+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。
[0043](5)原生質(zhì)體的的處理:將游離的鐵皮石斛原生質(zhì)體先用碘乙酰胺溶液避光處理lOmin，然后用原生質(zhì)體洗滌液沖洗3?5次，再用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL。馬鞭石斛原生質(zhì)體先用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL，然后鋪在直徑1.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中形成薄層用γ-射線處理。所述的碘乙酰胺溶液為:lmmol/L碘乙酰胺(1A)+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH為5.8。所述原生質(zhì)體洗滌液為:1/2MS+5mmol/L腿3+0.611101/1甘露醇+511111101/10&(:12，？!1為5.4。所用的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為1/2MS+0.6mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。所述γ -射線處理指的是80Gy，劑量率為4Gy/min的6t3Co- γ -射線。
[0044](6)原生質(zhì)體的不對稱融合:將鐵皮石斛原生質(zhì)體與馬鞭石斛原生質(zhì)體按體積比1:1進行混合均勻，用聚乙二醇融合法進行融合。
[0045](7)類原球莖的誘導(dǎo)與植株再生:融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng)獲得細胞團，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)即獲得完整的體細胞雜種植株。所述的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol /LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS+1.5mg/LNAA+0.2g/L蛋白胨+0.lg/L酸性水解酪蛋白+35g/L蔗糖+5.0g/L瓊脂+lg/L活性炭。
[0046](8)體細胞雜種植株的鑒定:利用染色體核型、FISH和GISH及SSR技術(shù)相結(jié)合，對馬鞭石斛染色體小片段在體細胞雜種植株染色體及基因組中的分布進行定性和定量分析，從而達到鑒定體細胞雜種植株。
[0047]實施例3
[0048]1、品種來源
[0049]受體:鐵皮石斛;供體:馬鞭石斛。
[0050]2、培育過程
[0051 ] (I)人工授粉:按常規(guī)方法進行栽培管理，選定株系優(yōu)良的石斛植株作為親本，在石斛開花后進行異花授粉。
[0052](2)非共生萌發(fā):在石斛蒴果發(fā)育基本成熟而果實未開裂時，消毒后，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，將種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上在溫度為28°C、光照強度為15001x、光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)30天后種子萌發(fā)成原球莖。所述萌發(fā)培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁 50ml/L+椰汁 50ml/L+白糖 30g/L+瓊脂粉 3.6g/L。
[0053](3)懸浮培養(yǎng):將非共生萌發(fā)形成的供體和受體原球莖分別轉(zhuǎn)入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細胞系。所述的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA lmg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁 100ml/L+白糖 30g/L。
[0054](4)原生質(zhì)體游離:將供體和受體懸浮細胞分別接種到含有酶解液的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基中，在25 0C、黑暗條件下進行間歇振蕩酶解處理20小時。所述酶解液為:4.0 %纖維素酶R-10+1.5%離析酶R-10+2%果膠酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH為5.8。所述原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.3mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。
[0055](5)原生質(zhì)體的的處理:將游離的鐵皮石斛原生質(zhì)體先用碘乙酰胺溶液避光處理20min，然后用原生質(zhì)體洗滌液沖洗3?5次，再用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL。馬鞭石斛原生質(zhì)體先用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL，然后鋪在直徑1.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中形成薄層用γ-射線處理。所述的碘乙酰胺溶液為:4mmol/L碘乙酰胺(1A)+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH為5.4。所述原生質(zhì)體洗滌液為:1/2MS+5mmol/L腿3+0.611101/1甘露醇+511111101/10&(:12，？!1為5.4。所用的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為1/2MS+0.lmg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.5g/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。所述γ -射線處理指的是80Gy，劑量率為4Gy/min的6t3Co- γ -射線。
[0056](6)原生質(zhì)體的不對稱融合:將鐵皮石斛原生質(zhì)體與馬鞭石斛原生質(zhì)體按體積比1:1進行混合均勻，用聚乙二醇融合法進行融合。
[0057](7)類原球莖的誘導(dǎo)與植株再生:融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng)獲得細胞團，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)即獲得完整的體細胞雜種植株。所述的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol /LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH為5.4。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5mg/LNAA+2.0g/L蛋白胨+0.5g/L酸性水解酪蛋白+20g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂+0.3g/L活性炭。
