癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備的方法。利用蠟打印技術(shù)制備紙芯片，在熒光層工作區(qū)域生長(zhǎng)金納米棒和多孔銀及適配體，進(jìn)而進(jìn)行癌細(xì)胞的捕獲，利用多枝鏈雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)信號(hào)分子的放大，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的精確測(cè)量，將制備好的紙芯片折疊，在反應(yīng)區(qū)域滴加顯色溶液，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的可視化的預(yù)測(cè)定。隨后加入多糖抑制劑，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面多糖的動(dòng)態(tài)表征。
【專利說明】
癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及低成本、易于攜帶、可視化的癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是一種能夠檢測(cè)癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖的熒光/比色雙模式傳感器制備，本發(fā)明還涉及采用了多枝雜交鏈信號(hào)放大技術(shù)?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]近年來，癌癥已經(jīng)成了人類的頭號(hào)殺手，極大地威脅著人類健康，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散是癌癥致命的重要原因，因此及早檢測(cè)和及時(shí)治療是克服癌癥的根本方法。多糖是細(xì)胞表面的重要結(jié)構(gòu)，多糖通過與蛋白或脂質(zhì)共價(jià)作用高密度的分布在細(xì)胞膜表面和內(nèi)部。 細(xì)胞表面糖蛋白的動(dòng)態(tài)變化與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、分化密切相關(guān)，因此對(duì)細(xì)胞表面多糖的檢測(cè)具有重要意義。目前，很多方法(如高效液相色譜、質(zhì)譜、核磁共振等)被應(yīng)用于多糖的分析，但是這些方法的破壞性很強(qiáng)，使活細(xì)胞表面多糖表達(dá)的動(dòng)態(tài)表征不可行。此外，這些方法費(fèi)時(shí)，需要復(fù)雜的樣品前處理和昂貴的儀器。而微流控紙基分析設(shè)備可視化的比色檢測(cè)與熒光檢測(cè)的聯(lián)合實(shí)現(xiàn)了低成本、易于攜帶、可視化的初檢及精確測(cè)定的完美結(jié)合。
[0003]為了提高癌細(xì)胞及多糖檢測(cè)的靈敏度，我們采用了多枝雜交鏈反應(yīng)，與傳統(tǒng)的雜交鏈反應(yīng)不同，多枝雜交鏈反應(yīng)可以產(chǎn)生多支臂的長(zhǎng)的產(chǎn)物，它可以吸附更多的信號(hào)分子從而實(shí)現(xiàn)有效的信號(hào)放大。同時(shí)為了提高癌細(xì)胞及多糖比色檢測(cè)的靈敏度，采用貴金屬?gòu)?fù)合納米材料作為模擬酶，因其比表面積大、生物相容性好，催化性能高等優(yōu)點(diǎn)，在科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域引起了巨大的關(guān)注。生長(zhǎng)有這種貴金屬?gòu)?fù)合納米材料的紙芯片，不僅增加了紙芯片的比表面積，而且有效降低了紙的背景熒光。更由于不同組分之間的協(xié)同和電子效應(yīng)使其催化性能大大的提高，因而廣泛應(yīng)用于各種類型的生物傳感器中。采用量子點(diǎn)作為熒光生物探針，由于其獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，如生物相容性好，易制備，寬的激發(fā)光譜，抗光漂白， 窄的、對(duì)稱的、可調(diào)的發(fā)射光譜，使得量子點(diǎn)用于標(biāo)記生物材料，比使用有機(jī)熒光染料具有更好的熒光特性。用量子點(diǎn)補(bǔ)充或部分取代有機(jī)熒光標(biāo)記材料，將可以開創(chuàng)超靈敏、高穩(wěn)定的以及長(zhǎng)發(fā)光壽命的生物分析檢測(cè)技術(shù)。鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，量子點(diǎn)必將成為最有前途的熒光標(biāo)記物，因而量子點(diǎn)替代熒光染料作為熒光標(biāo)記物大大提高了活細(xì)胞表面多糖的檢測(cè)的可行性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種長(zhǎng)有金納米棒和多孔銀的紙芯片及鉑銅納米鏈和氧化石墨烯量子點(diǎn)修飾的多枝雜交鏈信號(hào)放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)熒光/比色雙模式傳感器的制備方法， 用于癌細(xì)胞及癌細(xì)胞表面多糖的快速、靈敏檢測(cè)。