)體和諸葛菜或雷斯克懶勒核的重組株進行質(zhì)體轉(zhuǎn)化。選出了幾種獨立的推測已轉(zhuǎn)化株，進一步測試。從產(chǎn)生的植物材料中鑒定出真正穩(wěn)定的質(zhì)體轉(zhuǎn)化株。然后分離這些植株的葉肉原生質(zhì)體，與蕓苔品系的體細胞融合。獲得的許多進行光合作用的大觀霉素/鏈霉素抗性再生株是蕓苔樣的植物，含有轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的蕓苔質(zhì)體。
實施例VIII重組煙草+茄屬質(zhì)體的轉(zhuǎn)化在該實驗中使用體外生長的正常和白化馬鈴薯植株?；救鏣hanh等，Plant.Mol.Biol.1287-93(1989)所述，產(chǎn)生了組合煙草核和重組煙草-馬鈴薯質(zhì)體基因組(圖4)的重組植株。所有其它條件和實驗基本如實施例I中所述。產(chǎn)生含有重組和表達抗生素抗性的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組質(zhì)體的正常馬鈴薯植株。見
圖1和2。
實施例IX質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pCB033的構(gòu)建從煙草(N.tabacum)ptDNA亞克隆pNtcPs1(pNtcPs1含有99983-123672位之間的煙草質(zhì)體基因組片段；Shinozaki等，EMBO J.52043-2049(1986))切下4656bp的Bgl II片段。瓊脂糖凝膠純化含有基因ndhF，rpl32(CDS79)和trnL(trn30)的Bgl II片段，亞克隆入質(zhì)粒pBluescript KS(Stratagene，Heidelberg，Germany)的Bam HI位點，得到亞克隆pF4656BB。
在煙草16S rrn啟動子(16S-rDNA啟動子)的控制下，如下克隆含有大腸桿菌的氨基糖苷3’-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(aadA)的表達盒用聚合酶鏈式反應(yīng)從煙草總DNA，用引物“5-24”5’-CCGAATTCGCCGTCGTTCAATGAG-3’和“3-21”5’-CACGATATCGCCCGGAGTTG-3’擴增含有rrn啟動子的DNA片段。用EcoRI和EcoRV切割擴增的片段。用退火引物“5-rbs”5’-CTCGATATCACTAGTTGTAGGGAGGGA-3’和引物“3-rbs”5’-GTGCCATGGATCCCTCCT-3’構(gòu)建含有煙草rbcL基因的核糖體結(jié)合位點(RBS)的接頭DNA片段。用DNA聚合酶的Klenow片段填充突出端。隨后用EcoRV和NcoI切割該片段。用EcoRV和NcoI切割含有與增強鞘單胞菌(Chlamydomonasreinhardtii)rbcL下游區(qū)440bp片段融合的細菌aadA基因的質(zhì)粒pUC-atpX-AAD(Dr.M.Goldschmidt-C1ermont提供)，從而除去原始的pUC-atpX-AAD啟動子片段。將用EcoRV和NcoI處理的“5-rbs”和“3-rbs”(核糖體結(jié)合位點)的退火產(chǎn)物和EcoRI和EcoRV處理的PCR產(chǎn)物(rrn啟動子)同時插入無啟動子的pUC-atpX-AAD載體，得到克隆pUC16SaadA。
從pUC16SaadA上通過用SmaI和EcoRI切割切下含有aadA表達盒的1.4kbp片段。通過與DNA聚合酶的Klenow片段的填充反應(yīng)，將EcoRI末端轉(zhuǎn)換成平端。凝膠純化所得到的平端片段。
用SnaBI限制性酶使載體pF4656BB線性化。用堿性磷酸酶處理線性片段，防止在下面的連接反應(yīng)中自身環(huán)化。然后在連接反應(yīng)中使用從pUC16SaadA切下的aadA表達盒和pF4656BB的線性片段。篩選得到的克隆是否存在aadA盒。選擇含有與ndhF基因具有相同取向的aadA盒的分子，得到轉(zhuǎn)化載體pFaadAI。
通過將Sal I/XbaI片段(攜帶含有質(zhì)體基因組序列和aadA表達盒的插入片段)亞克隆入pKS-負載體(已用XhoI/XbaI線性化)，除去載體多克隆位點中的HincII限制性位點。
為了減少載體的總尺寸，用Nde I和Sma I消化分子，在用DNA聚合酶的Klenow片段處理后重新連接，得到質(zhì)粒pCB033，如圖5所示。
實施例X質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pCB040的構(gòu)建用DNeasy植物小試劑盒(QIAGEN，Hilden，Germany)分離蕓苔(歐洲油菜)的總DNA。
選擇2515bp(煙草質(zhì)體基因組圖中的位置140126bp-142640bp)的煙草(N.tabacum)的高度保守的質(zhì)體基因組片段。用該煙草序列設(shè)計PCR引物左側(cè)引物“trn V-li-65”5’-CCA CGT CAA GGT GAC ACT C-3’右側(cè)引物“rps 7-re-66”CTG CAG TAC CTC GAC GTG用引物“trn V-li-65”和“rps 7-re-66”，以蕓苔的總DNA作為模板，用Pfu-聚合酶(Promega)進行PCR擴增。確定PCR最佳條件(加入4mM MgCl2，退火溫度升至57℃)后，反應(yīng)得到約2800bp的產(chǎn)物，然后用瓊脂糖凝膠純化。
