專利名稱：用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥工程及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，它控制和協(xié)調(diào)行動(dòng)、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)(例如心跳、血壓、體溫等)以及精神活動(dòng)(例如認(rèn)知、情感、記憶和學(xué)習(xí))。當(dāng)腦發(fā)生疾病時(shí)(如腦中風(fēng)、腦腫瘤等)，會(huì)給身體造成嚴(yán)重的后果，故對(duì)腦疾病的治療是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿攻關(guān)難題。血液與腦組織之間在存在著血腦屏障(blood-brain barrieer, BBB),能有效地限制有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，從而保護(hù)腦組織。它是由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間以緊密連接封閉，內(nèi)皮外有基板、周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞突起的腳板圍繞。內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的主要結(jié)構(gòu)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物可順利通過(guò)，以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。星形膠質(zhì)細(xì)胞有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成屏障特性的作用。腦具有以下特殊的組織結(jié)構(gòu)
①腦毛細(xì)血管缺少一般毛細(xì)血管所具有的孔，或者這些孔既少且小。內(nèi)皮細(xì)胞彼此重疊覆蓋，
而且連接緊密，能有效地阻止大分子物質(zhì)從內(nèi)皮細(xì)胞連接處通過(guò)。②內(nèi)皮細(xì)胞還被一層連續(xù)不斷的基底膜包圍著。③基底膜之外還有許多星形膠質(zhì)細(xì)胞的血管周足(終足)把腦毛細(xì)血管約85%的表面包圍起來(lái)，構(gòu)成了腦組織的防護(hù)性屏障。在病理情況下，如血管性腦水腫時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密粘合處開(kāi)放，由于內(nèi)皮細(xì)胞腫脹重疊部分消失，很多大分子物質(zhì)可隨血漿濾液滲出毛細(xì)血管，這會(huì)破壞腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，造成嚴(yán)重后果。故血腦屏障是藥物進(jìn)入腦組織所需要通過(guò)的屏障。治療腦疾病的藥物需要透過(guò)血腦屏障，進(jìn)入到病灶，達(dá)到一定的血藥濃度才可以發(fā)揮療效。另外，皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等和血腦屏障有著相似的結(jié)構(gòu)，都是上皮細(xì)胞緊密的貼在一起生長(zhǎng)成致密層而形成不同的屏障。上皮細(xì)胞的屏障結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是脂質(zhì)體雙分子層，在此基礎(chǔ)上表達(dá)不同的、特異性的蛋白質(zhì)來(lái)執(zhí)行功能。故各種身體屏障如血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等最終是通過(guò)表達(dá)有不同蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體雙分子類(lèi)晶體結(jié)構(gòu)來(lái)體現(xiàn)并且直接執(zhí)行屏障功能的，故可以用計(jì)算機(jī)軟件模擬以上結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)行藥物的篩選和研究。另外，單純的脂質(zhì)雙分子層可以模擬納米脂質(zhì)體，研究包囊其中的藥物擴(kuò)散釋放行為。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是提供一種計(jì)算機(jī)軟件模擬血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等晶體結(jié)構(gòu)模型，并且可以用于計(jì)算和分析。解決了目前血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)模型復(fù)雜繁瑣，而且不容易重復(fù)等許多問(wèn)題。本發(fā)明所述用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型是用計(jì)算機(jī)軟件NAMD或DS或MS或GR0MACS或AMBER或VMD或CHARMM等建立血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等晶胞結(jié)構(gòu)模型。(I).本發(fā)明所述用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型的制備方法