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過一種長(zhǎng)有金納米棒和多孔銀的紙芯片及鉑銅納米鏈和氧化石墨烯量子點(diǎn)修飾的多枝雜交鏈信號(hào)放大技術(shù)來實(shí)現(xiàn)的，其特征是包括以下步驟:(1)設(shè)計(jì)紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區(qū)域和親水工作區(qū)域(附圖1);(2)在a熒光層的工作區(qū)域生長(zhǎng)金納米棒和多孔銀層；(3)將適配體鏈固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區(qū)域，隨后采用牛血清白蛋白封閉活性位點(diǎn)，最后適配體鏈捕獲癌細(xì)胞；(4)將鉬銅(PtCu)納米鏈和石墨稀量子點(diǎn)(GQDs)修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區(qū)域；(5)如附圖2所示，將步驟(4)所得的紙芯片折疊，在13比色層的工作區(qū)域滴加顯色底物、 pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫，進(jìn)行比色預(yù)測(cè)定；(6)精確熒光測(cè)定:將步驟(4)所得的紙芯片放入熒光設(shè)備中，在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和發(fā)射波長(zhǎng)460 nm下進(jìn)行焚光測(cè)定；(7)在步驟(4)所得的紙芯片工作區(qū)域滴加10~30 yL多糖抑制劑衣霉素；(8)將步驟(7)所得的紙芯片用于細(xì)胞表面糖基的測(cè)定，重復(fù)步驟(5)和步驟(6)。[00〇6] 本發(fā)明所設(shè)計(jì)焚光/比色雙模式紙芯片圖案用Adobe illustrator CS4軟件設(shè)計(jì)紙芯片的疏水蠟打印圖案，所用紙芯片的紙為色譜紙。
[0007]本發(fā)明所述熒光層的工作區(qū)域生長(zhǎng)金納米棒和多孔銀層的步驟為:(1)合成金種子:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 °C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應(yīng)1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至溶液變?yōu)榫萍t色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區(qū)域，在室溫下放置45 min;(2)合成金納米棒和多孔銀層:取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴加到已經(jīng)有金種子的工作區(qū)域，室溫下生長(zhǎng)10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長(zhǎng)有金納米棒的紙上，室溫下生長(zhǎng)10 min;最后，用水徹底清洗，室溫下干燥30 min，制得紙芯片上金納米棒和多孔銀層。
[0008]本發(fā)明所述的將適配體鏈固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區(qū)域，隨后采用牛血清白蛋白封閉活性位點(diǎn)，最后適配體鏈捕獲癌細(xì)胞的步驟為:將20 yL適配體固定在金納米棒和多孔銀修飾過的紙芯片工作區(qū)域上，隨后加入20 y L牛血清白蛋白以封閉活性位點(diǎn)，最后加入20 yL不同濃度的癌細(xì)胞。
[0009]本發(fā)明所述的將PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區(qū)域，步驟為:(1) 合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到 100 mL三口燒瓶中，搖勻后超聲15 min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，邊強(qiáng)烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備的2 mg ml/1硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu 納米鏈；(2)合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變?yōu)槌壬?，調(diào)節(jié)pH到中性，即可得到GQDs;(3)PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-伴刀豆球蛋白(1-Con A)和Hl-GQDs用琥珀酰亞胺耦合的方法得到；將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 °C保持10 min，并在30 s 內(nèi)冷卻到4 〇C，隨后，100 yL 1-Con A 加到 1 mL Hl-GQDs 和 H2 (1:1) 中，37 °C反應(yīng)過夜;最后，向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應(yīng)15 min，離心，將得到的產(chǎn)物分散在緩沖溶液中；(4)固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區(qū)域。[0〇1〇]本發(fā)明所述的顯色底物為3，_3,5，_5-四甲基聯(lián)苯胺，鄰苯二胺，2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽。
[0011]本發(fā)明所述的pH為4?6的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液， Tris鹽酸緩沖溶液。[〇〇12]本發(fā)明所述細(xì)胞表面糖基比色預(yù)測(cè)定步驟，分別滴加顯色底物、pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫，進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制灰度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的可視化預(yù)檢，隨后固定細(xì)胞濃度不變，改變衣霉素的濃度，繪制灰度與糖基抑制劑衣霉素濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞表面多糖的可視化預(yù)檢。