以Taq DNA聚合酶(QIAGEN)如pGEM-T-easy手冊(Promega)所述，用“A-加尾”直接將該片段克隆入pGem-T-easy載體中。用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化反應(yīng)，根據(jù)廠商說明與pGEM-T-easy載體一起用于連接反應(yīng)。用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化連接產(chǎn)物，用于電穿孔介導的“Epicurian Coli Sure”電感受態(tài)細胞(Stratagene)的轉(zhuǎn)化。電穿孔在細菌電穿孔的標準條件下(電容25μF，分路電阻201 OHM，脈沖5ms)用Peqlab(Erlangen，Germany)電脈沖裝置進行。細菌鋪在含有100微升10mN IPTG和100微升2％ X-gal的氨芐青霉素(75mg/L)LB-瓊脂平板上。
用藍-白選擇系統(tǒng)，選出白色集落，用QIAprep Spin Mini Prep試劑盒(Qiagen)分離其質(zhì)粒DNA。
用限制性分析(以NotI限制)，選出陽性克隆得到質(zhì)粒pCan01。陽性克隆的質(zhì)粒DNA進行測序(TopLab，Martinsried，Germany)。用序列數(shù)據(jù)確定插入片段的取向，找出aadA盒的合適整合位點。選擇位置828的Bpu1102I位點作為aadA標記盒的插入位點。
如下制備攜帶aadA標記盒的DNA片段用Pfu DNA聚合酶進行PCR，從模板pUC 16SaadA擴增aadA-表達盒(見實施例IX)。用引物“aadA-uni-li-94”5’-GCTCGA GAT ACC GGT CCC GGG AAT TCG CCG TCG-3’和“aadA-uni-re-95”5’-GGT TAACGG CGC CTG GTA CCG AGC TCC ACC GCG-3’進行PCR反應(yīng)。通過瓊脂糖凝膠電泳純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
用Bpu1102I消化載體pCan01，用Klenow片段產(chǎn)生平端。然后進行去磷酸化(首先用蝦堿性磷酸酶，然后再用小牛腸磷酸酶處理)，防止自身連接。用苯酚抽提滅活磷酸酶。
用線性的pCab01片段與上述aadA-標記片段進行連接反應(yīng)。用“快速連接試劑盒”(Roche，Penuberg，Germany)進行連接。用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化連接產(chǎn)物。用電穿孔法在上述標準條件下轉(zhuǎn)化Epicurian Coli Sure電感受態(tài)細胞(Stratagene)。
在含有氨芐青霉素(75mg/L)和大觀霉素(100mg/L)的LB-瓊脂培養(yǎng)皿上選擇集落。用Cfr42I、Eco32I、NotI和PvuI進行限制性分析，鑒定陽性克隆，并分析插入片段的取向。顯示正確插入的克隆稱為pCB040，在圖6中示意性說明。
工業(yè)應(yīng)用性本說明書所有引用的專利和非專利出版物說明了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有這些出版物和專利申請在此以相同程度引用以供參考，如同各單獨出版物或?qū)＠暾埵翘貏e和單獨說明在此引用以供參考的。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法，其特征在于，該方法包括(a)將質(zhì)體從第一種植物的細胞轉(zhuǎn)移到第二種基因不同的植物的細胞；(b)將感興趣的核酸轉(zhuǎn)移入所述質(zhì)體，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；和(c)將所述轉(zhuǎn)化的質(zhì)體引入第三種植物的細胞，其中第一和第三種植物可以是彼此基因相同或基因不同的。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，(a)包括將衍生自第一種植物的細胞的原生質(zhì)體與衍生自所述第二種植物的細胞的原生質(zhì)體融合，從而形成第一種胞質(zhì)雜種。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述(c)的轉(zhuǎn)移步驟包括將含有所述轉(zhuǎn)化的質(zhì)體的胞質(zhì)雜種與衍生自所述第三種植物的細胞的原生質(zhì)體融合。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一、第二和第三種植物是同一科的成員。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移是通過細胞融合實現(xiàn)的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移是通過有性雜交實現(xiàn)的。
7.一種轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法，其特征在于，該方法包括(a)將質(zhì)體從第一種植物的細胞轉(zhuǎn)移到第二種基因不同的植物的細胞，其中所述質(zhì)體與所述第二種植物的質(zhì)體基因重組，從而產(chǎn)生重組質(zhì)體；(b)將感興趣的核酸引入所述重組質(zhì)體，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；和(c)將所述轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移入第三種植物的細胞，其中第一和第三種植物可以是彼此基因相同或基因不同的。
