本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，更具體而言本發(fā)明涉及評估腫瘤負荷的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：：腫瘤負荷，是指腫瘤細胞個數(shù)、腫瘤大小或體內(nèi)腫瘤病灶個數(shù)，通常被用來表示腫瘤對人體的危害程度。準確評估腫瘤負荷的變化，是評估腫瘤藥物臨床療效的關(guān)鍵。目前，臨床上通常采用影像學(xué)的方法對晚期腫瘤負荷進行評估。該方法的實施需按照RECIST1.1標準(EisenhauerEA,TherasseP,BogaertsJ,etal.Newresponseevaluationcriteriainsolidtumours:revisedRECISTguideline(version1.1).Europeanjournalofcancer,2009,45(2):228-247)，根據(jù)腫瘤患者在治療過程中影像學(xué)觀察到的目標病灶的變化，將療效和腫瘤負荷評價標準定義為：(1)完全緩解(CR)：所有靶病灶完全消失，全部病理淋巴結(jié)(包括靶結(jié)節(jié)和非靶結(jié)節(jié))短直徑減小至<10毫米；(2)部分緩解(PR)：靶病灶直徑之和比基線水平(治療前)減少至少30％；(3)疾病進展(PD)：以整個研究過程中所有測量的靶病灶直徑之和的最小值為參照，直徑和相對增加至少20％(如果基線測量值最小就以基線值為參照)；除此之外，必須滿足直徑的絕對值增加至少5毫米(出現(xiàn)一個或多個新病灶也視為疾病進展)；(4)疾病穩(wěn)定(SD)：靶病灶減小的程度沒達到PR，增加的程度也沒達到PD水平，介于兩者之間，研究時可以以直徑之和的最小值作為參考。影像學(xué)的方法具有以下三個方面的問題(SharmaMR,MaitlandML,RatainMJ.RECIST:nolongerthesharpesttoolintheoncologyclinicaltrialstoolbox—point.Cancerresearch,2012,72(20):5145-5149；TieJ,KindeI,WangY,etal.CirculatingtumorDNAasanearlymarkeroftherapeuticresponseinpatientswithmetastaticcolorectalcancer.AnnalsofOncology.2015；26(8):1715-1722)：(1)該方法主要采用影像學(xué)評估腫瘤外部形態(tài)大小，缺乏對腫瘤細胞內(nèi)部生物學(xué)活性的準確評估；(2)該方法對不可測量的病灶，如胸腔積液、腹腔積液等，缺少客觀的評估體系；(3)該方法進行臨床評估采用的時間節(jié)點通常固定為治療過程中的6-8周，或治療后每3-4個月，缺乏評估時間節(jié)點的靈活性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種全新的評估晚期患者腫瘤負荷的方法，可以準確、靈活地評估腫瘤負荷，并同時提供腫瘤細胞的分子生物學(xué)特征。本發(fā)明的計算分子腫瘤負荷指數(shù)(mTBI，moleculartumorburdenindex)的方法采用的檢測樣品為多個時間節(jié)點的游離DNA樣本，通過游離DNA變異的檢測，以變異的頻率計算分子腫瘤負荷指數(shù)，并比較多個時間節(jié)點的分子腫瘤負荷指數(shù)的變化趨勢，用以反映腫瘤負荷的變化趨勢。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種評估腫瘤負荷的變化的方法，所述方法包括步驟：1)對多個時間節(jié)點的游離DNA樣本分別進行測序，獲得測序讀段(reads)；2)對于每個時間節(jié)點的游離DNA樣本：a)得到該時間節(jié)點的游離DNA樣本中檢出的變異(所述變異選自SNV、InDel和SV)及其位點的CNV，并獲得所述多個時間節(jié)點的游離DNA樣本中檢出的全部變異(所述變異選自SNV、InDel和SV)及其位點的CNV；b)統(tǒng)計每個所述變異的等位基因頻率；c)對每個所述變異的等位基因頻率用所述變異位點的CNV進行校正；d)對所述變異進行聚類，獲得變異簇；e)計算每個所述變異簇中所有變異的平均等位基因頻率，得到具有最大平均等位基因頻率的變異簇，該最大平均等位基因頻率即為該時間節(jié)點的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBI；3)對所述多個時間節(jié)點的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBI進行比較，反映腫瘤負荷的變化趨勢。在一個實施方案中，所述方法還包括步驟：4)對患者治療療效或者腫瘤負荷變化進行評估，將第一時間節(jié)點的游離DNA樣本的mTBI的值作為基線mTBI0，對其他時間節(jié)點j的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBIj的值進行標準化mTBIj’，對于所述患者治療療效或者腫瘤負荷變化，包括：a)部分緩解(mPR)：相對于治療前的mTBI’，被評估時間點的mTBI’降低≥25％；b)疾病進展(mPD)：與治療過程中出現(xiàn)的最小mTBI’相比，所評估時間節(jié)點的mTBI’相對增加值≥25％，并且絕對增加值＞1％；c)疾病穩(wěn)定(mSD)：mTBI’的降低沒有達到a)中的部分緩解標準，升高也沒有達到b)中的疾病進展的標準。