將大豆磷脂或卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPP)或二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)或二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)或二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)或二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(DPPS)或雙肉豆蘧磷脂酸(DMPA)或雙肉豆蘧磷脂酰絲氨酸(DMPS)或雙肉豆蘧磷脂酰乙醇胺(DMPE)或雙肉豆蘧磷脂酰膽堿(DMPC)或雙肉豆蘧磷脂酰甘油(DMPG)或二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)或二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)或二油酰磷脂酰甘油(DOPG)或二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)或二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)或二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)或膽固醇等，單獨(dú)或按不同比例混合建立血腦屏障的雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)中。將表達(dá)在血腦屏障上的ZO-1或Z0-2或Z0-3或occluding或claudin或junctionadhesion molecular (JAM)或P_gp等蛋白加入到上述雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)中，構(gòu)成血腦屏障模型。將表達(dá)在皮膚屏障上的hCTLA4_Ig或K3 / K12等蛋白加入到上述雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)中，構(gòu)成皮膚屏障模型。將胃腸道、鼻、口腔等粘膜表面表達(dá)的粘蛋白MUCI或MUC2或MUC3或MUC4或MUC5AC或MUC6或Cytokeratins等蛋白加入到上述雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)中，構(gòu)成胃腸道粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜等屏障模型。將表達(dá)在神經(jīng)突觸前膜或后膜屏障上的突觸素synaptophysin或synapsin或synaptobrevin或synaptotagmin或synaptoporin或SERT等蛋白加入到上述雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)中，構(gòu)成神經(jīng)突觸前膜或后膜模型。根據(jù)細(xì)胞和細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的種類(lèi)和特征將細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)表面特異性表達(dá)的蛋白加入到上述雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)中，構(gòu)成各種特異性細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模型。將要篩選的藥物加入到以上模型中可用來(lái)篩選出透血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等的有效成分，通過(guò)擴(kuò)散系數(shù)，判定藥物透過(guò)以上結(jié)構(gòu)屏障的能力大小。另外，不加任何蛋白質(zhì)的雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)，模擬納米脂質(zhì)體或類(lèi)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，模擬藥物從脂質(zhì)體或類(lèi)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中擴(kuò)散和釋放過(guò)程。( 2 )本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是
目前，國(guó)內(nèi)外建立各種血腦屏障用于新藥開(kāi)發(fā)和科研試驗(yàn)。
①活體腦組織中藥物的檢測(cè)
用透析裝置取腦組織液測(cè)定藥物濃度，計(jì)算透血腦屏障百分率。②離體腦組織中藥物的檢測(cè)
分離腦組織，制備勻漿，測(cè)定腦組織中藥物的濃度，計(jì)算藥物透血腦屏障的百分率。③細(xì)胞培養(yǎng)
用腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)，形成致密層，模擬血腦屏障，用Transwell裝置進(jìn)行試驗(yàn)。這種方法目前廣為用于科研，但離體細(xì)胞模型和體內(nèi)的環(huán)境存在著比較大的差異。以上三種方法是常用的研究藥物透血腦屏障的體內(nèi)外模型，各有利弊。皮膚屏障一般采用活體動(dòng)物(大鼠、小鼠等)皮膚或離體動(dòng)物皮膚，需要脫毛處理后用藥。體內(nèi)取血漿，測(cè)定血藥濃度；體外將離體皮膚夾在擴(kuò)散池樣品池和擴(kuò)散池中間，測(cè)定擴(kuò)散到下層擴(kuò)散池中的藥物濃度等步驟。胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障一般也采用活體或者分離局部粘膜用于試驗(yàn)。神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)可以直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，熒光標(biāo)記后，研究藥物的透過(guò)率。但體內(nèi)研究都存在試驗(yàn)繁瑣，成本高，不容易重復(fù)等，不利于快速篩選的缺點(diǎn)。