一種基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法
【專利摘要】一種基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，包括如下步驟：采用能量不同的序列三維點擴散函數進行圖像復原仿真實驗，獲得不同能量的三維點擴散函數與圖像復原效果和復原時間之間的關系，以此計算復原效率，繪制復原效率曲線，計算二階導數，獲得曲線拐點，依據曲線拐點的坐標確定能量閾值，進而確定起點三維點擴散函數，并按照一般觀察瀏覽和分析測量的不同需要，作出三維點擴散函數能量大小以及與之相應空間大小的選取。該方法能夠根據觀察瀏覽和分析測量的不同需要，綜合考慮復原效果和處理時間，選取相應的三維點擴散函數，對采集的序列顯微切片圖像進行復原處理。
【專利說明】一種基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方 法 一、【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，該方法 是數字共焦顯微技術中三維生物顯微圖像復原處理的一個重要環(huán)節(jié)，屬于數字圖像復原處 理【技術領域】。該方法的應用，可按照一般觀察瀏覽和分析測量的不同需要，結合復原效果和 處理時間的綜合權衡考慮，作出三維點擴散函數不同能量大小以及與之相應空間大小的選 取。
【背景技術】
[0002] 數字共焦顯微技術以普通生物光學顯微鏡為基礎，配置圖像探測器、精密移動控 制機構和電腦，采用數字圖像處理技術，對采集的生物樣本顯微圖像進行復原處理，消除焦 面以外的散焦的影響，以提高細胞圖像的分辨率。
[0003] 數字共焦顯微技術中的復原處理，采用的是三維顯微圖像去卷積復原方法。表征 顯微鏡光學系統(tǒng)的三維點擴散函數，直接決定著去卷積復原處理的效果。三維點擴散函數 越準確地反映顯微鏡光學系統(tǒng)的能量分布，復原效果越好。在此基礎上，三維點擴散函數的 空間大小選取越大，包含能量越大，復原效果越好，同時處理時間越長。包含全部能量的三 維點擴散函數最大空間大小為樣本體積的2倍，這是一個十分巨大的空間。三維點擴散函 數為對頂雙漏斗結構，絕大部分能量集中在中部的雙漏斗對頂處的微小區(qū)域。因此，在進行 圖像復原處理時，合理的選取是以該處為原點選取微小區(qū)域的一定空間大小的三維點擴散 函數進行圖像復原處理。研究表明，隨著空間大小的逐漸增大，復原效果提升逐步趨緩，而 處理時間卻迅速增加，復原效率下降。因此，如何根據觀察瀏覽和分析測量的不同需要，綜 合和權衡考慮復原效果和處理時間，選取不同的能量大小、進而選取與之相應不同空間大 小三維點擴散函數進行復原處理，是數字共焦技術中三維顯微圖像去卷積復原處理需要解 決的重要問題。 三、
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方 法，該方法能夠根據觀察瀏覽和分析測量的不同需要，綜合考慮復原效果和處理時間，選取 相應能量大小以及與之相應空間大小的三維點擴散函數，對采集的序列顯微切片圖像進行 復原處理。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術方案達到上述目的：一種基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維 點擴散函數選取方法，包括如下步驟：
[0006] (1)按照顯微鏡物鏡放大倍數、數值孔徑參數、光源波長、相機靶面大小和分辨率 參數，并設定一個光學切片層距，制作一個用于表示成像過程進行卷積運算的表征顯微鏡 光學系統(tǒng)的三維點擴散函數h n，并制作不同空間大小的用于圖像復原的序列三維點擴散函 數1^，分別命名為h3、h 5、h7、…、hn_2;
[0007] (2)按式⑴計算步驟⑴中得到的各個不同空間大小三維點擴散函數匕和比的 能量值E，并進行歸一化；
[0008] (3)用一幅清晰高信噪比細胞圖像作為初始二維樣本，制作相互關聯的序列二維 圖像，并用這些序列二維圖像構建一個清晰仿真樣本三維圖像f ;
[0009] (4)用hn與f卷積得到模糊仿真三維成像圖像g ;
[0010] (5)用步驟⑴中不同能量大小的三維點擴散函數比分別對三維圖像g進行去卷 積復原處理，復原算法采用最大似然法，同時記錄復原效果和處理時間；
[0011] (6)去卷積復原處理的復原效果的評價，采用式（2)的改善信噪比ISNR，處理時間 單位采用秒，計算不同能量三維點擴散函數h對三維成像圖像g進行復原處理的復原效率 q ；
[0012] (7)對各三維點擴散函數的能量E及相應的復原效率q進行數據擬合，得到q-E關 系曲線；