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟1)中利用捕獲探針捕獲游離DNA，然后對捕獲的游離DNA片段進行測序。例如，捕獲探針設(shè)計：基于TCGA、ICGC、COSMIC等數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻參考，參考常規(guī)芯片捕獲探針設(shè)計原則，確定芯片捕獲區(qū)間；檢索已報道的實體腫瘤(例如肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、宮頸癌、食管癌以及肝癌等)，將高頻發(fā)生的基因的所有外顯子全部設(shè)計進入捕獲探針芯片。在優(yōu)選的實施方案中，也可以僅基于單一或者某幾種腫瘤的捕獲探針芯片設(shè)計；或者僅考慮熱點位置的捕獲探針芯片設(shè)計。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟1)中的游離DNA樣本類型可以是血液(血漿)、唾液、胸腹腔積液、尿液、糞便等。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的a)中的測序獲得測序讀段(reads)采用BWA軟件比對到參考基因組，得到每個游離DNA樣本中檢出的變異。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的a)中，用Mutect軟件進行體細胞SNV變異(單核苷酸變異)檢出；用GATK軟件進行體細胞InDel(短的插入缺失)變異檢出；用CONTRA軟件CNV變異(拷貝數(shù)變異)檢出；用ForestSV軟件進行SV變異(結(jié)構(gòu)變異)檢出；所使用的篩選參數(shù)為：normal變異率≤2％；變異測序讀段數(shù)≥5；p值≤0.05。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的a)中，采用ANNOVAR軟件對檢出變異進行注釋，注釋內(nèi)容包括堿基突變、氨基酸突變、突變功能等。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的b)中，測序讀段的支持結(jié)果和頻率信息的統(tǒng)計過程采用SAMtoolsmpileup進行，參數(shù)設(shè)置為：比對質(zhì)量＝30，堿基質(zhì)量＝30，最少測序讀段支持為4。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的b)中，根據(jù)步驟1)中的測序結(jié)果，獲得變異V(變異V選自SNV、InDel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的參考等位測序深度(Ri)、變異等位測序深度(Mi)，并計算變異等位基因頻率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，參考等位測序深度(Ri)是測序結(jié)果中在相應(yīng)位點未發(fā)生該變異的正常序列的條數(shù)；變異等位測序深度(Mi)是測序結(jié)果中在相應(yīng)位點發(fā)生該變異的變異序列的條數(shù)。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的c)中，利用變異Vi所在區(qū)域的CNV(CNVi,i＝1,…,n)，計算變異Vi所在區(qū)域的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)，如果在步驟1)中使用精確的CNV檢測方法(如使用SNP芯片檢測)，對于不在男性性染色體上的變異，會得到兩條染色體上的等位特異的拷貝數(shù)變異(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，從而獲取實際的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)，在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的d)中，對每個所述變異所在細胞群占所有腫瘤細胞的比例進行預(yù)測，例如采用PyClone軟件，軟件參數(shù)可以設(shè)定如下：總體腫瘤細胞比例(CTF)＝變異等位基因頻率的最高值；迭代次數(shù)＝20000；其他參數(shù)為默認。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的d)中，通過預(yù)測的變異細胞比例，對變異進行聚類，例如采用PyClone軟件。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法的步驟2)的d)中，使用PyClonev0.13(當前最新版本)對檢出的n個變異V(SNV/indel/SV)進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：(a)--tumour_contentsCTF；(b)--num_iters20000；(c)--priortotal_copy_number，當采用等位特異的CNV數(shù)據(jù)作為輸入時，該參數(shù)設(shè)置為parental_copy_number；(d)--densitypyclone_beta_binomial，當步驟1)采用的是測序深度較低的全基因組測序技術(shù)時，該參數(shù)設(shè)置為pyclone_binomial。