而本發(fā)明所述計(jì)算機(jī)軟件建立的血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等可以更好更快捷的篩選出有效的藥物，推動(dòng)腦疾病、皮膚疾病、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病治療藥物研究的深入發(fā)展。藥物從脂質(zhì)體中擴(kuò)散，釋放行為是藥劑領(lǐng)域中非常重要的檢測(cè)指標(biāo)，用計(jì)算機(jī)軟件建模后分析計(jì)算，可以了解藥物從脂質(zhì)體中釋放的快慢。比用常規(guī)的透析袋或透析盒測(cè)定釋放行為要方便快捷得多。計(jì)算機(jī)軟件NAMD或DS或MS或GR0MACS或AMBER或VMD或CHARMM等建立血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等的晶體結(jié)構(gòu)模型。再用NAMD或DS或MS或GR0MACS或AMBER或VMD或CHARMM等軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)分析均方位移等指標(biāo)，計(jì)算出擴(kuò)散系數(shù)等參數(shù)，可以檢測(cè)待篩選或比較藥物對(duì)血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等的透過(guò)作用能力的大小。這個(gè)計(jì)算機(jī)軟件建立的屏障模型平臺(tái)，能快速、有效地篩選出透血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)等的有效藥物，故在新藥篩選方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，可以模擬納米脂質(zhì)體或類(lèi)脂質(zhì)體中藥物的擴(kuò)散、釋放行為，故在藥物制劑領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1用DMPC建立的脂質(zhì)雙分子層晶胞結(jié)構(gòu)(3D圖的平面快照?qǐng)D)
圖2在DMPC建立的脂質(zhì)雙分子層晶胞結(jié)構(gòu)中加入表達(dá)在血腦屏障上的ZO-1蛋白(用solid ribbon顯示),形成血腦屏障模型(3D圖的平面快照?qǐng)D)
圖3藥物川芎嗪(用CPK表示)透血腦屏障模型過(guò)程(3D圖的平面快照?qǐng)D)
圖4藥物川芎嗪(用CPK表示)在血腦屏障立體晶體模型中
具體實(shí)施例方式下面以血腦屏障模型為代表，用藥物川芎嗪進(jìn)行應(yīng)用實(shí)施。其它的皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜(還包括線粒體膜、葉綠體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等)、脂質(zhì)體等模型及藥物的作用模式是類(lèi)似的。實(shí)施例1DMPC建立的脂質(zhì)雙分子層晶胞結(jié)構(gòu)
DMPC按照極性自組裝，形成極性基團(tuán)分布在脂質(zhì)體雙分子的外層，非極性的兩條長(zhǎng)長(zhǎng)的碳鏈(灰白色表示)對(duì)稱分布在內(nèi)層。這和生物體中的脂質(zhì)雙分子層類(lèi)晶體結(jié)構(gòu)是相似的。(圖1)。實(shí)施例2在DMPC建立的脂質(zhì)雙分子層晶胞結(jié)構(gòu)中加入各自特異性蛋白，形成屏障模型
現(xiàn)在DMPC建立的脂質(zhì)雙分子層晶胞結(jié)構(gòu)中加入表達(dá)在血腦屏障上的ZO-1蛋白，形成血腦屏障模型(圖2)。實(shí)施例3藥物川芎嗪作用于血腦屏障模型
將藥物川芎嗪加入到已建立好的血腦屏障模型中(圖3)，用計(jì)算機(jī)軟件MS進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬、分析、計(jì)算。實(shí)施例4藥物川芎嗪放入血腦屏障立體模型中
選用DMPC建立脂質(zhì)雙分子層晶體結(jié)構(gòu)，將一定比例數(shù)量的DMPC分子(10 40個(gè))放入到設(shè)定大小的立體晶體模擬盒中，再加入I個(gè)ZO-1蛋白和I 6個(gè)川芎嗪(圖4)，最后進(jìn)行能量最小化。實(shí)施例5分子動(dòng)力學(xué)模擬
先運(yùn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬程序NVT，平衡準(zhǔn)備擴(kuò)散的晶胞，溫度298K，時(shí)間步長(zhǎng)O. 5 Ifs,總模擬步長(zhǎng)I 20萬(wàn)，達(dá)到溫度平衡和能量平衡。然后再運(yùn)行另外一個(gè)分子動(dòng)力學(xué)程序NVE，溫度298K，時(shí)間步長(zhǎng)O. 5 lfs，總模擬步長(zhǎng)I 20萬(wàn)，重復(fù)3 4次。用于軌跡分析,分析均方位移(mean square diaplacement,MSD ) ο實(shí)施例6分析均方位移
運(yùn)行Forcite下的Analysis進(jìn)行分析，輸出數(shù)據(jù)到電子文檔，畫(huà)出Log(MSD)與Log(Time)曲線,得到一條直線。線性擬合為Y = aX+b,記下a值。實(shí)施例7計(jì)算擴(kuò)散系數(shù) 擴(kuò)散系數(shù)公式
d涉多而〉
式中的微分近似用MSD對(duì)時(shí)間微分的比例來(lái)代替，也就是曲線的斜率a。N為系統(tǒng)中擴(kuò)散原子的數(shù)目，MSD的值已對(duì)擴(kuò)散原子數(shù)N做了平均。故公式可以簡(jiǎn)化為D = a/6
計(jì)算的結(jié)果在1. OX 10—5 4. OX IO-5Cm2S-1O
權(quán)利要求