[0013] (8)求q對E的二階導數d2q/dE2,找出二階導數為零的曲線拐點 Y，將直角坐標 橫軸上與拐點對應的能量設定為閾值能量Εγ，以此確定"起點三維點擴散函數"；
[0014] (9)三維點擴散函數的選取，如果復原圖像用于一般觀察瀏覽，選取"起點三維點 擴散函數"或稍大的空間大小的三維點擴散函數進行圖像復原。如果復原圖像用于研究、分 析測量，選取更大空間的三維點擴散函數。對復原圖像的效果要求越高，選取越大空間大小 的三維點擴散函數。
[0015] 所述的用于表示成像過程進行卷積運算的表征顯微鏡光學系統(tǒng)的三維點擴散函 數hn，是一個空間大小為ηΧηΧη的η階三維矩陣，η為兩位數的奇數。
[0016] 所述制作不同空間大小的用于圖像復原的序列三維點擴散函數hi，是以 hn的空間中心點為原點，向四周由小到大分別按3X3X3、5X5X5、7X7X7、…、 (n-2) X (n-2) X (n-2)截取的三維矩陣。
[0017] 所述的用于圖像復原的序列三維點擴散函數hi，它們的歸一化能量值是以hn的能 量值為基準進行歸一化處理得到。
[0018] 所述的復原效率q，由本發(fā)明提出的定義q = ISNR/t計算得到，其中t為以最小空 間大小三維點擴散函數h3的處理時間為基數進行歸一化的歸一化復原處理時間。
[0019] 所述的"起點三維點擴散函數"，是指能量值E大于閾值能量Ε γ的最小空間的三 維點擴散函數。
[0020] 本發(fā)明的突出效果在于：
[0021] 三維點擴散函數的能量大小的不同選取以及相應空間大小的不同選取，直接決定 著數字共焦顯微技術中三維顯微圖像去卷積復原效果和處理時間。如何選取，一直是數字 共焦顯微技術待解決的問題。本發(fā)明基于三維點擴散函數能量分布的研究，提出了通過圖 像復原仿真實驗和復原效率及其曲線拐點的計算，確定能量閾值，進而確定起點三維點擴 散函數，根據觀察瀏覽和分析測量的不同需要，選取不同能量大小和與之相應的不同空間 大小三維點擴散函數的方法。該方法的提出，為數字共焦顯微技術的三維顯微圖像去卷積 復原處理提供了一種有效的三維點擴散函數選取方法。 四、【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1仿真圖像。
[0023] 圖2q_E擬合曲線。
[0024] 圖3仿真圖復原結果。
[0025] 圖4實際細胞圖復原結果。 五、【具體實施方式】
[0026] 以下通過實例對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細描述。
[0027] 本發(fā)明所述的基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，包括以下 步驟：
[0028] 1.三維點擴散函數制作
[0029] 設置參數：顯微鏡機械鏡筒長度為160mm ;光源波長為550nm ;C⑶參數：1/3英寸， 像素值640X480。
[0030] 顯微鏡光學系統(tǒng)放大倍數Μ和數字孔徑NA取以下設置：
[0031] 放大倍數Μ = 40倍；數值孔徑ΝΑ = 0· 6 ;
[0032] 三維點擴散函數層距L取0. 3125 μ m，制作空間大小為21X21X21的3D-PSF，其 徑向大小為21X21，軸向大小為21，以h21表示。
[0033] 以h21的空間中心點（11，11，11)為中心，分別向四周依次截取空間大小為 3X3X3、5X5X5、7X7X7、...、19X19X19 等 9 個、以及本身 21X21X21 共 10 個三維點 擴散函數，命名Sh3、h5、h7、"*、h 19。
[0034] 2.三維點擴散函數能量計算
[0035] 根據式（1)分別計算步驟1得到的10個三維點擴散函數的能量值E。各三維點擴 散函數的能量值均以h 21能量值為基準進行歸一化處理。
[0036] 3.三維樣本仿真圖像f制作
[0037] 以圖1(a)中二維原始清晰圖像作為初始樣本，大小為151X151，通過微量旋轉疊 加制作含21幅二維圖像的三維仿真樣本圖像f，大小為151X151X21。
[0038] 4.模糊仿真三維成像圖像g4Q生成
[0039] 用h21與圖像f進行卷積運算，生成得到三維模糊圖像g4(l，圖1 (b)所示為g4(l取中 心層的二維圖像。
[0040] 5.三維仿真圖像復原
[0041] 分別用步驟1得到的10個三維點擴散函數對模糊仿真圖像g?進行去卷積復原處 理，復原方法采用最大似然法，迭代次數為600次。同時記錄處理時間，處理時間單位為秒。
[0042] 6.復原實驗的計算