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法采用單個變異的頻率計算分子腫瘤負荷指數(shù)mTBI，該變異可以是SNV、InDel或SV。在第二方面，本發(fā)明提供了一種評估腫瘤負荷的變化的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：1)用于高通量測序多個時間點的游離DNA樣本的模塊；2)對于每個所述時間節(jié)點的游離DNA樣本執(zhí)行如下步驟的模塊：a)接收來自模塊1)的測序信息；b)通過與正?；蛐蛄械男蛄斜容^，得到該時間節(jié)點的游離DNA樣本中檢出的變異(所述變異選自SNV、InDel和SV)及其位點的CNV，并獲得所述多個時間節(jié)點的游離DNA樣本中檢出的全部變異(所述變異選自SNV、InDel和SV)及其位點的CNV；c)統(tǒng)計每個所述變異的等位基因頻率；d)對每個所述變異的等位基因頻率用所述變異位點的CNV進行校正；e)對所述變異進行聚類，獲得變異簇；f)計算每個所述變異簇中所有變異的平均等位基因頻率，得到最大平均等位基因頻率的變異簇，該最大平均等位基因頻率即為該時間節(jié)點的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBI；3)對所述多個時間節(jié)點的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBI進行比較的模塊。在一個實施方案中，所述系統(tǒng)還包括以下模塊：4)對患者治療療效或者腫瘤負荷變化進行評估的模塊，所述模塊執(zhí)行如下步驟：將第一時間節(jié)點的游離DNA樣本的mTBI的值作為基線mTBI0，對其他時間節(jié)點j的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBIj的值進行標準化mTBIj’，對于所述患者治療療效或者腫瘤負荷變化，包括：a)部分緩解(mPR)：相對于治療前的mTBI’，被評估時間點的mTBI’降低≥25％；b)疾病進展(mPD)：與治療過程中出現(xiàn)的最小mTBI’相比，所評估時間節(jié)點的mTBI’相對增加值≥25％，且絕對增加值＞1％；c)疾病穩(wěn)定(mSD)：mTBI’的降低沒有達到a)中的部分緩解標準，升高也沒有達到b)中的疾病進展的標準。在本發(fā)明第二方面的一個實施方案中，模塊2)-4)中的任1個、2個模塊或者全部3個模塊為執(zhí)行所述模塊的步驟的多條指令的計算機可讀介質(zhì)。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊1)中包括進行如下步驟的模塊：利用捕獲探針捕獲游離DNA，然后對捕獲的游離DNA片段進行測序。例如，捕獲探針設(shè)計：基于TCGA、ICGC、COSMIC等數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻參考，參考常規(guī)芯片捕獲探針設(shè)計原則，確定芯片捕獲區(qū)間；檢索已報道的實體腫瘤(例如肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、宮頸癌、食管癌以及肝癌等)，將高頻發(fā)生的基因的所有外顯子全部設(shè)計進入捕獲探針芯片。在優(yōu)選的實施方案中，也可以僅基于單一或者某幾種腫瘤的捕獲探針芯片設(shè)計；或者僅考慮熱點位置的捕獲探針芯片設(shè)計。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊1)中的游離DNA樣本類型可以是血液(血漿)、唾液、胸腹腔積液、尿液、糞便等。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟b)中的測序獲得測序讀段(reads)采用BWA軟件比對到參考基因組，得到每個游離DNA樣本中檢出的變異。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟b)中，用Mutect軟件進行體細胞SNV變異(單核苷酸變異)檢出；用GATK軟件進行體細胞InDel(短的插入缺失)變異檢出；用CONTRA軟件CNV變異(拷貝數(shù)變異)檢出；用ForestSV軟件進行SV變異(結(jié)構(gòu)變異)檢出；所使用的篩選參數(shù)為：normal變異率≤2％；變異測序讀段數(shù)≥5；p值≤0.05。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟b)中，采用ANNOVAR軟件對檢出變異進行注釋，注釋內(nèi)容包括堿基突變、氨基酸突變、突變功能等。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟c)中，測序讀段的支持結(jié)果和頻率信息的統(tǒng)計過程采用SAMtoolsmpileup進行，參數(shù)設(shè)置為：比對質(zhì)量＝30，堿基質(zhì)量＝30，最少測序讀段支持為4。