[0058](8)體細胞雜種植株的鑒定:利用染色體核型、FISH和GISH及SSR技術(shù)相結(jié)合，對馬鞭石斛染色體小片段在體細胞雜種植株染色體及基因組中的分布進行定性和定量分析，從而達到鑒定體細胞雜種植株。
【主權(quán)項】
1.一種基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)人工授粉:按常規(guī)方法進行栽培管理，選定株系優(yōu)良的石斛植株作為親本，在石斛開花后進行異花授粉； 2)非共生萌發(fā):在石斛蒴果發(fā)育基本成熟而果實未開裂時，消毒后，用無菌解剖刀沿蒴果縱軸方向?qū)⑤艄虚_，將種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上在溫度為25?28°C、光照強度為1500?20001x、光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)20?30天后種子萌發(fā)成原球莖； 3)懸浮培養(yǎng):將非共生萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細胞系；所述的液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA0.5?lmg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁100ml/L+白糖30g/L; 4)原生質(zhì)體游離:將懸浮細胞接種到含有酶解液的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基中，在25?28°C、黑暗條件下進行間歇振蕩酶解處理10?20小時； 5)原生質(zhì)體的的處理:將游離的石斛受體原生質(zhì)體先用碘乙酰胺溶液避光處理10?20min，然后用原生質(zhì)體洗滌液沖洗3?5次，再用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL;供體原生質(zhì)體先用原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基稀釋至15?16個/mL，然后鋪在直徑1.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中形成薄層用γ -射線處理； 6)原生質(zhì)體的不對稱融合:將供體原生質(zhì)體與受體原生質(zhì)體按體積比1:1進行混合均勻，用聚乙二醇融合法進行融合； 7)類原球莖的誘導(dǎo)與植株再生:融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng)獲得細胞團，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)即獲得完整的體細胞雜種植株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，所述步驟2)中的萌發(fā)培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁50ml/L+椰汁50ml/L+白糖 30g/L+瓊脂粉 3.6 ?4.4g/L03.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，所述步驟4)中酶解液為:4.0%纖維素酶R-10+1.5 %離析酶R-10+2 %果膠酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl2，pI^%5.4?5.8。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，所述步驟4)、5)和7)的原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基為:1/2MS+0.1?0.6mg/L NAA+5mmol/LMES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+50?80g/L葡萄糖+0.1 ?0.5g/L酸性水解酷蛋白，pH為5.4?5.8。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，所述步驟5)的碘乙酰胺溶液為:I?4mmol/L碘乙酰胺+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH 為5.4 ?5.8。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，所述步驟5)中的原生質(zhì)體洗滌液為:l/2MS+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaC12，p^5.4?5.807.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，所述步驟5)中的γ -射線指的是劑量為80Gy，劑量率為4Gyγ -射線。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，其特征在于，所述步驟7)中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5?1.5mg/LNAA+0.2?2.0g/L蛋白胨+0.1?0.5g/L酸性水解酪蛋白+20?35g/L蔗糖+3.0?7.0g/L瓊脂+0.3?I.0g/L活性炭。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于不對稱原生質(zhì)體雜交技術(shù)的石斛種質(zhì)的選育方法，石斛開花后采取人工方法授粉，將成熟的石斛蒴果經(jīng)消毒后切開把種胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成原球莖，然后轉(zhuǎn)入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行振蕩懸浮培養(yǎng)得到懸浮細胞系。將懸浮細胞接種到含有酶解液的液體培養(yǎng)基中進行酶解處理獲得原生質(zhì)體，供體原生質(zhì)體用γ-射線處理，受體原生質(zhì)體用碘乙酰胺進行處理，然后用聚乙二醇法進行原生質(zhì)體融合。融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體液體培養(yǎng)培養(yǎng)，將獲得細胞團轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)即獲得完整的體細胞雜種植株。本發(fā)明簡單易行，融合頻率高，可大幅度地拓寬了石斛的遺傳多樣性，為石斛雜交育種、遺傳改良和新種質(zhì)創(chuàng)造開辟了一條新途徑。
【IPC分類】C12N13/00, A01H4/00, C12N15/05, C12N5/04, C12N15/01
【公開號】CN105684896
【申請?zhí)枴緾N201610009888
【發(fā)明人】莫昭展, 梁鈞淞, 王小敏, 蘇建睦
【申請人】玉林師范學(xué)院
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年1月8日