1.一種用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型，其特征是用計(jì)算機(jī)軟件NAMD或DS或MS或GROMACS或AMBER或VMD或CHARMM建立血腦屏障或皮膚屏障或胃腸道或鼻、口腔粘膜屏障或神經(jīng)突觸前后膜或線粒體或葉綠體膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或核膜晶胞結(jié)構(gòu)模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型的制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成 (1)·取大豆磷脂或卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酸DPPA或二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPP或二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺DPPE或二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC或二棕櫚酰磷脂酰甘油DPPG或二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸DPPS或雙肉豆蘧磷脂酸DMPA或雙肉豆蘧磷脂酰絲氨酸DMPS或雙肉豆蘧磷脂酰乙醇胺DMPE或雙肉豆蘧磷脂酰膽堿DMPC或雙肉豆蘧磷脂酰甘油DMPG或二月桂酰磷脂酰甘油DLPG或二月桂酰磷脂酰膽堿DLPC或二油酰磷脂酰甘油DOPG或二油酰磷脂酰膽堿DOPC或二硬脂酰磷脂酰膽堿DSPC或二硬脂酰磷脂酰甘油DSPG或膽固醇，單獨(dú)或按不同比例混合建立雙層脂質(zhì)體晶胞結(jié)構(gòu)模型； (2).將(I)建立的脂質(zhì)雙分子層晶胞結(jié)構(gòu)中，插入血腦屏障或皮膚屏障或胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障或神經(jīng)突觸前后膜或線粒體膜或葉綠體膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或核膜上表達(dá)的特異性相關(guān)蛋白即脂蛋白或糖蛋白后，模擬血腦屏障或皮膚屏障或胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障或神經(jīng)突觸前后膜或線粒體膜或葉綠體膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜屏障模型； (3).將(2)建立的屏障模型結(jié)構(gòu)中加入不同的藥物即中藥有效成分或中藥復(fù)方或化合物或蛋白質(zhì)或多肽、或小肽或基因或microRNA后，用計(jì)算機(jī)軟件NAMD或DS或MS或GROMACS或AMBER或VMD或CHARMM進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)分析均方位移Mean SquareDisplacement, MSD計(jì)算出擴(kuò)散系數(shù)，檢測(cè)它們血腦屏障或皮膚屏障或胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障或神經(jīng)突觸前后膜或線粒體膜或葉綠體膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或核膜透過(guò)作用能力的大??； (4).加入川芎嗪實(shí)施對(duì)應(yīng)用血腦屏障透過(guò)作用。
3.權(quán)利要求1所述用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型在藥物篩選中的應(yīng)用，該模型平臺(tái)，能快速有效地篩選出透血腦屏障或皮膚屏障或胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障或神經(jīng)突觸前后膜或線粒體膜或葉綠體膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或核膜的有效藥物，用于進(jìn)一步的藥理實(shí)驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥工程及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用軟件建立體內(nèi)屏障晶體結(jié)構(gòu)模型及其制備方法和應(yīng)用。用計(jì)算機(jī)軟件NAMD或DS或MS或GROMACS或AMBER或VMD或CHARMM等分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)分析均方位移等,計(jì)算出擴(kuò)散系數(shù)等，可以檢測(cè)待篩選或研究的藥物對(duì)血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜透過(guò)作用能力的大小。這個(gè)體外計(jì)算機(jī)建立的模型平臺(tái)，能快速、有效地篩選出透血腦屏障、皮膚屏障、胃腸道、鼻、口腔粘膜屏障、神經(jīng)突觸前后膜、細(xì)胞膜的有效藥物，故在新藥篩選方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，可以模擬納米脂質(zhì)體或類(lèi)脂質(zhì)體中藥物的擴(kuò)散、釋放行為，故在藥物制劑領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G06F19/00GK103020483SQ201310005750
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者夏紅梅, 徐銀祥, 程志清, 劉亞琴 申請(qǐng)人:安徽中醫(yī)學(xué)院