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟c)中，根據(jù)模塊1)獲得的測序結(jié)果，獲得變異V(變異V選自SNV、InDel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的參考等位測序深度(Ri)、變異等位測序深度(Mi)，并計算變異等位基因頻率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，參考等位測序深度(Ri)是測序結(jié)果中在相應(yīng)位點未發(fā)生該變異的正常序列的條數(shù)；變異等位測序深度(Mi)是測序結(jié)果中在相應(yīng)位點發(fā)生該變異的變異序列的條數(shù)。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟d)中，利用變異Vi所在區(qū)域的CNV(CNVi,i＝1,…,n)，計算變異Vi所在區(qū)域的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)，如果在模塊1)中使用精確的CNV檢測方法(如使用SNP芯片檢測)，對于不在男性性染色體上的變異，會得到兩條染色體上的等位特異的拷貝數(shù)變異(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，從而獲取實際的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)，在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟e)中，對每個所述變異所在細胞群占所有腫瘤細胞的比例進行預(yù)測，例如采用PyClone軟件，軟件參數(shù)可以設(shè)定如下：總體腫瘤細胞比例(CTF)＝變異等位基因頻率的最高值；迭代次數(shù)＝20000；其他參數(shù)為默認。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟e)中，通過預(yù)測的變異細胞比例，對變異進行聚類，例如采用PyClone軟件。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)的模塊2)的步驟e)中，使用PyClonev0.13(當前最新版本)對檢出的n個變異V(SNV/indel/SV)進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：(a)--tumour_contentsCTF；(b)--num_iters20000；(c)--priortotal_copy_number，當采用等位特異的CNV數(shù)據(jù)作為輸入時，該參數(shù)設(shè)置為parental_copy_number；(d)--densitypyclone_beta_binomial，當模塊1)中采用的是測序深度較低的全基因組測序技術(shù)時，該參數(shù)設(shè)置為pyclone_binomial。在一個實施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)采用單個變異的頻率計算分子腫瘤負荷指數(shù)mTBI，該變異可以是SNV、InDel或SV。本發(fā)明是一個開創(chuàng)性的發(fā)明，采用mTBI的方法可以評估所有實體瘤腫瘤負荷的變化情況，可以靈活地、實時地監(jiān)測腫瘤負荷的進展，可以提供詳盡的腫瘤分子生物學(xué)變異特征。相對于其他評估方法，本發(fā)明的優(yōu)勢如下：1)高覆蓋度：腫瘤發(fā)生是由細胞內(nèi)變異導(dǎo)致的，mTBI技術(shù)基于游離DNA變異檢出結(jié)果，可以反映每個患有實體腫瘤的患者體內(nèi)突變情況，并給出客觀的負荷指數(shù)，克服了影像學(xué)在不可測量病灶檢測中的主觀因素，也可將無靶病灶患者納入檢測范圍內(nèi)；2)高靈活性：mTBI評估腫瘤負荷的周期取決于游離DNA的取樣時間節(jié)點，可以克服影像學(xué)方法以用藥周期或隨訪月份為評估節(jié)點的長周期缺點，監(jiān)測靈活，可以實時反映腫瘤負荷的動態(tài)變化；3)高通量：結(jié)合高通量測序技術(shù)(例如下一代測序技術(shù)，NGS)的目標區(qū)域捕獲測序，不僅可以對相關(guān)感興趣的基因一次性掃描，獲取更全面的分子突變信息，以得出更準確的相關(guān)預(yù)測，而且能夠在很短的時間內(nèi)同時進行多例樣本檢測，從而壓縮成本，有利于臨床的推廣；4)指示性：mTBI過程中檢出的變異信息，存在部分信息可對應(yīng)臨床腫瘤患者的用藥靶點，在提示腫瘤負荷變化的同時，提示受試者進一步的治療方案。附圖說明通過以下附圖對本發(fā)明進行說明：圖1是mTBI計算示意圖，圖中基線期為治療前的時間節(jié)點。圖2中示出了本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果與臨床影像學(xué)結(jié)果進行比較的結(jié)果。具體實施方式在本發(fā)明中，基因名稱均采用NCBI-Gene里的官方命名(OfficialSymbol)，并采用本領(lǐng)域通用表示法表示基因突變和蛋白質(zhì)突變。