本發(fā)明涉及納米銀涂覆的聚乙二醇和明膠水凝膠浸漬的聚氨酯納米纖維材料，更具體地，本發(fā)明涉及納米銀涂覆和聚乙二醇和明膠水凝膠浸漬的聚氨酯納米纖維網(wǎng)膜，其主要應(yīng)用于腹疝修復(fù)。

背景技術(shù)：

腹疝是最常見的腹部外科疾病之一。手術(shù)干預(yù)是最佳的選擇。在大多數(shù)情況下通過放置假體材料例如聚合物網(wǎng)膜來追求無張力修復(fù)。由于相對便宜并且容易處理以及能很好地摻入組織中等優(yōu)點，聚丙烯(PP)網(wǎng)膜可能是最廣泛地用于腹疝修復(fù)的網(wǎng)膜材料(參見，例如L.Procter,E.E.Falco,J.P.Fisher和J.S.Roth,Studies in Mechanobiology Tissue Engineering&Biomaterials,2009,425-447；C.MJ,Journal of Biomedical Materials Research Part B Applied Biomaterials,2010,94,455–462；以及Y.Bilsel和I.Abci,International Journal of Surgery,2012,10,317-321)。然而，這些假體材料的使用通常會引起并發(fā)癥，例如致密的纖維組織沉積，慢性局部組織的炎癥反應(yīng)，瘺的形成，并且主要還引起內(nèi)臟和網(wǎng)膜之間的粘連(L.J.Deguzman,L.M.Nyhus,G.Yared和S.PK.,Endoscopy,1995,27,459-461；和G.J.Morrisstiff和L.E.Hughes,J.Am.Coll.Surg.,1998,186,352-367)。這些并發(fā)癥可能導(dǎo)致例如不適感，慢性疼痛和疝的復(fù)發(fā)等問題。此外，其還表現(xiàn)出相當(dāng)多的其他臨床問題和成本問題。這種植入手術(shù)的另一嚴重并發(fā)癥是由材料表面上的細菌引發(fā)的感染。感染通常導(dǎo)致修復(fù)材料的植入失敗。在臨床上，腹疝修復(fù)補片所引發(fā)的感染和組織粘連已經(jīng)嚴重阻礙了腹疝修復(fù)補片的發(fā)展。

因此，臨床上仍然需要效果更好的腹疝修復(fù)補片，其能夠同時避免在臨床使用時所引起的感染和組織粘連，在植入后很好地整合到生物體內(nèi)，并且對患者沒有任何其他不利的影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了同時解決以上兩個問題并提供一種在臨床上有效的腹疝修復(fù)補片，本發(fā)明人開發(fā)了一種納米銀涂覆的，聚乙二醇(PEG)或其酯和明膠水凝膠浸漬的聚氨酯(NSPU)網(wǎng)膜。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，納米銀可以賦予網(wǎng)膜抗菌性能，其破壞微生物的DNA復(fù)制、電子傳遞和呼吸細胞色素，具有有效的抗酵母、真菌和多種細菌和病毒的能力。同時浸漬的PEG和明膠水凝膠具有良好的生物相容性并降低內(nèi)臟粘連的形成，同時增強修復(fù)補片的生物相容性。PU網(wǎng)膜能夠提供腹疝修復(fù)所需要的機械支撐。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的材料能夠被有效地整合，形成能夠同時解決感染和組織粘連問題的有前途的腹疝修復(fù)補片，即本發(fā)明的NSPU網(wǎng)膜。這種補片在植入后很好地整合到生物體內(nèi)，并且對患者沒有任何其他不利的影響。

因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種聚氨酯補片，其浸漬有聚乙二醇或其酯和明膠水凝膠，并且所述聚氨酯補片的表面涂覆有納米銀。