[0013]本發(fā)明所述細(xì)胞表面糖基熒光測(cè)定步驟，將紙芯片放入熒光皿中，進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制熒光強(qiáng)度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的精確檢測(cè)，隨后固定細(xì)胞濃度不變，改變衣霉素的濃度，繪制熒光強(qiáng)度與糖基抑制劑衣霉素濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞表面多糖的精確檢測(cè)。
[0014]本發(fā)明的有益效果(1)金納米棒和多孔銀層的使用，增大了比表面積及有效減少紙的背景熒光，提高了檢測(cè)的靈敏度。
[0015](2)多枝雜交鏈的采用，有效實(shí)現(xiàn)了熒光和比色信號(hào)的放大，使信號(hào)得到了大幅度的提尚。
[0016](3)用量子點(diǎn)代替熒光染料，比使用有機(jī)熒光分子具有更好的熒光特性，并開創(chuàng)超靈敏、高穩(wěn)定的以及長(zhǎng)發(fā)光壽命的生物分析檢測(cè)技術(shù)。
[0017](4)通過比色/熒光雙模式生物傳感器的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖的可視化的比色初檢及進(jìn)行精確的熒光測(cè)量。【附圖說明】
[0018]圖1:紙芯片a熒光層和比色層的疏水蠟打印圖案；圖2:紙芯片的尺寸及各層功能;紙芯片的折疊方式。【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1熒光/比色雙模式紙芯片在MCF-7細(xì)胞中的應(yīng)用:(1)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區(qū)域和親水工作區(qū)域，將圖案打印在A4尺寸色譜紙；(2)在步驟(1)所得紙芯片熒光層的工作區(qū)域生長(zhǎng)金納米棒和多孔銀層:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 °C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應(yīng)1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至溶液變?yōu)榫萍t色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區(qū)域，在室溫下放置45 min;取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴加到已經(jīng)有金種子的紙上，在室溫下生長(zhǎng)10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長(zhǎng)有金納米棒的紙孔中，在室溫下生長(zhǎng)10 min;最后，用水徹底清洗，并在室溫下干燥 30 min；(3)將適配體固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區(qū)域，將20 yL適配體固定在金納米棒和多孔銀層修飾過的紙芯片工作區(qū)域上，隨后加入20 yL牛血清白蛋白以封閉活性位點(diǎn)，最后加入20 yL—系列不同濃度的MCF-7細(xì)胞；(4)PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區(qū)域，合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到100 mL三口燒瓶中，搖勾后超聲15 min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，邊強(qiáng)烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備的2 mg ml/1 硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu納米鏈；合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變?yōu)槌壬?，調(diào)節(jié)pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-Con A和Hl-GQDs用琥珀酰亞胺耦合的方法得到；將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 〇C保持10 min，并在30 s內(nèi)冷卻至丨J4 °C，隨后，100 yL 1-Con A加到1 mL Hl-GQDs和H2 (1:1)中，37 °C反應(yīng)過夜;最后， 向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應(yīng)15 min，離心，將得到的產(chǎn)物分散在磷酸鹽緩沖溶液中；固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區(qū)域；(5)將紙芯片放入熒光皿中，進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制熒光強(qiáng)度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞的精確檢測(cè)，將紙芯片折疊，分別滴加30 yL 3，_3，5，_5-四甲基聯(lián)苯胺、pH 為4醋酸-醋酸鈉緩沖液和過氧化氫，進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制灰度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 實(shí)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞的可視化預(yù)檢。
