S溶液中，加入DMF后攪 拌，然后將所述上清液逐漸加入其中，4°C下反應(yīng)12h，離心后，取上清液，透析純化，得到所 述頭孢噻呋免疫抗原。
[0017] 步驟B:將所述頭孢噻呋免疫抗原與免疫Balb/c小鼠經(jīng)細胞融合，篩選得到分泌頭 孢噻呋單克隆抗體的雜交瘤細胞，用獲得的細胞誘導小鼠產(chǎn)生腹水，純化后獲得頭孢噻呋 單克隆抗體； 步驟C:用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金;將膠體金與所述頭孢噻呋單克隆抗體 混合形成金標抗體，離心復(fù)溶后得到膠體金標記的頭孢噻呋單克隆抗體； 步驟D:將步驟C得到的膠體金標記的頭孢噻呋單克隆抗體分裝至反應(yīng)杯中，低溫干燥； 將所述頭孢噻呋免疫抗原在硝酸纖維素膜上進行噴涂制得檢測線，將兔抗鼠 IgG在硝酸纖 維素膜上進行噴涂制得控制線； 步驟E:沿同一方向依次鋪設(shè)的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙并粘附在底板上，組裝 得到所述檢測試紙。
[0018] 優(yōu)選的，所述頭孢噻咲免疫抗原的制備方法為:取頭孢噻咲半抗原0. lmmol溶于 2mL DMF(二甲基甲酰胺）中，攪拌加入27.5mg DCC和HjmgNHS^C下磁力攪拌反應(yīng)過夜， 離心后上清液A液，稱取人血清蛋白（HSA)140mg溶于10mL濃度O.lmol/L的pH為8.0的PBS (磷酸鹽緩沖液）中。加入DMF lmL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴B液中，4°C下 反應(yīng)12h。離心后，取上清液，4°C下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液，將得到的所述 頭孢噻咲免疫抗原以lmg/mL的濃度分裝于0.5mL離心管中，凍存于-20°C冰箱中備用。
[0019] 其中，優(yōu)選的，所述膠體金的制備方法優(yōu)選為:取1%(質(zhì)量百分比)氯金酸溶液lml， 加99ml超純水成終濃度0.01%(質(zhì)量百分比）的氯金酸溶液，加熱沸騰后，取1%(質(zhì)量百分比） 檸檬酸三鈉1.6ml-次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，繼續(xù)加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍 黑色最終變?yōu)榱良t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min，室溫冷卻，補充失水至原體積。
[0020] 優(yōu)選的，所述膠體金標記的頭孢噻呋單克隆抗體制備步驟優(yōu)選為：調(diào)節(jié)膠體金溶 液pH值至8.0，用恒速攪拌器均勻攪拌，同時逐滴加入頭孢噻呋的單克隆抗體，1小時后加入 抗體量相當?shù)腜EG，充分反應(yīng)30分鐘后加入抗體量相當?shù)腂SA，加完后，繼續(xù)攪拌30分鐘。在 9000rpm下離心30分鐘獲得均一性金標抗體沉淀，再加 PNPB重懸得到膠體金標記的頭孢噻 咲單克隆抗體。
[0021] 作為本發(fā)明的進一步改進，還包括將粘好的所述檢測試紙切成等寬度的試紙條， 將所述反應(yīng)杯及試紙條密封干燥保存。
[0022] 本發(fā)明檢測原理是利用樣品墊形成的毛細管虹吸效應(yīng)，使被檢測物質(zhì)首先與膠體 金標記的頭孢噻呋單抗發(fā)生競爭形式的結(jié)合，其結(jié)果是，當膠體金標記的頭孢噻呋單克隆 抗體過量時，多余的頭孢噻呋單克隆抗體泳動到檢測線，與頭孢噻呋免疫抗原結(jié)合并顯色； 而與檢測物結(jié)合的膠體金標記的頭孢噻呋多抗，其V區(qū)結(jié)合位點被檢測物質(zhì)占據(jù)，只能跨越 檢測線泳動到質(zhì)控線以C區(qū)位點與兔抗鼠 IgG抗體非特異性結(jié)合，同檢測線進行比色而得 到檢測結(jié)果。
[0023]本發(fā)明的有益效果： 第一，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，特異性強，檢測靈敏度高，靈敏度可達〇. 5ppm，CV值小于 15%，準確性高，重復(fù)性好，能更加快速、靈敏、簡便地檢測頭孢噻呋殘留。
[0024]第二，采用本發(fā)明技術(shù)方案的頭孢噻呋膠體金檢驗裝置，不需要任何儀器設(shè)備，便 于攜帶，檢測成本低;試紙條使用簡單，無需專業(yè)人士操作;試紙制作容易，成本低廉，儲存 方便，穩(wěn)定性好，在室溫下至少可以保存六個月。
[0025]第三，本發(fā)明的技術(shù)方案的膠體金檢測裝置，應(yīng)用層析式免疫膠體金原理，通過檢 測試紙中的檢測線與質(zhì)控線線比色，來半定量檢測樣品中的頭孢噻呋殘留量，在短時間內(nèi) 快速準確地檢測出樣品是否含有頭孢噻呋，以確定頭孢噻呋是否超標，能夠滿足食品安全 對頭孢噻呋殘留量檢測需求，適用于屠宰企業(yè)及政府檢測機構(gòu)。