8.一種形成轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的方法，其特征在于，該方法包括(a)將質(zhì)體從第一種植物的細胞轉(zhuǎn)移到第二種基因不同的植物的細胞；(b)將含有可選擇標記基因的感興趣的核酸引入所述質(zhì)體，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；(c)將所述轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移入第三種植物的細胞，其中第一和第三種植物可以是彼此基因相同或基因不同的；和(d)從(c)的細胞再生出表達可選擇標記基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。
9.一種轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法，其特征在于，該方法包括(a)將感興趣的核酸引入第一種植物的細胞的質(zhì)體，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；和(b)將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到第二種植物的細胞，其中所述第一和第二種植物是基因不同的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一和第二種植物是同一科的成員。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一和第二種植物是同一屬中的物種。
12.一種制備轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的方法，其特征在于，該方法包括將含有可選擇標記基因的感興趣的核酸引入第一種植物的細胞的質(zhì)體，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體；將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到第二種植物的細胞，其中第一和第二種植物是基因相同的；和從表達可選擇標記基因的(b)的細胞再生出轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。
13.用權(quán)利要求8所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，或其部分。
14.如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其特征在于，該植物是同質(zhì)體基因組的。
15.衍生自權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的種子。
16.用權(quán)利要求12所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，或其部分。
17.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其特征在于，該植物是同質(zhì)體基因組的。
18.衍生自權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的種子。
19.一種植物的細胞或原生質(zhì)體，或其培養(yǎng)物，其特征在于，所述細胞或原生質(zhì)體含有從基因不同的植物獲得的質(zhì)體，其中所述質(zhì)體已用感興趣的DNA分子轉(zhuǎn)化。
20.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，該細胞是煙草屬細胞。
21.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，該細胞是茄屬細胞。
22.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，該細胞是諸葛菜屬細胞。
23.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，該細胞是雷斯克懶勒屬細胞。
24.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，該細胞是蕓苔屬細胞。
25.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，所述質(zhì)體是從馬鈴薯獲得的。
26.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，所述質(zhì)體是從番茄獲得的。
27.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，所述質(zhì)體是從茄子獲得的。
28.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，所述質(zhì)體是從枸杞獲得的。
29.如權(quán)利要求19所述的細胞，其特征在于，所述質(zhì)體是從蕓苔獲得的。
全文摘要
公開了轉(zhuǎn)化質(zhì)體和將轉(zhuǎn)化的質(zhì)體從一種植物移到另一種的方法。還公開了轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物、其部分和其衍生的種子。還公開了一種植物的細胞或原生質(zhì)體，或其培養(yǎng)物(例如愈傷組織培養(yǎng)物)，其中細胞或原生質(zhì)體含有從遺傳上不同的植物的細胞獲得的，并含有感興趣的核酸的質(zhì)體。
文檔編號A01H5/00GK1419599SQ01807068
公開日2003年5月21日 申請日期2001年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月22日
發(fā)明者N·V·屈奇克 申請人:依康遺傳學股份有限公司