[0020] 實(shí)施例2熒光/比色雙模式紙芯片在MCF-7細(xì)胞表面多糖檢測(cè)中的應(yīng)用:(1)在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區(qū)域和親水工作區(qū)域，將圖案打印在A4尺寸色譜紙；(2)在步驟(1)所得紙芯片熒光層的工作區(qū)域生長(zhǎng)金納米棒和多孔銀層:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 °C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應(yīng)1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至溶液變?yōu)榫萍t色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區(qū)域，在室溫下放置45 min;取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴加到已經(jīng)有金種子的紙上，在室溫下生長(zhǎng)10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長(zhǎng)有金納米棒的紙孔中，在室溫下生長(zhǎng)10 min;最后，用水徹底清洗，并在室溫下干燥 30 min；(3)將適配體固定在步驟(2)所得的紙芯片的工作區(qū)域，將20 yL適配體固定在經(jīng)金納米棒和多孔銀層修飾過的紙芯片工作區(qū)域上，隨后加入20 yL牛血清白蛋白以封閉活性位點(diǎn)，最后加入20 yL固定濃度(106 cells/mL)的MCF-7細(xì)胞；(4)PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟(3)所得的紙芯片的工作區(qū)域，合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到100 mL三口燒瓶中，搖勾后超聲15 min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，邊強(qiáng)烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備的2 mg ml/1 硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu納米鏈；合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變?yōu)槌壬?，調(diào)節(jié)pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-Con A和Hl-GQDs用琥珀酰亞胺耦合的方法得到；將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 〇C保持10 min，并在30 s內(nèi)冷卻至丨J4 °C，隨后，100 yL 1-Con A加到1 mL Hl-GQDs和H2 (1:1)中，37 °C反應(yīng)過夜;最后， 向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應(yīng)15 min，離心，將得到的產(chǎn)物分散在磷酸鹽緩沖溶液中；固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區(qū)域；(5)滴加不同濃度的20 yL糖鏈抑制劑衣霉素；(6)將紙芯片放入熒光皿中，進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制熒光強(qiáng)度與糖鏈抑制劑衣霉素濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞表面多糖的精確檢測(cè)，將紙芯片折疊，分別滴加30 yL 3，_3，5，_5-四甲基聯(lián)苯胺、pH為4醋酸-醋酸鈉緩沖液和過氧化氫，進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制灰度與糖基抑制劑衣霉素濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞表面多糖的可視化預(yù)檢。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備，其特征是包括以下步 驟:1.1設(shè)計(jì)紙芯片熒光層和比色層的疏水蠟打印區(qū)域和親水工作區(qū)域；1.2在a熒光層的工作區(qū)域生長(zhǎng)金納米棒和多孔銀層；1.3將適配體鏈固定在步驟1.2所得的紙芯片的工作區(qū)域，隨后采用牛血清白蛋白封閉 活性位點(diǎn)，最后適配體鏈捕獲癌細(xì)胞；1.4將鉑銅(PtCu)納米鏈和石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)修飾的多枝雜交鏈固定在步驟1.3所 得的紙芯片的工作區(qū)域；1.5如附圖2所示，將步驟1.4所得的紙芯片折疊，在13比色層的工作區(qū)域分別滴加顯色 底物、pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫，進(jìn)行比色預(yù)測(cè)定；1.6精確熒光測(cè)定:再將步驟1.4所得的紙芯片放入熒光設(shè)備中，在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm和 發(fā)射波長(zhǎng)460 nm下進(jìn)行焚光測(cè)定；1.7在步驟1.4所得的紙芯片工作區(qū)域滴加10~30 yL多糖抑制劑衣霉素；1.8將步驟1.7所得的紙芯片用于細(xì)胞表面糖基的測(cè)定，重復(fù)步驟1.5和步驟1.6。2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，用Adobe illustrator CS4軟件來設(shè)計(jì)紙芯片的疏水錯(cuò)打印圖案和親水工作 區(qū)域圖案，所用紙芯片的紙為色譜紙。