2:1，v/v)進(jìn)行萃取分離，靜 置分層后取有機(jī)相層，用有機(jī)相層體積1/2的去離子水將有機(jī)相洗滌5次，洗滌過(guò)的有機(jī)相 層30°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，即獲得琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管；
[0095] (2)在45°C、200r/min條件下，在裝有回流裝置的反應(yīng)器中，加入2g N，N-二(羧基 甲基)-L-賴(lài)氨酸水合物、8g三乙胺和80g二甲基甲酰胺，加熱回流lOOrnin，在45°C、450r/min 條件下，將13g琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)5h，將反應(yīng)液lOOOOr/ min離心，沉淀用6倍沉淀物體積的二甲基甲酰胺洗滌3次，放入35°C真空干燥箱干燥即得表 面氨基三乙酸功能化的碳納米管；
[0096] (3)將步驟(2)獲得的表面氨基三乙酸功能化的碳納米管加入到9% (w/v)的氯化 銅溶液中，碳納米管濃度為8% (w/v)，室溫條件下，130轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢璺磻?yīng)55min，經(jīng)離心分離、 水洗滌后獲得銅離子鰲合修飾的碳納米管；
[0097] (4)將漆酶加入到含0.4g/L乙二胺四乙酸二鈉的一元醇-水混合物中，漆酶的濃度 為4g/L，一元醇-水混合物中含水7%，16°C、200r/min條件下，攪拌反應(yīng)80min，反應(yīng)液 10500r/min離心28min，含水7%的一元醇-水混合物洗滌3次，所得產(chǎn)物即為脫除銅離子的 漆酶；
[0098] (5)以步驟(3)得到的銅離子鰲合修飾的碳納米管作為載體與分散于pH2含水7% 的異丙醇-水混合物中的〇.4g/L步驟(4)得到脫除銅離子漆酶混合，碳納米管濃度7g/L，在 室溫條件下，180r/min攪拌反應(yīng)35min，經(jīng)離心、pH3.8的緩沖液洗滌后，獲得碳納米管固定 化漆酶。
[0099]固定化酶特性的測(cè)試：
[0100]基于直接電子傳遞的碳納米管固定化漆酶的漆酶負(fù)載量為55mg(漆酶)/g(碳納米 管)酶活回收率為91%，與同等碳納米管載體固定等量含銅天然漆酶相比，其他應(yīng)用條件一 致的情況下，其應(yīng)用于酚類(lèi)測(cè)定時(shí)的最低檢測(cè)限降低96%，其應(yīng)用于生物燃料電池時(shí)的電 流密度提高120 %。
[0101] 實(shí)施例6
[0102] (1)在室溫(約25°C)條件下，將28鹵代琥珀酰亞胺溶于80g丙酮，將3g碳酸鉀、4g焦 亞硫酸鉀、20g羧基化碳納米管在160g水中充分混合至無(wú)機(jī)鹽完全溶解，將丙酮溶液與水溶 液混合，38°C，400r/min攪拌35min，加入360g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)進(jìn)行萃取分離，靜 置分層后取有機(jī)相層，用有機(jī)相層體積1/2的去離子水將有機(jī)相洗滌4次，洗滌過(guò)的有機(jī)相 層36°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，即獲得琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管；
[0103] (2)在40°C、230r/min條件下，在裝有回流裝置的反應(yīng)器中，加入2g N，N-二(羧基 甲基）-L-賴(lài)氨酸水合物、9g三乙胺和90g二甲基甲酰胺，加熱回流88min，在50°C、400r/min 條件下，將15g琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)5h，將反應(yīng)液9000r/min 離心，沉淀用7倍沉淀物體積的二甲基甲酰胺洗滌3次，放入37°C真空干燥箱干燥即得表面 氨基三乙酸功能化的碳納米管；
[0104] (3)將步驟(2)獲得的表面氨基三乙酸功能化的碳納米管加入到8.5% (w/v)的氯 化銅溶液中，碳納米管濃度為7.5% (w/v)，室溫條件下，180轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢璺磻?yīng)32min，經(jīng)離心分 離、水洗滌后獲得銅離子鰲合修飾的碳納米管；
[0105] (4)將漆酶加入到含0.25g/L乙二胺四乙酸二鈉的一元醇-水混合物中，漆酶的濃 度為2.5g/L，一元醇-水混合物中含水8 %，13 °C、260r/min條件下，攪拌反應(yīng)90min，反應(yīng)液 13000r/min離心23min，含水8%的一元醇-水混合物洗滌3次，所得產(chǎn)物即為脫除銅離子的 漆酶；
[0106] (5)以步驟(3)得到的銅離子鰲合修飾的碳納米管作為載體與分散于PH2含水8% 的異丙醇-水混合物中的〇.5g/L步驟(4)得到脫除銅離子漆酶混合，碳納米管濃度9g/L，在 室溫條件下，190r/min攪拌反應(yīng)30min，經(jīng)離心、pH3.3的緩沖液洗滌后，獲得碳納米管固定 化漆酶。
[0107] 固定化酶特性的測(cè)試：
[0108] 基于直接電子傳遞的碳納米管固定化漆酶的漆酶負(fù)載量為65mg(漆酶)/g(碳納米 管)酶活回收率為92%，與同等碳納米管載體固定等量含銅天然漆酶相比，其他應(yīng)用條件一 致的情況下，其應(yīng)用于酚類(lèi)測(cè)定時(shí)的最低檢測(cè)限降低95%，其應(yīng)用于生物燃料電池時(shí)的電 流密度提高115 %。
