。
[0040] 優(yōu)選地，步驟(3)所述表面氨基三乙酸功能化的碳納米管的濃度優(yōu)選為5-10% (w/ ￥)，例如5.1%、5.7%、6.1%、6.9%、7.5%、8.0%、8.13%、8.89%、9.11%、9.35%、9.92% 等。
[0041] 進(jìn)一步的，對(duì)漆酶進(jìn)行脫銅離子處理的方法為:將漆酶加入到含有乙二胺四乙酸 二鈉的一元醇和水的混合溶液中，攪拌反應(yīng)后離心，洗滌，收集沉淀，得到脫除銅離子的漆 酶。
[0042] 優(yōu)選地，所述漆酶選自真菌漆酶中的1種或至少2種的組合，典型但非限制性的實(shí) 例有Trametes漆酶、Rhizoctonia 漆酶、Polyporus漆酶、Phol iota 漆酶、Coriolus漆酶、 Agaricus漆酶、Podospora漆酶、Neurosporus crassa漆酶或Plebia radiata漆酶等，所述 組合例如Agaricus漆酶/Rhizoctonia漆酶、Trametes漆酶/PIebia radiata漆酶/Pholiota 漆酶、Coriolus漆酶/Agaricus漆酶/Podospora漆酶等；所述漆酶的濃度為l_5g/L，例如 l.lg/L、1.5g/L、1.9g/L、2.23g/L、2.78g/L、2.97g/L、3.2g/L、3.7g/L、4.1g/L、4.5g/L、 4.7g/L、4.9g/L 等。
[0043] 進(jìn)一步的，一元醇和水的混合物中的一元醇為C1-C4的直鏈或支鏈烷基一元醇中 的任意1種或至少2種的組合，所述一元醇的實(shí)例有甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、異丙醇、叔 丁醇等，本發(fā)明所述一元醇進(jìn)一步優(yōu)選自甲醇、乙醇、異丙醇中的任意1種或至少2種的組 合，所述組合例如甲醇/乙醇、乙醇/異丙醇/甲醇、異丙醇/乙醇等;所述一元醇和水的混合 物中水的含量為3-10%(v/v)，例如3·5%、3·7%、4·6%、5·7%、6·3%、7·1%、8·28%、 9.79%等。
[0044] 進(jìn)一步的，脫除銅離子反應(yīng)的溫度為10-20 °C，例如10.8 °C、11.6 °C、11.9 °C、12.0 °C、13.6°C、14.7°C、15.1°C、16.3°C、17.4°C、18.8°C、19.2°C 等;所述脫除銅離子反應(yīng)的攪 摔速度為 l〇〇_300r/min，例如 120r/min、130r/min、150r/min、190r/min、210r/min、260;r/ min、280r/min、290r/min等;所述脫除銅離子反應(yīng)的時(shí)間為60_120min，例如62min、71min、 77min、85min、94min、103min、106min、118min、119min 等；所述脫除銅離子反應(yīng)的結(jié)束后的 經(jīng)10000-15000r/min離心分離;所述脫除銅離子反應(yīng)洗滌步驟所用的液體為反應(yīng)時(shí)所用的 一元醇和水的混合物，洗滌后離心分離，重復(fù)洗滌步驟3次，離心后獲得脫除銅離子的漆酶。
[0045] 進(jìn)一步的，脫除銅離子的漆酶與表面功能化的碳納米管進(jìn)行固定時(shí)，將步驟(3)制 備獲得的銅離子鰲合修飾的碳納米管與脫除銅離子的漆酶所配置的溶液混合，在室溫條件 下攪拌，進(jìn)行漆酶固定化反應(yīng)，然后經(jīng)離心分離、洗滌后獲得碳納米管固定化漆酶。
[0046] 優(yōu)選的，脫除銅離子的漆酶所配置的溶液為步驟(3)獲得的脫除銅離子的漆酶分 散一元醇與水的混合物中，所述一元醇與水的混合物的組成與步驟(3)相同；漆酶混合液的 濃度為 0.2-0.6g/L，例如 0.21g/L、0.28g/L、0.32g/L、0.39g/L、0.42g/L、0.47g/L、0.49g/L、 0.54g/L、0.58g/L、0.59g/L等;脫除銅離子的漆酶所配置的溶液的pH值范圍為2-4，例如漆 酶混合液的 pH 值為2.3、2.4、2.6、2.8、2.9、3.1、3.2、3.5、3.7、3.8、3.9等，？田直的調(diào)節(jié)通過 添加無機(jī)酸或無機(jī)堿來完成。
[0047] 優(yōu)選地，進(jìn)一步的，脫除銅離子的漆酶與表面功能化的碳納米管進(jìn)行固定時(shí)，所述 銅離子鰲合修飾的碳納米管的添加量為l-l〇g/L，例如1.5g/L、1.9g/L、2 . lg/L、2.7g/L、 3·5g/L、4.3g/L、5·2g/L、6·9g/L、7·4g/L、8·8g/L、9·0g/L、9·9g/L等。
[0048] 優(yōu)選地，進(jìn)一步的，脫除銅離子的漆酶與表面功能化的碳納米管進(jìn)行固定時(shí)，所述 漆酶固化反應(yīng)的時(shí)間為30_60min，例如31min、33min、37min、42min、44min、46min、49min、 53miru 55miru 58miru 59mir^ 〇
[0049] 優(yōu)選地，進(jìn)一步的，脫除銅離子的漆酶與表面功能化的碳納米管進(jìn)行固定時(shí)，洗滌 所用洗滌液為PH3-4.5的緩沖液。本發(fā)明所述緩沖液均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的緩沖液， 其配制過程簡(jiǎn)單易操作，本發(fā)明中，選用何種緩沖液溶解漆酶，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)自 己掌握的專業(yè)知識(shí)和實(shí)際的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。