在一個實施方案中，該聚氨酯補片可以是由聚氨酯納米纖維形成的網(wǎng)膜。該聚氨酯納米纖維網(wǎng)膜可采用電紡方法來制備。

在一個實施方案中，聚氨酯補片可包括聚氨酯內(nèi)層，所述聚氨酯內(nèi)層浸漬有聚乙二醇或其酯；以及聚氨酯外層，所述聚氨酯外層浸漬有明膠水凝膠。該聚氨酯補片中的聚氨酯內(nèi)層和聚氨酯外層可以是聚氨酯納米纖維形成的網(wǎng)膜。在該聚氨酯補片中，明膠可以是甲基丙烯酸酯化的明膠。并且，如果使用聚乙二醇酯，該聚乙二醇酯可以是聚(乙二醇)二丙烯酸酯。在本發(fā)明的實施方案中，浸漬有聚乙二醇或其酯的聚氨酯內(nèi)層可作為聚氨酯補片的內(nèi)層，以防止組織粘連，并且浸漬有明膠水凝膠的聚氨酯外層作為聚氨酯補片的外層，以用于使組織和網(wǎng)格的更好地整合。

在一個實施方案中，本發(fā)明的聚氨酯的表面還涂布有多巴胺。

在本發(fā)明中，聚氨酯補片可作為用于疝修復(fù)的網(wǎng)膜。優(yōu)選地，其主要應(yīng)用于腹疝的修復(fù)。

在用于疝修復(fù)時，本發(fā)明的聚氨酯可以根據(jù)疝的形狀和位置制成特定的大小和厚度。通常，本發(fā)明的聚氨酯厚度約為40μm～600μm，例如50μm～400μm，如約100μm，但不限于此。

在本發(fā)明中，納米銀可具有10-100nm的尺寸。

本發(fā)明的另一方面涉及制備上述聚氨酯補片的方法，該方法包括：

(a)提供聚氨酯內(nèi)層，并將聚氨酯內(nèi)層浸漬于聚(乙二醇)或其酯的溶液中；

(b)提供聚氨酯外層，并將聚氨酯外層浸漬于明膠的溶液中；

(c)將聚氨酯內(nèi)層與聚氨酯外層粘合在一起，以獲得聚氨酯補片，

(d)將納米銀涂覆在所述聚氨酯補片的表面上。

在本發(fā)明的方法中，在步驟(c)中可加入聚合引發(fā)劑以催化明膠與聚(乙二醇)或其酯膠凝，從而將聚氨酯內(nèi)層與聚氨酯外層粘合在一起。該聚合引發(fā)劑可以是能夠使明膠與聚(乙二醇)或其酯膠凝的任何催化劑。在一個實施方案中，該聚合引發(fā)劑是過硫酸銨和N,N,N',N'-四甲基乙烷二胺。

在可選的實施方案中，可以在聚(乙二醇)或其酯的溶液中加入第一聚合引發(fā)劑，并且在明膠的溶液中加入第二聚合引發(fā)劑。該第一聚合引發(fā)劑和第二聚合引發(fā)劑能夠催化明膠與聚(乙二醇)或其酯膠凝，從而將聚氨酯內(nèi)層與聚氨酯外層粘合在一起。該第一聚合引發(fā)劑和第二聚合引發(fā)劑可以是能夠使明膠與聚(乙二醇)或其酯膠凝的任何催化劑。例如，第一聚合引發(fā)劑可以是N,N,N',N'-四甲基乙烷二胺，并且第二聚合引發(fā)劑可以是過硫酸銨；或者第一聚合引發(fā)劑可以是過硫酸銨，并且第二聚合引發(fā)劑可以是N,N,N',N'-四甲基乙烷二胺。

在本申請中，優(yōu)選采用原位還原的方法將納米銀涂覆在所述聚氨酯補片的表面上。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的發(fā)明人采用多巴胺原位還原銀離子，進而將納米銀涂覆在所述聚氨酯補片的表面上。具體來說，在本申請的方法的步驟(d)中，通過將聚氨酯補片浸泡在多巴胺溶液中，然后在將其浸泡于含有銀離子(例如AgNO₃)的溶液中，以在所述聚氨酯補片的表面形成涂覆的納米銀。在一個實施方案中，聚氨酯補片浸泡在多巴胺溶液中持續(xù)2-20個小時，例如12小時。多巴胺溶液的濃度可為0.1-10mg/ml，如2mg/ml。在一個實施方案中，在含有銀離子的溶液中浸泡2-30個小時，如16小時。銀離子溶液的濃度可為0.1-10mg/ml，如1mg/ml。