[0043] 根據式（2)分別計算10個三維點擴散函數對圖像復原實驗得到的改善信噪比 ISNR。并以最小的空間大小三維點擴散函數1!3的處理時間為基準進行時間歸一化，計算各 三維點擴散函數對三維圖像g進行復原處理的復原效率q :q = ISNR/t，t為歸一化復原處 理時間。
[0044] 10個三維點擴散函數的空間大小size、能量值E、復原效果ISNR以及復原效率q 等復原實驗計算結果列于表1。其中空間大小size用像素數表示。表1中，3D-PSF為三維 點擴散函數的英文縮寫。
[0045] 表1三組三維點擴散函數復原實驗和計算結果
[0046]
【權利要求】
1. 一種基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，其特征在于，包括如 下步驟： (1) 按照顯微鏡物鏡放大倍數、數值孔徑參數、光源波長、相機靶面大小和分辨率參數， 并設定一個光學切片層距，制作一個用于表示成像過程卷積運算的表征顯微鏡光學系統(tǒng)的 三維點擴散函數匕，并制作不同空間大小的用于圖像復原的序列三維點擴散函數hi，分別 叩名為 h3、h5、h7、…、hn_2 ; (2) 按式（1)計算步驟（1)中得到的各個不同空間大小三維點擴散函數匕和h的能 量值E，并進行歸一化，
(1) 式中，r表示三維點擴散函數元素的空間坐標（x，y，z)，f(r)為三維點擴散函數在坐標 r (X，y, z)上的灰度值； (3) 用一幅清晰高信噪比細胞圖像作為初始二維樣本，制作相互關聯的序列二維圖像， 并用這些序列二維圖像構建一個清晰仿真樣本三維圖像f ; (4) 用hn與f卷積得到模糊仿真三維成像圖像g ; (5) 用步驟（1)中不同空間大小即相應不同能量大小的三維點擴散函數分別對三維圖 像g進行去卷積復原處理，復原算法采用最大似然法，同時記錄復原效果和處理時間； (6) 去卷積復原處理的復原效果的評價，采用式（2)的改善信噪比ISNR:
(2) 式中，/為三維復原結果圖像，處理時間單位采用秒，計算不同空間大小三維點擴散函 數比對三維成像圖像g進行復原處理的復原效率q ; (7) 對各三維點擴散函數的能量E及相應的復原效率q進行數據擬合，得到q-E關系曲 線. (8) 求q對E的二階導數d2q/dE2,找出二階導數為零的曲線拐點Y，將直角坐標橫軸 上與拐點對應的能量設定為閾值能量E Y，以此確定"起點三維點擴散函數"； (9) 三維點擴散函數的選取，如果復原圖像用于一般觀察瀏覽，選取"起點三維點擴散 函數"或稍大的空間大小的三維點擴散函數進行圖像復原，如果復原圖像用于研究、分析測 量，選取更大空間的三維點擴散函數，對復原圖像的效果要求越高，選取越大空間大小的三 維點擴散函數。
2. 根據權利要求1所述的基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，其 特征在于，步驟（1)所述的用于表示成像過程進行卷積運算的表征顯微鏡光學系統(tǒng)的三維 點擴散函數h n，是一個空間大小為ηΧηΧη的η階三維矩陣，η為兩位數的奇數。
3. 根據權利要求1所述的基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法， 其特征在于，步驟（1)所述制作不同空間大小的用于圖像復原的序列三維點擴散函數4， 是以h n的空間中心點為原點，向四周由小到大分別按3X3X3、5X5X5、7X7X7、···、 (n-2) X (n-2) X (n-2)截取的三維矩陣。
4. 根據權利要求1所述的基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，其 特征在于，步驟（1)所述的用于圖像復原的序列三維點擴散函數匕，它們的歸一化能量值是 以hn的能量值為基準進行歸一化處理得到。
5. 根據權利要求1所述的基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，其 特征在于，步驟（6)所述的復原效率q，由q = ISNR/t計算得到，其中t為以最小空間大小 三維點擴散函數h3的處理時間為基數進行歸一化的歸一化復原處理時間。
6. 根據權利要求1所述的基于能量分布的顯微成像系統(tǒng)三維點擴散函數選取方法，其 特征在于，步驟（8)所述的"起點三維點擴散函數"，是指能量值E大于閾值能量Ε γ的最小 空間的三維點擴散函數。
【文檔編號】G06T5/00GK104123704SQ201410348095
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權日:2014年7月21日
【發(fā)明者】陳華, 蔡熠, 楊鳳娟, 梁日柳, 何雙燕 申請人:廣西大學