2)膠體金標(biāo)記頭孢噻呋單克隆抗體的制備 調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8.0，用恒速攪拌器均勻攪拌，同時(shí)逐滴加入頭孢噻呋單克隆抗 體，1小時(shí)后加入抗體量相當(dāng)?shù)腜EG，充分反應(yīng)30分鐘后加入抗體量相當(dāng)?shù)腂SA，加完后，繼續(xù) 攪拌30分鐘。在9000rpm下離心30分鐘，獲得均一性的金標(biāo)抗體沉淀，再加 PNPB重懸備用， 得到膠體金標(biāo)記頭孢噻呋單克隆抗體。
[0035] (3)膠體金檢測裝置的制備 在硝酸纖維素膜上噴涂頭孢噻呋免疫抗原溶液形成檢測線T線，采用噴涂兔抗鼠 IgG形 成控制線T線。所述檢測線和控制線相互平行，兩者距離0.5cm。
[0036]然后，在底板上，沿同一方向依次將樣品墊、噴涂有頭孢噻呋免疫抗原的檢測線T 線和噴涂有兔抗鼠 IgG的控制線Τ線的硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接粘連，其中，檢測線 靠近樣品墊，所述控制線靠近吸水紙，將粘好的所述檢測試紙切成等寬度的試紙條;反應(yīng)杯 內(nèi)加入膠體金標(biāo)記頭孢噻呋單克隆抗體，凍干;將所述反應(yīng)杯及試紙條密封干燥保存。 [0037] 實(shí)施例5 樣品中頭孢噻呋的檢測，方法為： 取新鮮雞組織樣品絞碎，頭孢噻呋殘留經(jīng)乙腈和丙酮提取，正己烷除脂肪，取樣置于反 應(yīng)杯中，室溫孵育10分鐘，隨后插入試紙條，室溫孵育3分鐘。取出試紙條，輕輕刮除試海綿 墊，進(jìn)行結(jié)果判讀。若T線與C線同時(shí)顯示紫紅色條帶，則結(jié)果為陰性;若T線顏色比C線淺或C 線顯色而T線不顯色，則結(jié)果為陽性;若C線、T線均不顯色，則檢測裝置已失效。
[0038] 實(shí)施例6 頭孢噻呋膠體金檢測裝置的靈敏度檢測。
[0039]通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中頭孢噻呋膠體金檢測裝置的靈敏度可達(dá)0.5ppm，CV 值小于15%。
[0040] 實(shí)施例7 頭孢噻呋膠體金檢測裝置的特異性實(shí)驗(yàn)。
[0041] 在陰性的魚肉組織中，分別加入頭孢噻呋0.5ppm，四環(huán)素、青霉素、頭孢匹林、紅霉 素、林可霉素、泰樂菌素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、磺胺二甲嘧啶各20ppm，按實(shí)施例5的 操作步驟進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)本裝置對頭孢噻呋有優(yōu)異的選擇性，與以上添加藥物無交叉反應(yīng)。
[0042] 實(shí)施例8 頭孢噻呋膠體金檢測裝置的保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)。
[0043]用三批常規(guī)生產(chǎn)的產(chǎn)品分別做保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)，放置于室內(nèi)室溫環(huán)境保持，每隔1個(gè)月 取12個(gè)裝置，用質(zhì)控樣本檢測，分別做陰性，分別為0.25ppm，0.5ppm和lppm濃度的樣品，重 復(fù)三次，觀察數(shù)據(jù)變化，考察保質(zhì)期時(shí)間。陰性顯色從14個(gè)月開始下降，在1年時(shí)間內(nèi)產(chǎn)品品 質(zhì)無明顯變化，因此確定保質(zhì)期為1年。
[0044]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種頭抱嚷巧半抗原，其特征在于:其具有式(I)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的頭抱嚷巧半抗原，其特征在于，采用W下步驟制備得到： 步驟SI:將頭抱嚷巧鋼溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下攬拌10~120分鐘，其 中，所述冰乙酸的摩爾量是頭抱嚷巧鋼摩爾量的1~3倍;再加入水，用二氯甲燒萃取，旋干 有機(jī)相，得到淡粉紅色固體； 步驟S2:取步驟Sl中得到的淡粉紅色固體溶于DMF中，加入碳酸鐘及漠丙酸，35~45°C 下反應(yīng)2~8小時(shí)，采用二氯甲燒萃取過柱提純得所述頭抱嚷巧半抗原。3. -種頭抱嚷巧免疫抗原，其特征在于:采用權(quán)利要求1或2所述的頭抱嚷巧半抗原制 備得到，將所述頭抱嚷巧半抗原與DCC、NHS混合，于4°C下攬拌，離屯、后取上清液;將人血清 蛋白溶于抑值為8.0的PBS溶液中，加入DMF后攬拌，然后將所述上清液逐漸加入其中，4 °C下 反應(yīng)6~2地，離屯、后，取上清液，透析純化，得到所述頭抱嚷巧免疫抗原。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的頭抱嚷巧免疫抗原，其特征在于:所述透析純化時(shí)，在4 °C下用 生理鹽水透析3天，每天更換3次透析液。