一種馬兜鈴酸a快速檢測卡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及一種馬兜鈴酸A快速檢測卡，是一種檢測馬兜鈴酸A的檢測器具，屬于馬兜鈴酸A檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]馬兜鈴酸類化合物是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物特有的一類硝基菲類化合物，包括馬兜鈴酸A、B、C和D等。在我國作為藥用的馬兜鈴科馬兜鈴屬植物包括馬兜鈴、關(guān)木通、廣防己、朱砂蓮、大葉馬兜鈴、漢中防己、尋骨鳳等，這些中藥含有馬兜鈴酸及其硝基菲類有機酸衍生物或馬兜鈴內(nèi)酰胺成分。早期發(fā)現(xiàn)此類化合物可以抑制腫瘤細(xì)胞，后又發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、消炎、祛痰、利尿、調(diào)節(jié)血壓等作用以及可預(yù)防化、放療引起的白細(xì)胞減少，因此此類中藥在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。
[0003]近年來，馬兜鈴酸的腎毒性已引起廣泛關(guān)注，各國紛紛對含馬兜鈴酸的中藥采取管制及限制措施。研宄表明馬兜鈴酸類化合物的毒性主要由馬兜鈴酸A或其代謝物馬兜鈴內(nèi)酰胺所致。因此，在檢測馬兜鈴酸時，常選擇馬兜鈴酸A為指標(biāo)性成分。目前，檢測馬兜鈴酸的方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法及酶聯(lián)免疫分析法等。薄層色譜法和紫外分光光度法靈敏度較低；高效液相色譜法靈敏度較高、測定準(zhǔn)確，是目前測定馬兜鈴酸最常用的方法，但儀器設(shè)備昂貴，對實驗人員專業(yè)技能要求高。例如:
[0004]對比文件CN102579961A公開了一種消腫止痛酊中馬兜鈴酸A的質(zhì)量控制方法，該對比文件是運用高效液相色譜儀進行檢測。
[0005]對比文件公開了 CN103063799A公開了一種龍膽瀉肝顆粒有效成分的檢測方法，通過高效液相色譜儀對馬兜鈴酸A的含量進行檢測，更有利于降低其毒副作用。
[0006]因此克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，研發(fā)一種準(zhǔn)確可靠又快速方便的檢測食品中馬兜鈴酸A的檢測器具是非常必要的。
[0007]本實用新型擬提供一種基于小分子物質(zhì)馬兜鈴酸A偶聯(lián)蛋白質(zhì)后而具有抗原性的免疫學(xué)檢測方法，采取免疫學(xué)競爭法的原理，結(jié)合膠體金(或乳膠顆粒)標(biāo)記技術(shù)和免疫層析法設(shè)計的一種快速檢測器具，可快速特異地檢測中藥材或中成藥中的馬兜鈴酸A。根據(jù)檢測卡樣品檢測線(T)和質(zhì)控線(C)的有無顯色來判定樣品中的馬兜鈴酸A含量。反應(yīng)是利用馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物抗原性而建立的一種檢測方法，具有特異性強的優(yōu)點，可避免其它檢測方法的假陽性導(dǎo)致的誤檢問題。同時檢測卡操作簡單快速，無需特殊的儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場操作。由于樣本量需要少、簡便快速，適用于大量樣本的篩查。結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，準(zhǔn)確率大。
【實用新型內(nèi)容】
[0008]本實用新型的目的在于提供一種能快速檢測馬兜鈴酸A的檢測器具，直接應(yīng)用免疫學(xué)的方法檢測中藥材或中成藥中馬兜鈴酸A的含量，克服現(xiàn)有色譜法檢測的操作繁瑣等缺點，建立基于免疫學(xué)特異性的檢測方法。
[0009]為解決本實用新型的技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案如下:
[0010]一種馬兜鈴酸A快速檢測卡包括在長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼和設(shè)置在外殼中的測試條；所述檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔；所述測試條是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片，由支承背板上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊、膠體金膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成；所述支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，所述支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣品墊，所述吸水膜內(nèi)端與所述樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在所述樣品墊與硝酸纖維素膜的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段膠體金膜；所述膠體金膜為抗馬兜鈴酸A抗體膠體金標(biāo)記的玻璃纖維膜；所述硝酸纖維素膜上依次設(shè)有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，所述檢測帶為含馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測帶；所述質(zhì)控帶為含抗鼠抗體或抗兔抗體的質(zhì)控帶；所述測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，所述樣品墊正對加樣孔，所述硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0011]所述膠體金膜也可以為乳膠顆粒膜，所述乳膠顆粒膜為含抗馬兜鈴酸A抗體乳膠顆粒標(biāo)記的玻璃纖維膜。
[0012]優(yōu)選地，所述檢測卡外殼由殼蓋與殼座兩半聯(lián)接構(gòu)成，所述檢測窗孔和加樣孔開設(shè)在所述檢測卡外殼殼蓋上。
[0013]優(yōu)選地，所述長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼由長70mm，寬20mm，厚5mm，薄殼壁厚Imm的工程塑料制成。
[0014]優(yōu)選地，所述測試條片長60mm，片寬4mm，厚度2.5mm。
[0015]優(yōu)選地，所述支承背板，為聚氯乙稀塑料薄片，厚約0.5mm，長60mm，寬4mm。
[0016]優(yōu)選地，所述樣品墊為吸水玻璃纖維膜，厚0.5-0.8mm，長20mm，寬4臟。
[0017]優(yōu)選地，所述膠體金膜厚0.5-0.8mm,長5mm，寬4mm。
[0018]優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜厚0.5mm，長20_25mm，寬4mm ;所述檢測帶和質(zhì)控帶在所述硝酸纖維素膜上橫向間隔開排列。
[0019]優(yōu)選地，所述吸水膜為吸水紙，厚0.5-0.8mm，長16_20mm，寬4臟。
[0020]優(yōu)選地，所述膠體金膜、樣品墊及吸水膜與所述硝酸纖維素膜的搭接長度為1-2mmο
[0021]采用上述馬兜鈴酸A快速檢測卡快速檢測馬兜鈴酸A的檢測方法，是應(yīng)用免疫學(xué)的方法直接檢測待檢樣品中馬兜鈴酸A的含量，待檢樣品為川木通、廣防己、關(guān)木通等中藥材或含有馬兜鈴酸藥材的中成藥，具體處理方法如下:
[0022]①提取樣品液:取川木通、廣防己、天仙藤、青木香、關(guān)木通和馬兜鈴等中藥材磨成細(xì)粉，過60目篩(0.30mm孔徑)，稱取0.5g ;中成藥如雙香排石顆粒、龍膽瀉肝丸等1.0g于試管中。以5mL甲醇浸提，超聲15min，以4000r/min離心1min取上清液，甲醇重復(fù)提取一次，合并兩次所得溶液，氮氣吹干，以20mL無水甲醇或0.0lmol/LPBS溶解殘余物，即得馬兜鈴酸提取液。
[0023]②檢測卡檢測:先將所述馬兜鈴酸提取液從所述加樣孔中滴注入所述馬兜鈴酸A快速檢測卡的樣品墊上，由于虹吸作用原理，帶動所述馬兜鈴酸提取液及膠體金膜中所含的抗馬兜鈴酸A抗體膠體金標(biāo)記物一起向所述硝酸纖維素膜擴散，5-10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
[0024]③檢測結(jié)果對比:檢測卡的主要反應(yīng)是免疫學(xué)的抗原和抗體反應(yīng)，在所述加樣孔中加入馬兜鈴酸提取液后，在硝酸纖維素膜上迀移的膠體金標(biāo)記的抗馬兜鈴酸A抗體，在測試帶上分別與檢測帶含馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，以及質(zhì)控帶所含有的抗兔抗體或抗鼠抗體反應(yīng)，形成棕紅色條帶。若樣品中有待檢馬兜鈴酸A存在，當(dāng)樣品加入后即與質(zhì)控帶所含有的抗兔抗體或抗鼠抗體發(fā)生反應(yīng)，而不會與檢測帶241所含的馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物反應(yīng)，從而不顯色。主要反應(yīng)的結(jié)果有以下3種情況:
[0025]a、當(dāng)檢測帶和質(zhì)控帶同時顯現(xiàn)棕紅色印跡帶，檢測結(jié)果為陰性，表示被檢測樣品中馬9?鈴酸A含量未超標(biāo)(< 10 μ g/g)；
[0026]b、當(dāng)檢測帶不顯示顏色，只有質(zhì)控帶顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢測結(jié)果為陽性，表示被檢測樣品中馬9?鈴酸A含量超標(biāo)(> 10 μ g/g)；
[0027]C、當(dāng)檢測帶和質(zhì)控帶均不顯色，則表明測試條已失效。
[0028]本實用新型的有益效果:本實用新型能快速、特異地檢測中藥材或中成藥中含有的馬兜鈴酸A，本實用新型易于制備且節(jié)省檢測費用，使用方便，檢測快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0029]為了更清楚地說明本實用新型實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本實用新型的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030]圖1為本實用新型馬兜鈴酸A快速檢測卡外殼及測試條在外殼內(nèi)的安置示意圖；
[0031]圖2為本實用新型的馬兜鈴酸A快速檢測卡的測試條結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032]圖3為本實用新型的馬兜鈴酸A快速檢測卡的測試條的硝酸纖維素膜上顯示印跡示意圖；
[0033]附圖標(biāo)注說明:
[0034]1、外殼；11、檢測窗孔；12、加樣孔；
[0035]2、測試條；21、支承背板；22、樣品墊；23、膠體金膜(或乳膠顆粒膜)；24、硝酸纖維素膜；25、吸水膜；241、檢測帶；242、質(zhì)控帶。
【具體實施方式】
[0036]以下面結(jié)合附圖以及具體實施例對本實用新型作進一步描述:
[0037]一、抗馬兜鈴酸A抗體的制備實施例
[0038]1、馬兜鈴酸A免疫抗原和包被抗原的制備
[0039]稱取80mg馬兜鈴酸A，加入15mg戊二酸酐，溶于4ml吡啶，室溫下反應(yīng)24小時。然后用氮氣吹干，加入8ml 二甲基亞砜一二氧六環(huán)(1:1)，加入60 μ L三丁胺，水浴攪拌10分鐘，再加入30 μ L氯甲酸異丁酯，攪拌I小時。冷浴下逐滴加入到10mg溶于ρΗ8.5硼酸鹽緩沖液的牛血清白蛋白(BSA)或70mg溶于ρΗ8.5硼酸鹽緩沖液的雞卵清白蛋白(OVA)，室溫下反應(yīng)12小時，反應(yīng)產(chǎn)物用0.01mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析3d，冷凍干燥，-20°C保存。
[0040]2、制備抗馬兜鈴酸A單克隆抗體；
[0041]2.1動物免疫；
[0042]用無菌PH7.5的PBS液將合成的免疫原馬兜鈴酸A-OVA偶聯(lián)物溶解，然后按免疫原與弗氏佐劑體積按1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗；首次免疫用弗氏完全佐劑，對8?10周齡Balb/c小鼠進行免疫，頸背部皮下多點注射，免疫劑量為100 μ L/只；14天后采用弗氏不完全佐劑第二次免疫，免疫劑量60 μ L/只；以后相繼免疫4次；第6次免疫后加強免疫，不加佐劑，直接采用生理鹽水免疫；
[0043]2.2細(xì)胞融合與培養(yǎng)；
[0044]將產(chǎn)生馬兜鈴酸A特異性抗體的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按5:1體積比例混合，將混合好的細(xì)胞離心，倒干上清液，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37 °C水浴，在Imin內(nèi)加入Iml融合劑聚乙二醇0.8mL，輕輕混勻細(xì)胞，靜置90Sec，加入DMEM無血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)，加入速度為前2min lml/min，第3min 2ml/min，