[0109] 申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程， 但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述詳細(xì) 工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)， 對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的 保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，采用以下步驟制備： 一、 碳納米管的表面功能化 1 )、將碳納米管進(jìn)行琥珀酰亞胺基的接枝； 2)、將步驟1)得到的琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管進(jìn)行氨基三乙酸功能團(tuán)的接枝； 3 )、將步驟2)得到的碳納米管進(jìn)行銅離子鰲合修飾； 二、 對(duì)漆酶進(jìn)行脫銅離子處理； 三、 將表面功能化的碳納米管和脫除銅離子的漆酶混合，在室溫條件下攪拌，進(jìn)行漆酶 固定化反應(yīng)，然后經(jīng)離心分離、洗滌后獲得碳納米管固定化漆酶。2. 如權(quán)利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述碳納米管進(jìn)行氨基 三乙酸功能團(tuán)接枝的方法為： 1) 、接枝反應(yīng)溶液的制備 將N，N-二（羧基甲基)-L-賴(lài)氨酸水合物和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中，攪拌加熱回 流使二者完全溶于二甲基甲酰胺中； 2) 、將琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管放入接枝反應(yīng)溶液中，攪拌加熱回流，接枝反應(yīng)結(jié) 束后離心、洗滌、干燥，獲得表面氨基三乙酸功能化的碳納米管。3. 如權(quán)利要求2所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述接枝反應(yīng)溶液包括 1重量份的N，N-二(羧基甲基)-L-賴(lài)氨酸水合物、2~6重量份的三乙胺和20~60重量份的二 甲基甲酰胺。4. 如權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，接枝反應(yīng)的溫 度為30~60°C，攪拌速度為300~600r/min，反應(yīng)時(shí)間為3~6h。5. 如權(quán)利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，對(duì)漆酶進(jìn)行脫銅離子處 理的方法為:將漆酶加入到含有乙二胺四乙酸二鈉的一元醇和水的混合溶液中，攪拌反應(yīng) 后離心，洗滌，收集沉淀，得到脫除銅離子的漆酶。6. 如權(quán)利要求5所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述的一元醇為C1-C4 的直鏈或支鏈烷基一元醇中的任意1種或幾種的組合;所述一元醇和水的混合物中水的含 量為3-10% (v/v);乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.1-0.5g/L。7. 如權(quán)利要求5或6任一項(xiàng)所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，脫除銅離子 的反應(yīng)溫度為10~20°C，攪拌速度為100~300r/min，反應(yīng)時(shí)間為60-120min。8. 如權(quán)利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述碳納米管進(jìn)行琥珀 酰亞胺基的接枝的方法為： 1) 、將1重量份的鹵代琥珀酰亞胺完全溶解于15~45重量份的丙酮； 2) 、將0.5~2重量份碳酸鉀、1~2.5焦亞硫酸鉀、3~12份羧基化碳納米管在30~90重 量份的水中充分混合至無(wú)機(jī)鹽完全溶解； 3) 、將1)與2)溶液混合，在20~40 °C下，攪拌速率為300-1000r/min，反應(yīng)20-40min; 4) 、加入氯仿與水進(jìn)行萃取分離，然后經(jīng)洗滌、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到琥珀酰亞胺基接枝碳納米 管。9. 如權(quán)利要求1所述的一種碳納米管固定化漆酶，其特征在于，所述當(dāng)?shù)奶技{米管為羧 基化的碳納米管，每克碳納米管上漆酶負(fù)載量為40~80mg。10. 如權(quán)利要求1所述的碳納米管固定化漆酶用于生物檢測(cè)和電化學(xué)分析、生物燃料電 池、環(huán)境污染物的降解和染料脫色、有機(jī)合成、廢水處理。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種碳納米管固定化漆酶，其制備方法為先將碳納米管進(jìn)行琥珀酰亞胺基的接枝和氨基三乙酸功能團(tuán)的接枝，再進(jìn)行銅離子鰲合修飾的表面功能化處理，然后與脫除銅離子的漆酶進(jìn)行固定化反應(yīng)；漆酶活性中心與碳納米管表面功能基團(tuán)的銅離子直接聯(lián)接，從而可以實(shí)現(xiàn)真正意義的直接電子傳遞，克服了漆酶蛋白質(zhì)外殼對(duì)電子由活性中心到碳納米管的直接傳遞過(guò)程產(chǎn)生的屏蔽作用，本發(fā)明的碳納米管固定化漆酶解決了碳納米管固定化漆酶催化過(guò)程中電子傳遞速率受限的問(wèn)題，可提高固定化漆酶在生物檢測(cè)中的靈敏度，將酚類(lèi)測(cè)定時(shí)的最低檢測(cè)限降低85％～96％，在生物燃料電池應(yīng)用中的電流密度提高80％～120％。
【IPC分類(lèi)】C12N11/14
【公開(kāi)號(hào)】CN105647902
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】王 鋒, 徐玲
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日