采用這種方法，能夠以溫和的條件將納米銀均勻穩(wěn)定地涂覆在聚氨酯補片的表面上，因此這種方法是成本有效的。此外，由于多巴胺本身也是生物相容性的還原劑，因此由此處理的聚氨酯補片在疝修復(fù)時仍然保持良好地生物相容性，不會對周圍的組織和器官產(chǎn)生任何不利地影響。

在本發(fā)明的方法中，也可以采用多種其他方法將納米銀涂覆在所述聚氨酯補片的表面上。例如，納米銀可通過浸漬、旋涂、噴灑或噴涂等方法涂布在所述聚氨酯補片的表面上。

附圖說明

圖1是聚氨酯(PU)納米纖維網(wǎng)膜/水凝膠/納米銀涂層的組裝方法以及應(yīng)用于疝模型的網(wǎng)膜復(fù)合物的示意圖。

圖2是現(xiàn)有技術(shù)聚丙烯(PP)補片和本申請的聚氨酯(NSPU)網(wǎng)膜的示意圖，其中(A)是用于腹疝的臨床使用的聚丙烯(PP)補片，并且(B)是本發(fā)明的納米銀涂覆的、聚乙二醇(PEG)/明膠水凝膠浸漬的聚氨酯(NSPU)網(wǎng)膜。

圖3是網(wǎng)膜的SEM圖像：a.表面上無任何涂層的PU電紡絲纖維的SEM圖像；b.凝膠組裝后無多巴胺和納米銀涂層的PU網(wǎng)膜的SEM圖像；c.僅具有多巴胺涂層的PU網(wǎng)膜；d.PU凝膠復(fù)合物(橫截面)；e.具有納米銀涂層的PU網(wǎng)膜，顆粒是納米銀顆粒；F.INCA測試示出涂覆在PU網(wǎng)膜表面上的納米銀。

圖4是在PP(A和C)和NSPU(B和D)網(wǎng)膜表面上粘附的細菌金黃色葡萄球菌(A和B)和大腸桿菌(C和D)的掃描電子顯微照片。

圖5是NSPU和PP網(wǎng)膜表面上粘附的細菌密度的圖示。其中，值表示為平均值±SD。*P<0.05。

圖6是手術(shù)安置PP和NSPU之后的外觀照片。(A)和(B)顯示手術(shù)安置PP之后(A)和4周后(B)大鼠腹壁缺損的照片，(C)顯示手術(shù)安置PP的4周后從內(nèi)臟側(cè)觀察的修復(fù)部位處腹腔粘連情況(網(wǎng)膜粘連，由箭頭示出)；(D)和(E)顯示手術(shù)安置NSPU之后(D)和4周后(E)大鼠腹壁缺損的照片，(F)顯示手術(shù)安置NSPU的4周后從內(nèi)臟側(cè)觀察的修復(fù)部位處腹腔粘連情況(無粘連)。

圖7是在植入4周后根據(jù)H&E染色的PP(A)和NSPU(B)的代表性植入部分的圖像。植入纖維用“×”標記。異物巨細胞通過箭頭標記。成纖維細胞的摻入或膠原的沉積用“*”標記。

圖8是在手術(shù)后4周的試驗制品中的CD3、CCR7和CD163的免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像。

圖9是在4周時量化PP和NSPU中的CD3、CCR7和CD163陽性細胞的組織形態(tài)學(xué)分析的示意圖。值表示為平均值±SD。NS，不顯著，*P<0.05。