例如，c.1634C>T(p.S545L)表示錯義突變，表示編碼區(qū)第1634位的C堿基改變?yōu)門堿基，從而導(dǎo)致545位的氨基酸由S突變?yōu)長；c.672+1G>T表示剪切突變，表示編碼區(qū)第672位所在外顯子3端緊連內(nèi)含子的第一個堿基由G改變?yōu)門；c.351_364delGACAGCCAAGTCTG(p.T118Dfs*26)表示小片段缺失，表示編碼區(qū)第351位到364位的堿基GACAGCCAAGTCTG缺失，從而導(dǎo)致氨基酸序列的118位氨基酸T由于讀碼框的改變突變成為D，新的讀碼框持續(xù)翻譯了26個新的氨基酸。在本發(fā)明中，數(shù)學(xué)符號ceil是指向上取整。在本發(fā)明中，所述腫瘤選自但不限于：肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、宮頸癌、食管癌和肝癌。在一個具體的實施方案中，所述腫瘤是乳腺癌，所述變異是實施例5.1節(jié)的表中列出的變異。本發(fā)明的方法流程圖如圖1所示，對每位受試患者，采用的檢測樣品為多個時間節(jié)點的游離DNA樣本，通過游離DNA變異的檢測，以變異的頻率計算分子腫瘤負荷指數(shù)，并比較多個時間節(jié)點的分子腫瘤負荷指數(shù)的變化趨勢，用以反映腫瘤負荷的變化趨勢。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于乳腺癌而言，發(fā)明人通過試驗并追蹤患者疾病進展情況證明了，對于所述患者治療療效或者腫瘤負荷變化，包括：a)部分緩解(mPR)：相對于治療前的mTBI’，被評估時間點的mTBI’降低≥25％；b)疾病進展(mPD)：與治療過程中出現(xiàn)的最小mTBI’相比，所評估時間節(jié)點的mTBI’相對增加值≥25％，且絕對增加值＞1％；c)疾病穩(wěn)定(mSD)：mTBI’的降低沒有達到a)中的部分緩解標準，升高也沒有達到b)中的疾病進展的標準。以下為本發(fā)明的方法的主要技術(shù)流程與原理介紹：1.高通量測序檢測ctDNA變異首先，進行變異檢測和參數(shù)計算：1)通過全基因組、全外顯子組或探針捕獲測序等高通量測序技術(shù)及相應(yīng)的信息學(xué)分析方法，對受試者cfDNA進行測序，獲取ctDNA中包含的變異，包括SNV、indel、SV、CNV等；2)根據(jù)步驟1)中的測序結(jié)果，獲得變異V(所述變異V選自SNV、InDel和SV)(Vi,i＝1,…,n)的參考等位測序深度(Ri)、變異等位測序深度(Mi)，并計算變異等位基因頻率(VariantAlleleFraction，VAFi)，其中，參考等位測序深度(Ri)是測序結(jié)果中在相應(yīng)位點未發(fā)生該變異的正常序列的條數(shù)；變異等位測序深度(Mi)是測序結(jié)果中在相應(yīng)位點發(fā)生該變異的變異序列的條數(shù)；3)利用變異Vi所在區(qū)域的CNV(CNVi,i＝1,…,n)，計算變異Vi所在區(qū)域的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)，如果在步驟1)中使用精確的CNV檢測方法(如使用SNP芯片檢測)，對于不在男性性染色體上的變異，會得到兩條染色體上的等位特異的拷貝數(shù)變異(CNVi,major，CNVi,minor，CNVi,major≥CNVi,minor)信息，從而獲取實際的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)，精確的CNV檢測是指獲得兩條染色體的等位特異的拷貝數(shù)變異，例如使用SNP芯片檢測。2.變異聚類然后，對每位患者，依據(jù)步驟1中得到的參數(shù)，將檢測到的變異進行聚類分析和克隆層級計算：1)ctDNA比例評估：以最大的變異等位頻率來評估cfDNA中ctDNA所占比例(CTF)，CTF＝max(VAFi),i＝1,…,n(公式5)2)變異聚類：對變異進行聚類：是利用例如PyClone軟件或其他基于貝葉斯聚類方法，將具有相似細胞比例的變異聚類到一類中。對于任一變異(SNV/indel/SV)而言，cfDNA的來源細胞被分為三類：正常細胞(N)、不攜帶該變異的腫瘤細胞(C0)、攜帶該變異的腫瘤細胞(C1)，攜帶該變異的腫瘤細胞(C1)占所有腫瘤細胞(C1+C0)的比例稱為變異腫瘤細胞比例，如果兩個或以上變異的變異腫瘤細胞比例相當，那么它們發(fā)生的時間近似，會被賦予相同的簇標簽，聚類成一簇，即一個分子克隆。因此，對變異聚類需要用到以下數(shù)據(jù)：a)變異Vi(SNV/indel/SV)的參考和變異等位深度數(shù)據(jù)(Ri，Mi)：用于與CTF和CNV一塊評估變異腫瘤細胞比例；b)步驟1.3)中的參考拷貝數(shù)(rCNi)和實際總拷貝數(shù)(CNi)或?qū)嶋H的等位特異的拷貝數(shù)(CNi,major，CNi,minor)：對于某一變異，該變異等位的拷貝數(shù)擴增或缺失會造成變異腫瘤細胞比例估計值的假性升高或假性降低，因此加入拷貝數(shù)變化數(shù)據(jù)會更準確的判斷C1細胞的基因型，校正變異頻率，正確評估變異腫瘤細胞比例；c)CTF：用以估計cfDNA來源細胞的構(gòu)成，即所有細胞(N+C0+C1)中腫瘤細胞(C0+C1)所占的比例，該參數(shù)的準確設(shè)置有助于正確計算來自正常細胞的參考等位和來自腫瘤細胞的參考等位的數(shù)量比例。