【附圖說明】
[0026] 圖1是本發(fā)明一種實施例頭孢噻呋半抗原的MASS譜圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進一步的詳細說明。： 實施例1 頭孢噻呋半抗原的制備，采用以下步驟制備： 步驟S1:將0.1 mM頭孢噻呋鈉置于甲醇中溶解，加入1~3倍頭孢噻呋鈉摩爾量的冰乙 酸，于室溫下攪拌30分鐘;加入水，用二氯甲烷萃取;旋干有機相，得到淡粉紅色固體。
[0028] 步驟S2:取步驟S1中得到的淡粉紅色固體溶于DMF中，加入碳酸鉀及溴丙酸，于40 °C反應(yīng)2-8小時，采用二氯甲烷萃取過柱提純得所述頭孢噻呋半抗原。
[0029] 對得到的所述頭孢噻呋半抗原經(jīng)過測試，MASS[M+H]峰值為596.4，如圖1所示；其 熔點為249度。
[0030] 實施例2 利用頭孢噻呋半抗原制備頭孢噻呋免疫抗原，采用以下步驟： 取頭孢噻咲半抗原O.lmmol溶于2mL的DMF中，攪拌加入27.5mg DCC和14.4mg NHSJ °C下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清液為A液，稱取人血清蛋白（KLH) 140mg溶于10mL濃度 為0. lmol/L的pH為8.0的PBS中。加入DMF lmL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入 B液中，4 °C下反應(yīng)12h。離心后，取上清液，4 °C下用生理鹽水透析3天，每天更換3次透析液。 得到的全抗原以lmg/mL的濃度分裝于0.5mL離心管中，凍存于-20°C冰箱中。
[0031] 實施例3 利用頭孢噻呋免疫抗原制備頭孢噻呋單克隆抗體，采用以下步驟： 使用頭孢噻呋免疫抗原并鑒定后免疫4只6周齡昆明小鼠，加強免疫三次后，采血測效 價，待血清效價不再上升，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天后脫頸致死小鼠，在 無菌條件下取脾臟制備脾細胞，與生長旺盛的小鼠骨髓瘤細胞按8:1的比例混合于50mL的 離心管中，加入30mL的無血清IPMI1640培養(yǎng)基，1100r/min離心5分鐘棄上清，將細胞團輕輕 振松，置于37°C水浴中；把lmL的體積濃度為50%的PEG-4000緩緩加入細胞中，在1分鐘內(nèi)滴 完，同時輕輕攪動底部沉淀，靜置1分鐘后，前30秒沿管壁緩慢勻速加入無血清培養(yǎng)基lmL， 后30秒加入2mL，然后快速加入27mL終止融合過程，1100r/min離心5分鐘，棄上清，用HAT選 擇性培養(yǎng)基重懸后加到已鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，37攝氏度、體積百分比5%的 C02條件下培養(yǎng)。7天后換成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細胞數(shù)量達到300個以上時，用間接 ELISA法篩選，選擇強陽性、抑制效果好、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，經(jīng)3次以 上的克隆培養(yǎng)和檢測，均呈陽性的孔內(nèi)細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤 細胞擴大培養(yǎng)以備單克隆抗體的制備。
[0032] 然后，采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)頭孢噻呋單克隆抗體。具體步驟為:選4只經(jīng)產(chǎn)昆 明小鼠，腹腔注射液體石蠟油〇.5mL/只，7天后腹腔注射雜交瘤細胞3~5 X106/只，10天 后，待小鼠腹部明顯膨大時收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水，得到頭孢噻呋 單克隆抗體，經(jīng)紫外測定頭孢噻呋單克隆抗體的含量。
[0033] 實施例4 頭孢噻呋膠體金檢測裝置的制備，包括以下步驟： (1)膠體金的制備 取1%(質(zhì)量百分比）氯金酸溶液lml，加99ml超純水成終濃度0.01%(質(zhì)量百分比）的氯金 酸溶液，加熱沸騰后，取1%(質(zhì)量百分比）檸檬酸三鈉1.6ml-次性迅速加入煮沸的氯金酸溶 液中，繼續(xù)加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍黑色最終變?yōu)榱良t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min，室 溫冷卻，補充失水至原體積。
[0034] (