圖10是來自植入NSPH網(wǎng)膜的大鼠的H+E染色的切片的圖像。A：腦，B：腎，C：肝，D：心臟，E：脾臟，以及F：睪丸。所有切片均未觀察到任何異常。

具體實施方式

以下將結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明所述的聚氨酯補片及其制備方法做進一步的說明。

現(xiàn)參照圖1和圖2。圖1示出了本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案的制備流程圖。該優(yōu)選實施方案構(gòu)建了聚氨酯網(wǎng)膜的雙功能表面，其具有抗感染的納米銀，并浸漬有PEG/明膠水凝膠以防止粘連。如圖1和圖2所示，與直接使用PU網(wǎng)膜相反，申請人將兩個PU網(wǎng)膜分別浸入明膠-MA和PEGda凝膠的溶液中，然后通過應(yīng)用使明膠-MA-PEGda交聯(lián)的膠凝工藝而使這兩個PU網(wǎng)膜組裝在一起。明膠-MA和PEGda凝膠均具有良好的生物相容性，PEG在內(nèi)側(cè)以用于防粘連，而明膠-MA在外側(cè)以用于宿主組織和網(wǎng)膜的整合。然后，將組裝的PU網(wǎng)膜浸入多巴胺溶液，隨后在將其浸入硝酸銀溶液中，以實現(xiàn)在PU網(wǎng)膜的表面上原位形成納米銀。實驗表明，這種PU網(wǎng)膜同時實現(xiàn)了抗微生物性、生物相容性和組織整合性，同時避免了組織粘連的形成，可有效用于腹疝修復(fù)術(shù)。

實施例

實驗材料：

二甲基甲酰胺(DMF)，明膠(產(chǎn)品編號42043)，甲基丙烯酸酸酐(MA)，聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGda，M_w＝780)，過硫酸銨(APS)，N,N,N',N'-四甲基乙烷二胺(TEMED)，多巴胺和AgNO₃均購自Sigma-Aldrich。所有的化學(xué)品并未進行進一步純化。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)購自BeyotimeBiotechnology Inc(China)。聚氨酯(M_w約50萬，醫(yī)用)購自SKC Korea。大腸桿菌DH5(ATCC#：6538)和金黃色葡萄球菌(ATTC#：25923)均得自第三軍醫(yī)大學(xué)的微生物系。PP網(wǎng)膜(市售，SurgiproTM單絲聚丙烯網(wǎng)片疝氣補片SPMM-35，美國柯惠醫(yī)療公司(Covidien)產(chǎn)品)。

實施例1：PU納米纖維網(wǎng)膜的制備

首先，將750mg聚氨酯(PU)溶解在5ml的DMF中。溶解后，將溶液置于安裝有注射泵(PH 2000Infusion)的10ml注射器中。然后來自高壓(20KV)電源(GAMMA，High Voltage Research)的正極鉛經(jīng)由鱷魚夾連接至針。在另一側(cè)，使用一塊15*15cm的不銹鋼網(wǎng)膜來收集聚氨酯納米纖維。從針到網(wǎng)膜的距離為15cm。鐵紗布接地以保證安全。PU溶液的泵率設(shè)為1ml/h。

實施例2：甲基丙烯酸酯化的明膠的制備(MA-G)

將1g明膠在50℃下溶解于10ml的PBS溶液中；然后，將1ml的甲基丙烯酸酸酐添加至明膠溶液中，并在50℃下在攪拌下反應(yīng)1小時。然后通過用雙蒸水透析3天并凍干，得到產(chǎn)物MA-G。

實施例3：納米銀涂覆的，水凝膠浸漬的聚氨酯網(wǎng)膜的制備

一個3*3cm的厚度50μm的PU膜浸漬于100μl MA-明膠(50mg/ml)和4μl的APS(200mg/ml)的溶液中，持續(xù)15秒，另一個PU膜浸漬于100μl的PEGda(200mg/ml)和0.5μ1的TEMED的溶液中，持續(xù)15秒。然后，將一片PU納米網(wǎng)膜疊置在另一片上；PEGda和MA-明膠在APS和TEMED的催化下膠凝，將兩種PU網(wǎng)膜膠粘在一起。然后，將PU網(wǎng)膜浸漬于多巴胺溶液(在10mM的Tris中的2mg/ml，pH 8.5)中，持續(xù)12小時。最后，將網(wǎng)膜再在AgNO₃溶液(1mg/ml)中浸漬16小時，以得到本發(fā)明的納米銀涂覆的，聚乙二醇(PEG)酯和明膠水凝膠浸漬的聚氨酯(NSPU)網(wǎng)膜。在用于腹疝修復(fù)的體內(nèi)試驗中，將網(wǎng)膜的PEG側(cè)用作內(nèi)側(cè)，明膠側(cè)用作外側(cè)。