5. -種頭抱嚷巧單克隆抗體，其特征在于:采用權(quán)利要求3或4所述的頭抱嚷巧免疫抗 原與免疫Balb/c小鼠經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌頭抱嚷巧單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，用獲 得的雜交瘤細(xì)胞采用體內(nèi)誘生腹水法制備得到頭抱嚷巧單克隆抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的頭抱嚷巧單克隆抗體，其特征在于:所述體內(nèi)誘生腹水法的步 驟為：對小鼠腹腔注射液體石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射所述雜交瘤細(xì)胞3~5 X IO6/ 只，10天后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)收集腹水，用正辛酸-硫酸錠沉淀法來純化腹水得到所 述頭抱嚷巧單克隆抗體。7. -種頭抱嚷巧膠體金檢測裝置，其特征在于:包括反應(yīng)杯和檢測試紙，所述檢測試紙 包括底板，W及底板上依次鋪設(shè)的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙;所述反應(yīng)杯里含有膠體 金標(biāo)記的如權(quán)利要求5所述的頭抱嚷巧單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和控 制線，所述檢測線為采用權(quán)利要求3或4所述的頭抱嚷巧免疫抗原在硝酸纖維素膜上進(jìn)行噴 涂制得。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的頭抱嚷巧膠體金檢測裝置，其特征在于:所述控制線為采用兔 抗鼠 IgG進(jìn)行噴涂制得，所述檢測線和控制線相互平行。9. 權(quán)利要求7或8所述的頭抱嚷巧膠體金檢測裝置的制備方法，其特征在于，其包括W 下步驟： 步驟A:將頭抱嚷巧鋼溶解于甲醇中，加入冰乙酸，于20~30°C下攬拌10~120分鐘，其 中，所述冰乙酸的摩爾量是頭抱嚷巧鋼摩爾量的I~3倍;再加入水，二氯甲燒萃取，旋干有 機(jī)相，得到淡粉紅色固體;將淡粉紅色固體溶于DMF中，加入碳酸鐘及漠丙酸，35~45°C下反 應(yīng)2~8小時(shí)，采用二氯甲燒萃取過柱提純得所述頭抱嚷巧半抗原;利用碳二亞胺法將所述 頭抱嚷巧半抗原與載體人血清蛋白偶聯(lián)，制備得到頭抱嚷巧免疫抗原； 步驟B:將所述頭抱嚷巧免疫抗原與免疫Balb/c小鼠經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌頭抱嚷 巧單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，用獲得的細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水，純化后獲得頭抱嚷巧單克 隆抗體； 步驟C:用巧樣酸=鋼與氯金酸反應(yīng)制備膠體金;將膠體金與所述頭抱嚷巧單克隆抗體 混合形成金標(biāo)抗體，離屯、復(fù)溶后得到膠體金標(biāo)記的頭抱嚷巧單克隆抗體； 步驟D:將步驟C得到的膠體金標(biāo)記的頭抱嚷巧單克隆抗體分裝至反應(yīng)杯中，低溫干燥； 將所述頭抱嚷巧免疫抗原在硝酸纖維素膜上進(jìn)行噴涂制得檢測線，將兔抗鼠 IgG在硝酸纖 維素膜上進(jìn)行噴涂制得控制線； 步驟E:沿同一方向依次在底板上鋪設(shè)樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙并粘附在底板 上，組裝得到所述檢測試紙。10.權(quán)利要求9所述的頭抱嚷巧膠體金檢測裝置的制備方法，其特征在于:還包括將粘 好的所述檢測試紙切成等寬度的試紙條，將所述反應(yīng)杯及試紙條密封干燥保存。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種頭孢噻呋半抗原及其膠體金檢測裝置及其制備方法，所述頭孢噻呋半抗原，為具有式（1）所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，特異性強(qiáng)，檢測靈敏度高，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，能更加快速、簡便地檢測頭孢噻呋殘留；不需要任何儀器設(shè)備，便于攜帶；試紙條使用簡單，無需專業(yè)人士操作；試紙制作容易，成本低廉，滿足了食品安全檢測中對頭孢噻呋殘留量檢測需求。
【IPC分類】C07K1/107, C07K14/765, C07K16/44, G01N33/558, G01N33/94, G01N33/532, C07D501/36, C07D501/04
【公開號(hào)】CN105646536
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】嚴(yán)義勇, 朱海, 付輝, 李細(xì)清, 畢思遠(yuǎn), 汪鳳林
【申請人】深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月29日