例如使用PyClonev0.13(當前最新版本)對檢出的n個變異V(SNV/indel/SV)進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：(a)--tumour_contentsCTF；(b)--num_iters20000；(c)--priortotal_copy_number，當采用等位特異的CNV數(shù)據(jù)作為輸入時，該參數(shù)設(shè)置為parental_copy_number；(d)--densitypyclone_beta_binomial，當步驟1.1)采用的是測序深度較低的全基因組測序技術(shù)時，該參數(shù)設(shè)置為pyclone_binomial。PyClone(Roth,A.etal.PyClone:statisticalinferenceofclonalpopulationstructureincancer.Naturemethods11,396-398,doi:10.1038/nmeth.2883(2014).)根據(jù)變異V(SNV/indel/SV)和CNV信息估計Vi所在的細胞占所有腫瘤細胞的比例，并依此對每個變異賦予一個變異簇標簽(Ci,i＝1,…,n，Ci∈{1,…,c},c為變異簇的個數(shù))。對變異聚類還可以采用例如PyClone的其他版本或其他變異聚類軟件。3)對mTBI進行計算：是通過計算聚類得到的每個變異簇的平均頻率，采用最大的變異簇平均頻率表示分子腫瘤負荷指數(shù)mTBI。3.評估腫瘤負荷變化對所述多個時間節(jié)點的游離DNA樣本的mTBI進行比較，mTBI的值增加或降低到一定程度反映腫瘤在治療過程中具體狀態(tài)，例如部分緩解(mPR)、疾病進展(mPD)、疾病穩(wěn)定(mSD)。優(yōu)選地，將第一時間節(jié)點的游離DNA樣本的mTBI的值作為基線mTBI0，對其他時間節(jié)點j的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBIj的值進行標準化mTBIj’，對于所述患者治療療效或者腫瘤負荷變化，包括：a)部分緩解(mPR)：相對于治療前的mTBI’，被評估時間點的mTBI’降低≥25％；b)疾病進展(mPD)：與治療過程中出現(xiàn)的最小mTBI’相比，所評估時間節(jié)點的mTBI’相對增加值≥25％，且絕對增加值＞1％；c)疾病穩(wěn)定(mSD)：mTBI’的降低沒有達到a)中的部分緩解標準，升高也沒有達到b)中的疾病進展的標準。下面結(jié)合圖1對本發(fā)明的方法的主要技術(shù)流程與原理進行介紹。本發(fā)明可以按照如下進行捕獲探針設(shè)計：1)基于TCGA、ICGC、COSMIC等數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻參考，參考常規(guī)芯片捕獲探針設(shè)計原則，確定芯片捕獲區(qū)間；2)檢索已報道的實體腫瘤(肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、宮頸癌、食管癌以及肝癌等)，將高頻發(fā)生的基因的所有外顯子全部設(shè)計進入芯片。本發(fā)明還可以僅涉及單一或者某幾種腫瘤的捕獲芯片設(shè)計；非全部外顯子或者僅考慮熱點位置的芯片設(shè)計。本發(fā)明可以按照如下進行外周血血漿分離及DNA提?。翰扇《鄠€時間節(jié)點的血，使用EDTA抗凝管采血，不可使用肝素抗凝。采血量不低于8ml，采血后立即上下顛倒混勻，4小時內(nèi)完成血漿分離。1)血漿分離流程如下：(1)將采血管在4℃條件下1600g離心10min，離心后將上層血漿分裝到多個1.5mL或者2.0mL的離心管中，在吸取血漿過程中不能吸到中間白細胞層，下層淋巴細胞和血細胞作為對照樣品進行保存；(2)將分裝好的血漿樣本進行二次分離，在4℃條件下16000g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL或者2.0mL的離心管中，棄去殘余白細胞，兩次分離后血漿和對照樣品標記清楚，保存在-80℃冰箱備用。2)血漿游離DNA提?。貉獫{游離DNA的提取采用QIAampCirculatingNucleicAcidKit(QIAGEN)游離DNA提取試劑盒并依照廠商說明書完成。本發(fā)明還可以使用其他可提取游離DNA的樣本類型，如唾液、胸腹腔積液、尿液、糞便等；其他采血管進行的外周血采集；其他試劑盒進行的DNA提取。本發(fā)明可以按照如下進行文庫構(gòu)建：采用KAPA文庫構(gòu)建試劑盒進行文庫構(gòu)建，或者采用其他試劑盒進行文庫構(gòu)建。本發(fā)明可以按照如下進行探針捕獲與上機測序：文庫構(gòu)建、質(zhì)控合格后進行液體芯片捕獲，之后進行捕獲產(chǎn)物的擴增與Hiseq3000上機測序，或者使用其他測序儀進行測序。