實施例4：網(wǎng)膜的SEM表面表征

通過使用JEOL-5900掃描電子顯微鏡觀察了以下樣品：a.實施例1制備的PU電紡絲纖維；b.實施例3的制備過程中凝膠組裝后無多巴胺和納米銀涂層的PU網(wǎng)膜；c.實施例3的制備過程中僅具有多巴胺涂層的PU網(wǎng)膜；d.實施例3的制備過程中膠凝后的PU凝膠復(fù)合物(橫截面)；e.實施例3制備的NSPU網(wǎng)膜，其中顆粒是納米銀顆粒。為了制備用于SEM觀察的樣品，對于用于SEM觀察的網(wǎng)膜都用金涂覆以使樣品導(dǎo)電。

在圖3中，(a)顯示PU電紡絲纖維的SEM圖像，這些PU電紡絲纖維使得PU網(wǎng)膜成為用于涂覆的多孔膜。(b)顯示在用水凝膠進行組裝之后，得到水凝膠浸漬的聚氨酯網(wǎng)膜。(d)顯示本發(fā)明的PU-凝膠復(fù)合物緊緊組裝在一起。(c)示出了僅涂覆有多巴胺的水凝膠浸漬的聚氨酯網(wǎng)膜，涂覆的多巴胺用于銀離子的還原，然后納米銀可以形成在網(wǎng)膜表面上，如(e)所示。(f)也同樣表明銀納米顆粒已經(jīng)被均勻涂覆在網(wǎng)膜表面上。

實施例5：細胞粘附實驗

細菌感染是植入腹疝修復(fù)補片遇到的主要臨床問題之一。通過體外測定細菌對材料表面的粘附，可以評估腹疝修復(fù)補片的細菌感染風(fēng)險。通常用SEM來確定生物材料的細菌粘附性質(zhì)。因此，在本實施例中，使用SEM(使用JEOL-5900掃描電子顯微鏡)來評估材料表面上粘附的細菌的密度和形態(tài)。本文使用代表革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)。

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的培養(yǎng)以及SEM檢測

金黃色葡萄球菌(S.aureus)和大腸桿菌(E.coli)在37℃下的LB肉湯(含有10g/l的胰蛋白胨，5g/l的酵母提取物和10g/l的NaCl)中進行培養(yǎng)。該細菌在培養(yǎng)16小時后收獲。以1300×g離心10分鐘后，收集細菌沉淀，用于PBS洗滌，最后使它們以1×10⁸CFU/ml的濃度再懸浮在PBS中。然后將1ml細菌懸浮液滴到置于24孔板中的PP膜或NSPU膜(如實施例3所制備的)上，以在37℃溫育1小時。將樣品用PBS洗滌三次用于SEM觀察。依據(jù)SEM圖像，在不同位置對細菌計數(shù)，每個區(qū)域具有10×10m²的面積。從至少五個不同的SEM圖像的平均值得到對各個樣品定量。

結(jié)論

圖4示出了兩種網(wǎng)膜上兩種細菌的各自SEM圖像。發(fā)現(xiàn)在NSPU表面上的金黃色葡萄球菌的密度(1.4±1.1×10⁶細胞/cm²)顯著低于PP網(wǎng)膜表面(7±2.8×10⁶細胞/cm²，圖5，P<0.05)。PP上的大腸桿菌的密度為0.6±0.19×10⁶細胞/cm²，然而，在NSPU表面上幾乎沒有發(fā)現(xiàn)大腸桿菌(0細胞/cm²，如圖5所示)。這種趨勢與金黃色葡萄球菌類似。

發(fā)明人認為，這部分是由于PEG衍生的聚合物能有效地排斥大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。此外，材料上涂覆的納米銀也同樣抑制了細菌。在針對金黃色葡萄球菌方面，與市售PP膜相比，本發(fā)明的NSPU將所粘附的細菌密度降低到PP膜的約1/6。在針對大腸桿菌方面，本發(fā)明的NSPU幾乎沒有發(fā)現(xiàn)大腸桿菌。因此，本實施例顯示了本發(fā)明的NSPU相比于市售PP網(wǎng)膜，顯著抑制了細菌粘附。