[0050] 本發(fā)明的碳納米管固定化漆酶可以用于生物檢測(cè)和電化學(xué)分析、生物燃料電池、 環(huán)境污染物的降解和染料脫色、有機(jī)合成、廢水處理等領(lǐng)域。
[0051] 本發(fā)明中的碳納米管為羧基化的碳納米管，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得的不同類型 的碳納米管均可用于本發(fā)明，例如單壁碳納米管，多壁碳納米管或雙壁碳納米管。同時(shí)，表 面羧基化的碳納米管的制備方法也有很多，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全有能力獲得表面羧基化的 碳納米管的制備方法，典型但非限制性的實(shí)例有:碳納米管在H2S04溶液中經(jīng)KMn04氧化而 制備。此外，表面羧基化的碳納米管也可以通過購(gòu)買商業(yè)化的產(chǎn)品獲得。
[0052] 優(yōu)選地，每克碳納米管的漆酶負(fù)載量為40-80mg，例如46mg/g、50mg/g、53mg/g、 6 lmg/g、68mg/g、73mg/g、78mg/g等。當(dāng)碳納米管的漆酶負(fù)載量小于40mg/g或大于80mg/g時(shí)， 固定化漆酶的酶活回收率低，催化能力顯著下降。尤其是碳納米管的漆酶負(fù)載量為55-65mg/g時(shí)，所制備得到的碳納米管固定化漆酶的酶活回收率較高。
[0053] 本發(fā)明所述碳納米管采用從中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司購(gòu)買的表面羧基 化的碳納米管。
[0054] 本發(fā)明所述的碳納米管固定化漆酶，通過金屬離子鰲和親和修飾的碳納米管與脫 除銅離子的漆酶活性中心的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了真正意義的直接電子傳遞，克服了漆酶蛋白質(zhì)外 殼對(duì)電子由活性中心到碳納米管的直接傳遞過程產(chǎn)生的屏蔽作用，解決了碳納米管固定化 漆酶催化過程中電子傳遞速率受限的問題，可提高固定化漆酶在生物檢測(cè)中的靈敏度，增 大固定化漆酶在生物燃料電池應(yīng)用中的電流密度。該碳納米管固定化漆酶制備工藝簡(jiǎn)單， 易于放大。碳納米管的漆酶負(fù)載量為55_65mg/g時(shí)，所制備得到的碳納米管固定化漆酶的酶 活回收率最高，效果更好。
[0055] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0056] (1)本發(fā)明提供的碳納米管固定化漆酶可以實(shí)現(xiàn)催化氧化過程中電子在漆酶活性 中心和碳納米管之間的直接傳遞，解除了漆酶蛋白質(zhì)外殼對(duì)電子直接傳遞過程產(chǎn)生的屏蔽 作用；
[0057] (2)本發(fā)明提供的碳納米管固定化漆酶可提高固定化漆酶在生物檢測(cè)中的靈敏 度，增大固定化漆酶在生物燃料電池應(yīng)用中的電流密度，將酚類測(cè)定時(shí)的最低檢測(cè)限降低 85%~96%，在生物燃料電池應(yīng)用中的電流密度提高80%~120%。
[0058] (3)本發(fā)明提供的漆酶脫除銅離子及活性中心定向固定化的方法，可以用于其他 銅離子螯合載體的漆酶固定化，具有很好的應(yīng)用前景；
[0059] (4)本發(fā)明提供的碳納米管固定化漆酶的制備工藝簡(jiǎn)單，易于放大。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0061 ] 實(shí)施例1
[0062] (1)在室溫(約25°C)條件下，將2g鹵代琥珀酰亞胺溶于20g丙酮，將0.4g碳酸鉀、lg 焦亞硫酸鉀、2g羧基化碳納米管在20g水中充分混合至無機(jī)鹽完全溶解，將丙酮溶液與水溶 液混合，20°C，300r/min攪拌20min，加入160g氯仿-水的混合物(2:1，v/v)進(jìn)行萃取分離，靜 置分層后取有機(jī)相層，用有機(jī)相層體積1/2的去離子水將有機(jī)相洗滌3次，洗滌過的有機(jī)相 層30°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，即獲得琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管；
[0063] (2)在30°C、100r/min條件下，在裝有回流裝置的反應(yīng)器中，加入2g N，N-二(羧基 甲基)-L-賴氨酸水合物、4g三乙胺和40g二甲基甲酰胺，加熱回流120min，在30°C、300r/min 條件下，將6g琥珀酰亞胺基接枝的碳納米管加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)3h，將反應(yīng)液15000r/min 離心，沉淀用5倍沉淀物體積的二甲基甲酰胺洗滌3次，放入30°C真空干燥箱干燥即得表面 氨基三乙酸功能化的碳納米管；
[0064] (3)將步驟(2)獲得的表面氨基三乙酸功能化的碳納米管加入到6% (w/v)的氯化 銅溶液中，