本發(fā)明可以按照如下進行變異檢出：1)將測序下機數(shù)據(jù)進行過濾，剔除低質(zhì)量的測序讀段；2)將測序下機數(shù)據(jù)采用BWA軟件比對到參考基因組；3)比對bam文件采用Picard進行重復(fù)序列的標記；4)去重復(fù)后的bam文件采用GATK進行InDelRealigner和BaseRecalibrator的處理；5)用Mutect軟件進行體細胞SNV變異(單核苷酸變異)檢出；用GATK軟件進行體細胞InDel(短的插入缺失)變異檢出；用CONTRA軟件CNV變異(拷貝數(shù)變異)檢出；用ForestSV軟件進行SV變異(結(jié)構(gòu)變異)檢出；所使用的篩選參數(shù)為：normal變異率≤2％；變異測序讀段數(shù)≥5；p值≤0.05；6)采用ANNOVAR軟件對檢出變異進行注釋，注釋內(nèi)容包括堿基突變、氨基酸突變、突變功能等；本發(fā)明還可以使用其他現(xiàn)有軟件或者個人編寫腳本進行的bam文件生成、變異檢出、變異注釋。本發(fā)明可以按照如下進行變異聚類與mTBI計算：1)檢出變異測序讀段和變異等位基因頻率統(tǒng)計：將各個時間節(jié)點樣品檢出的變異V(SNV/InDel/SV)合并為一個集合，并對集合中的變異統(tǒng)計其在多個時間節(jié)點樣品中的測序讀段支持結(jié)果和頻率信息，統(tǒng)計過程可以采用SAMtoolsmpileup進行，參數(shù)設(shè)置為：比對質(zhì)量＝30，堿基質(zhì)量＝30，最少測序讀段支持為4；2)預(yù)測每個變異所在細胞群所占的細胞比例：對連續(xù)時間節(jié)點的變異合并集合采用例如PyClone軟件對細胞比例進行預(yù)測，優(yōu)選將每個變異位點的拷貝數(shù)變異用于對變異等位基因頻率進行校正，例如軟件參數(shù)設(shè)定如下：總體腫瘤細胞比例＝變異等位基因頻率的最高值，迭代次數(shù)＝20000，其他參數(shù)為默認；3)變異的聚類分析：采用例如PyClone軟件，通過預(yù)測的變異細胞比例，對變異進行聚類得到變異簇，并經(jīng)過變異簇的平均等位基因頻率進行排序，得到最大平均頻率的變異簇；4)mTBI的計算：對于第j個時間節(jié)點的樣品，取上述對其確定的最大平均頻率的變異簇的平均頻率作為mTBIj。本發(fā)明還可以采用其他軟件或者腳本進行的測序讀段支持結(jié)果和等位基因頻率統(tǒng)計；采用其他軟件進行的細胞比例預(yù)測；采用的其他軟件進行的變異聚類分析；采用單個變異的頻率計算mTBI，該變異可以SNV、InDel或SV。本發(fā)明可以按照如下進行腫瘤負荷的評估：采用基線期(第一個時間節(jié)點)的mTBI0值作為標準，對任意第j個時間節(jié)點的mTBIj值進行標準化mTBIj’，公式為在對患者治療療效或者腫瘤負荷進行評估中，通過被評估時間點的mTBI’與基線的mTBI’比較，評估腫瘤負荷。例如，對患者療效給出3種不同的定義，分別為：部分緩解(molecularPartialResponse，mPR)：相對于治療前基線的mTBI’，被評估時間點的mTBI’降低≥25％；疾病進展(molecularProgressiveDisease，mPD)：與治療過程中出現(xiàn)的最小mTBI’相比，所評估時間節(jié)點的mTBI’相對增加值≥25％，且絕對增加值＞1％；疾病穩(wěn)定(molecularStableDiseasemSD)：mTBI’降低沒有達到部分緩解標準，但是也沒有升高達到疾病進展的標準。本發(fā)明中使用的工具軟件可以通過如下途徑獲得：1.BWA：http://bio-bwa.sourceforge.net/2.Picard：https://broadinstitute.github.io/picard/3.GATK:https://www.broadinstitute.org/gatk/4.Mutect:http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/mutect5.CONTRA:http://contra-cnv.sourceforge.net/6.ForestSV:http://sebatlab.ucsd.edu/index.php/software-data7.ANNOVAR:http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/8.SAMtools:http://samtools.sourceforge.net/9.PyClone:http://compbio.bccrc.ca/software/pyclone/。在本發(fā)明的方法中，除了測序步驟之外，其他步驟可以以指令的形式存在于計算機可讀介質(zhì)中，只需要將所述測序結(jié)果輸入計算設(shè)備，所述計算設(shè)備就可以讀取所述計算機可讀介質(zhì)中的指令，完成本發(fā)明方法的其他步驟。。所述計算設(shè)備包括但不限于計算機、便攜式計算機、PAD、智能手機、智能手腕等。實施例下面通過具體的乳腺癌腹膜轉(zhuǎn)移患者的血漿游離DNA檢測結(jié)果實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是該實施例僅僅是為了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本申請的限制。1.外周血漿分離和游離DNA提?。菏褂肊DTA抗凝管采血，不可使用肝素抗凝。采血量不低于8ml，采血后立即上下顛倒混勻，4小時內(nèi)完成血漿分離。1.1血漿分離流程：(1)將采血管在4℃條件下1600g離心10min，離心后將上層血漿分裝到多個1.5mL或者2.0mL的離心管中，在吸取血漿過程中不能吸到中間白細胞層，下層淋巴細胞和血細胞作為對照樣品進行保存；(2)將分裝好的血漿樣本進行二次分離，在4℃條件下16000g離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL或者2.0mL的離心管中，棄去殘余白細胞，兩次分離后血漿和對照樣品標記清楚，保存在-80℃冰箱備用。