實施例6：動物實驗和組織學(xué)分析

動物實驗?zāi)Ｐ?/p>

使用大鼠腹腔疝模型研究了本發(fā)明的NSPU網(wǎng)膜(如實施例3所制備)和對照的PP網(wǎng)膜(市售)的組織生物相容性。將12只雄性Sprague–Dawley大鼠(200-250g)分別置于籠中。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的指導(dǎo)并且在重慶市實驗動物管理委員會的批準下進行所有過程。大鼠用0.1g/kg的劑量的3％戊巴比妥麻醉。在剃毛和消毒之后，創(chuàng)建一個3.0cm*2.0cm尺寸的下腹壁全厚筋膜缺損。然后，用3.5cm×2.5cm的網(wǎng)膜覆蓋缺損并使用非再吸收的5-0單絲尼龍縫線在無張力下固定。4周后處死大鼠。進行U形開腹手術(shù)來評價腹膜內(nèi)粘連。

根據(jù)以下所匯報的標準獲得各個大鼠的分數(shù)：0，無粘連；1，薄粘連，通過鈍性分離可容易分開；2，確定的局部粘連；3，確定的多個內(nèi)臟粘連；和4，延伸至腹壁的緊密粘連(參見H.Y.Zhou,J.Zhang,R.L.Yan,Q.Wang,L.Y.Fan,Q.Zhang,W.J.Wang和Z.Q.Hu,Ann.Surg.,2011,253,1033-1041.和E.Ersoy,J.Surg.Res.,2008,147,148–152.)。

收集來自植入?yún)^(qū)域的天然組織包圍的移出移植物，以及腦、腎、肝、心臟、脾臟和睪丸樣品，用于隨后的組織學(xué)評估。

組織學(xué)和免疫組織化學(xué)實驗

將以上取得的組織樣品固定在4％的多聚甲醛中，然后包埋在石蠟中，并切成5μm厚的切片。切片進行蘇木精-伊紅(H&E)染色以評估形態(tài)學(xué)。

為了評估修復(fù)部位的炎癥反應(yīng)和新生血管，針對CD3(淋巴細胞)(1:200稀釋，Abcam)，CCR7(M1表型巨噬細胞)(1:250稀釋，Abcam)，CD163(M2表型巨噬細胞)(1:400稀釋，Santa)，CD31(新內(nèi)膜細胞)(1:400稀釋，Santa)，分別通過免疫組織化學(xué)檢測處理切片。根據(jù)先前的報道(H.Y.Zhou,J.Zhang,R.L.Yan,Q.Wang,L.Y.Fan,Q.Zhang,W.J.Wang和Z.Q.Hu,Ann.Surg.,2011,253,1033-1041，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)對每個樣品進行定量分析。

此外，如B.N.Brown,Biomaterials,2009,30,1482-1491(其公開內(nèi)容通過引用并入本文)所述，計算M1與M2細胞的比率：M1：M2(CCR7：CD163)＝CCR7+陽性細胞/CD163+陽性細胞，值>1.0表示M1細胞占優(yōu)勢，且值<1.0表示M2細胞占優(yōu)勢。

統(tǒng)計分析

基于方差的單向分析計算兩組之間的顯著差異，具有95％的置信區(qū)間且p<0.05被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。

網(wǎng)膜的宏觀組織相容性

在所操作的12只動物中，所有動物都具有正常的術(shù)后恢復(fù)，沒有大鼠發(fā)生傷口感染或傷口開裂。NSPU和PP網(wǎng)膜均顯示部分可見，并在手術(shù)后在高達4周中在植入的腹壁中未觀察到疝或瘺管。在植入筋膜缺損界面的網(wǎng)膜被完全整合到鄰近的腹壁組織中(圖6，B和E)。NSPU組無任何顯著的粘連(圖6，F(xiàn))。然而，PP網(wǎng)膜組的所有六個動物均顯示不同程度的粘連，包括網(wǎng)膜(omentum)，小腸或大腸(圖6，C)。使用以上描述的粘連評分標準，NSPU組的粘連分數(shù)為0，其顯著低于PP組的值(2.6±1.1)。

病理學(xué)與宿主反應(yīng)