3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，在a熒光層的工作區(qū)域生長(zhǎng)金納米棒和多孔銀層，具體步驟如下:首先合成金種子:量取160 mL的二次水置于三口燒瓶中，加熱到90 〇C，隨后加入1.6 mL氯金酸，水浴加熱到96 °C，反應(yīng)1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸鈉，并攪拌15 min至 溶液變?yōu)榫萍t色;取20 yL的金種子滴加到熒光層的工作區(qū)域，在室溫下放置45 min;合成金納米棒和多孔銀層:取20.0 yL的1%氯金酸和新鮮制備的200 mM鹽酸羥胺滴 加到已經(jīng)有金種子的紙上，在室溫下生長(zhǎng)10 min;隨后將新鮮制備的20.0 yL 24 mM硝酸銀 和200 mM抗壞血酸滴加到上述已長(zhǎng)有金納米棒的紙孔中，在室溫下生長(zhǎng)10 min;最后，用水 徹底清洗，并在室溫下干燥30 min。4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，所述的將適配體固定在步驟1.2所得的紙芯片的工作區(qū)域，隨后采用牛血清白 蛋白封閉活性位點(diǎn)，最后適配體鏈捕獲癌細(xì)胞，具體制備步驟如下:將20 yL適配體固定在金納米棒和多孔銀修飾過的紙芯片工作區(qū)域上，隨后加入20 yL 牛血清白蛋白以封閉活性位點(diǎn)，最后加入20 y L不同濃度的癌細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，所述的將PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈固定在步驟1.3所得的紙芯片 的工作區(qū)域，具體制備工藝如下:首先合成PtCu納米鏈:將1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化鎳及22 mL二次水加入到 100 mL三口燒瓶中，搖勻后超聲15 min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，邊強(qiáng)烈攪拌邊滴加5 mL新鮮制備 的2 mg ml/1硼氫化鈉，隨后立即加入10 mL 6 mM六氯鉑酸鉀和氯化銅的混合液，將上述溶 液超聲30 min，之后在60 °C水浴鍋中水浴加熱2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu 納米鏈；合成GQDs:稱取2 g檸檬酸放于5 mL燒杯中，加熱到180 °C，溶液顏色變?yōu)槌壬?，調(diào)節(jié)pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:1-伴刀豆球蛋白(Con A)和Hl-GQDs用琥珀酰 亞胺耦合的方法得到;將1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加熱到95 °C保持10 min， 并在30 s 內(nèi)冷卻到4 〇C，隨后，100 yL 1-Con A 加到 1 mL Hl-GQDs 和 H2 (1:1)中，37 0 C反應(yīng)過夜;最后，向上述溶液中加入1 mL PtCu納米鏈，反應(yīng)15 min，離心，將得到的產(chǎn)物 分散在緩沖溶液中；固定PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝雜交鏈:將20 yL PtCu納米鏈和GQDs修飾的多枝 雜交鏈固定在修飾過的紙芯片工作區(qū)域。6.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，所述的顯色底物為3，_3，5，_5-四甲基聯(lián)苯胺，鄰苯二胺，2，2-連氮基-雙-(3-乙 基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽。7.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，pH為4?6的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液，Tri s鹽酸緩沖 溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，樣品的比色預(yù)測(cè)定步驟，分別滴加顯色底物、pH為4?6的緩沖溶液和過氧化氫， 進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制灰度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的可視化預(yù)檢，隨后固定 細(xì)胞濃度不變，改變衣霉素的濃度，繪制灰度與糖鏈抑制劑衣霉素濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞 表面多糖的可視化預(yù)檢。9.根據(jù)權(quán)利要求書1所述癌細(xì)胞及細(xì)胞表面多糖檢測(cè)熒光/比色雙模式紙芯片的制備， 其特征在于，樣品的熒光測(cè)定步驟，將紙芯片放入熒光皿中，進(jìn)行樣品的測(cè)定，繪制熒光強(qiáng) 度與癌細(xì)胞濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的精確檢測(cè)，隨后固定細(xì)胞濃度不變，改變衣霉素 的濃度，繪制熒光強(qiáng)度與糖鏈抑制劑衣霉素濃度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞表面多糖的精確檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106092982SQ201610384836
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日 公開號(hào)201610384836.5, CN 106092982 A, CN 106092982A, CN 201610384836, CN-A-106092982, CN106092982 A, CN106092982A, CN201610384836, CN201610384836.5
【發(fā)明人】葛慎光, 梁琳琳, 于京華, 李麗, 蘭飛飛, 任娜, 劉海云, 張彥, 顏梅
【申請(qǐng)人】濟(jì)南大學(xué)