1.2血漿游離DNA提取血漿游離DNA的提取采用QIAampCirculatingNucleicAcidKit(QIAGEN)游離DNA提取試劑盒并依照廠商說明書完成。2.樣品文庫的制備提取后的游離DNA后，按照KAPALTPLibraryPreparationKit建庫說明書，進行3步酶促反應(yīng)。2.1末端修復(fù)然后加入AgencourtAMPureXPreagent120μL，進行磁珠純化，最后回溶42μLddH2O，帶磁珠進行下一步反應(yīng)。2.2加A反應(yīng)然后加入PEG/NaClSPRI溶液90μL，充分混合，進行磁珠純化，最后回溶20μLddH2O，帶磁珠進行下一步反應(yīng)。然后，分別加入PEG/NaClSPRI溶液50μL2次，進行2次磁珠純化，最后回溶25μLddH2O。2.3連接文庫的富集對連接文庫進行富集，使用熒光定量PCR儀(ABI7500)，按照KAPALTPLibraryPreparationKit試劑盒說明進行操作。3.探針捕獲與上機測序3.1擴增后文庫質(zhì)控合格后并采用發(fā)明人設(shè)計的捕獲探針(中國專利申請CN105063208A中實施例5的ONCOcare-JK)，參照芯片制造商(Roche)提供的說明書進行雜交捕獲。最后洗脫回溶21μLddH2O帶雜交洗脫磁珠。3.2雜交捕獲產(chǎn)物的擴增3.3先除去上一步磁珠，然后重新加入AgencourtAMPureXPreagent50μL，進行磁珠純化，最后回溶25μLddH2O，進行QC及上機。3.4采用IlluminaHiSeq3000PE151程序進行上機測序，測序?qū)嶒灢僮靼凑罩圃焐烫峁┑牟僮髡f明書(參見Illumina/Solexa官方公布cBot)進行上機測序操作。4.正反雙鏈糾錯低頻信息分析：4.1下機數(shù)據(jù)進行過濾，剔除低質(zhì)量的測序讀段；4.2下機數(shù)據(jù)采用BWA軟件比對到參考基因組；4.3比對bam文件采用Picard進行重復(fù)序列的標記；4.4去重復(fù)后的bam文件采用GATK進行IndelRealigner和BaseRecalibrator的處理。4.5變異檢出：用Mutect軟件進行體細胞SNV變異檢出；用GATK軟件進行體細胞InDel變異檢出；用CONTRA軟件CNV檢出；用ForestSV軟件進行SV變異檢出；所使用的篩選參數(shù)為：normal變異率≤2％；變異測序讀段數(shù)≥5；p值≤0.05。4.6變異注釋：采用ANNOVAR軟件對檢出變異進行注釋，注釋內(nèi)容包括堿基突變、氨基酸突變、突變功能等。5.測序結(jié)果分析5.1變異檢出結(jié)果患者變異檢出結(jié)果如下表所示：5.2測序讀段統(tǒng)計結(jié)果5.3Pyclone聚類結(jié)果使用PyClonev0.13對檢出的變異進行聚類，除以下幾個參數(shù)外，均采用默認參數(shù)：a)--tumour_contents0.01,0.01,0.012,0.026,0.067b)--num_iters20000c)--priortotal_copy_numberd)--densitypyclone_beta_binomial6.mTBI計算及腫瘤負荷監(jiān)測第j個時間節(jié)點的mTBIj為該時間節(jié)點SNV簇的平均頻率最高值。計算各時間節(jié)點的mTBI，并按照第一節(jié)點的mTBI0值進行標準化校正后得到各時間節(jié)點的mTBI’，計算結(jié)果和負荷評估結(jié)果如下圖：時間節(jié)點0102030405mTBI(％)0.940.210.231.996.68mTBI'(％)1002224212712負荷評估結(jié)果-mPRmSDmPDmPD7.與影像學(xué)比較與臨床影像學(xué)結(jié)果對比后，發(fā)現(xiàn)本方法可以通過mTBI的值的變化客觀反映乳腺癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶的整體負荷變化，并相較于影像學(xué)，可以更早地發(fā)現(xiàn)疾病進展(提前一個節(jié)點)，比較結(jié)果如圖2。因此，mTBI的值變化代表了腫瘤負荷變化。mTBI的值增加或降低到一定程度反映腫瘤在治療過程中具體狀態(tài)，例如部分緩解(mPR)、疾病進展(mPD)、疾病穩(wěn)定(mSD)。發(fā)明人將第一時間節(jié)點的游離DNA樣本的mTBI的值作為基線mTBI0，對其他時間節(jié)點j的游離DNA樣本的分子腫瘤負荷指數(shù)mTBIj的值進行標準化mTBIj’，發(fā)明人通過試驗并追蹤患者疾病進展情況證明了，對于所述患者治療療效或者腫瘤負荷變化，包括：a)部分緩解(mPR)：相對于治療前的mTBI’，被評估時間點的mTBI’降低≥25％；b)疾病進展(mPD)：與治療過程中出現(xiàn)的最小mTBI’相比，所評估時間節(jié)點的mTBI’相對增加值≥25％，且絕對增加值＞1％；c)疾病穩(wěn)定(mSD)：mTBI’的降低沒有達到a)中的部分緩解標準，升高也沒有達到b)中的疾病進展的標準。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3