此外，為了評估體內(nèi)的宿主反應(yīng)，將NSPU網(wǎng)膜植入大鼠腹部疝模型4周后，移出具有少量周圍組織(大約2mm)的材料用于組織學(xué)分析。PP網(wǎng)膜作為對照。H&E染色(圖7)表明，NSPU中發(fā)生了具有比PP組更少的炎癥細胞浸潤的輕度炎癥反應(yīng)。此外，在NSPU上檢測到比PP上更有序的膠原沉積。這表明，在用NSPU修復(fù)之后在大鼠中存在更顯著的組織再生和重塑。而在PP修復(fù)的大鼠中，更明顯地觀察到成纖維細胞摻入網(wǎng)膜中，而不是促進重塑和再生組織。實驗和對照網(wǎng)膜顯示相似地存在異物巨細胞。

免疫組織化學(xué)分析

為了進一步量化淋巴細胞和巨噬細胞中的宿主反應(yīng)(圖8和9)，我們對CD3(淋巴細胞)、CCR7(M1型巨噬細胞)和CD163(M2型巨噬細胞)進行了免疫化學(xué)檢測。計算了M1與M2細胞的百分比的比率?；谑荏w表達和細胞因子與效應(yīng)分子的生產(chǎn)表征巨噬細胞的M1或M2表型。這些細胞在確定免疫耐受或免疫排斥功能方面起到關(guān)鍵作用。通常，M1型巨噬細胞產(chǎn)生高水平的誘導(dǎo)型氧化氮合成酶(iNOS)并分泌有毒的活性氧，導(dǎo)致致密結(jié)締組織和/或瘢痕的沉積。M2型巨噬細胞在精氨酸的地方產(chǎn)生精氨酸酶(ARG)，隨后產(chǎn)生鳥氨酸和多胺，參與并促進組織修復(fù)和再生。

結(jié)果表明，在NSPU中CD3、CCR7(M1表型巨噬細胞)、CD163(M2表型巨噬細胞)的表達(CD3+42.1±7.5，CCR7+20.8±6.2和CD163+48.7±6.1細胞/mm²)均顯著低于PP(CD3+87.5±9.6，CCR7+34.3±5.8和CD163+50.4±8.8細胞/mm²，P<0.05)。注意到，在NSPU中的M1/M2細胞比率(0.43)也低于PP中(0.68)。先前的研究報道，M1/M2的比率可能比細胞的絕對數(shù)量更重要，因為M1/M2的比率與重塑結(jié)果有明確的相關(guān)性(B.N.Brown,Biomaterials,2009,30,1482-1491；以及X.Fan,Y.Wang,Y.Wang and H.Xu,International Urogynecology Journal,2014,25,683-689)^25,39。

結(jié)果表明，NSPU網(wǎng)膜的植入觸發(fā)的嚴重炎癥反應(yīng)比PP植入少得多。這可以歸因于水凝膠膜的良好生物相容性與納米銀離子的抗菌性質(zhì)的綜合效果。

納米銀對生物體的副作用研究

為了研究納米銀本身相對于模型生物可能的負面影響，我們收集了來自所有主要器官的樣品以進行組織學(xué)分析。值得注意的是，沒有觀察到異常(圖10)，表明本申請的補片沒有對主要器官產(chǎn)生任何副作用。

綜上，本發(fā)明制造了一種用于疝修復(fù)的納米銀涂覆的，聚乙二醇(PEG)水凝膠浸漬的聚氨酯(NSPU)網(wǎng)膜。納米銀賦予網(wǎng)膜表面抗炎癥和抗感染的性質(zhì)。PEG/明膠水凝膠顯著降低體內(nèi)腹部的術(shù)后粘連，并提供了生物相容性；同時，柔性PU還提供必要的機械支持。此外，這種復(fù)合修復(fù)材料還顯示在植入后，從病理學(xué)研究中觀察到在植入筋膜缺損界面的網(wǎng)膜被完全整合到鄰近的腹壁組織中，并且沒有對主要器官產(chǎn)生任何副作用。

以上所述實施例僅是對本發(fā)明優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)σ陨蠈嵤┓桨钢械娜魏渭夹g(shù)特征進行任意組合，而沒有脫離本發(fā)明的精神和范圍。同時，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。