Ase-uplc測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種ASE?UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，旨在提供一種提取時(shí)間短，且重現(xiàn)性好，提取完全并且可控性強(qiáng)的測(cè)定鹽酸麻黃堿的方法；該方法為：準(zhǔn)確稱取樣品1g置于10mL萃取池中，用正己烷對(duì)樣品進(jìn)行除酯提取，所述的提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時(shí)間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100％，再以甲醇為提取溶劑，提取溫度為80℃，靜態(tài)提取時(shí)間為8min，提取次數(shù)為3次；提取完成后將提取液定容至25mL，吸取1.5mL于裝有300mg PSA的2mL離心管中，漩渦2min，15000r/min離心3min，取上清液進(jìn)行超高效液相分析；線性考查；屬于化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【專利說明】
ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種鹽酸麻黃堿的測(cè)定方法，具體地說，是采用ASE-UPLC測(cè)定通宣 理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法;屬于化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 通宣理肺丸是由紫蘇葉、前胡、桔梗、苦杏仁、麻黃、甘草、陳皮、半夏等^^一味中藥 材組方制成的丸劑，味微甜、略苦，具有解表散寒，宣肺止嗽的功能，用于風(fēng)寒束表、肺氣不 宣的感冒咳嗽，癥見發(fā)熱、惡寒、鼻塞流涕、頭痛、無汗、肢體酸痛。其中麻黃具有發(fā)汗散寒、 宣肺平喘、利水消腫的作用，用于風(fēng)寒感冒、胸悶喘咳、風(fēng)水浮腫，其主要有效成分為鹽酸麻 黃堿?！吨袊?guó)藥典》2015年版一部規(guī)定通宣理肺丸中含量測(cè)定的成分為鹽酸麻黃堿。
[0003] 快速溶劑萃?。ˋSE)是指在密閉容器內(nèi)于高溫（50~200 °C)和高壓（500~ 3000psi)條件下，在短時(shí)間內(nèi)，用有機(jī)溶劑提取固體或半固體樣品的一種新型樣品前處理 方法。與超聲、微波、回流、超臨界萃取等成熟方法相比，ASE有萃取溶劑用量少、提取時(shí)間 短、萃取效率高、操作簡(jiǎn)單方便、安全和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外已有學(xué)者將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng) 用于植物藥定量和定性分析中樣品的前處理，但在中成藥有效成分的定量和定性分析中作 為樣品的前處理方法應(yīng)用較少，用于通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿提取的研究未見報(bào)道味。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提取時(shí)間短，且重現(xiàn)性好，提取完全并且可控性強(qiáng)的 ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：
[0006] -種ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，依次包括下述步驟：
[0007] 1)精密稱定鹽酸麻黃堿對(duì)照品19.77mg，用體積比1:1000的鹽酸和甲醇溶液定容 至50mL容量瓶中，制成0.3942g ? L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；
[0008] 2)準(zhǔn)確稱取樣品lg置于10mL萃取池中，用正己烷對(duì)樣品進(jìn)行除酯提取，所述的提 取溫度為80°C，靜態(tài)提取時(shí)間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100%，再以甲醇為提取溶 劑，提取溫度為80°C，靜態(tài)提取時(shí)間為8min，提取次數(shù)為3次;提取完成后將提取液定容至 25mL，吸取1.5mL于裝有300mg PSA的2mL離心管中，漩禍2min，15000r/min離心3min，取上清 液進(jìn)彳丁超尚效液相分析；
[0009] 3)精密吸取0.3942g ? I/1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液lmL，采用體積比1:1000的鹽酸和甲醇溶液 定容至25mL容量瓶中，制成0.0158g ? I/1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量分別為0.2,0.4,0.6,0.8，1， 1.2yL，平行測(cè)定2次，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度mg進(jìn)行線性回歸，在0.00315~0.0189g ? I/1線性 范圍內(nèi)，線性方程為:Y = 4184.2X+0.3465，線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9998。
[0010] 進(jìn)一步的，上述的ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，所述的萃取儀 為350ASE。
[0011]進(jìn)一步的，上述的ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，所述的超高效 液相色譜儀為Agilent 1290超高效液相色譜儀。
[0012]進(jìn)一步的，上述的ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，所述的分析柱 ACE Excel 2 C18-PFP，流速0.51111.111111-1，柱溫35°(：，檢測(cè)波長(zhǎng)21〇11111，進(jìn)樣量為1此 ;流動(dòng)相 A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1 %磷酸溶液;梯度洗脫程序:0~3.5min，2%A、98; 3.5~4min， 2% ~90%A、98% ~10%B;4~71^11，90%厶、10%8;在2%厶、98%8下平衡2111111。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的ASE法極大限度地節(jié)省了提取時(shí)間，由原來的48h 以上，縮短為40min，且省略了繁瑣的萃取凈化步驟及揮干的過程，減少了鹽酸麻黃堿在提 取和后處理中的降解及損失，保證結(jié)果的可靠性。ASE法提取通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿可 行，適用于通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的提取。
【附圖說明】
[0014]圖1是標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖；
[0015] 圖2通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì) 本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的 權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 本發(fā)明所涉及的到百分含量濃度，除特殊說明外，溶質(zhì)為液體的均為體積濃度，溶 質(zhì)為固定的均為質(zhì)量濃度。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 1儀器與試劑
[0020] ASE350ASE儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；Agilent 1290超高效液相色譜儀，DAD檢 測(cè)器，二元梯度栗，自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司）；XA205DU電子天平(瑞士梅特勒公司）； 31(15高速離心機(jī)(德國(guó)31 8111&);(：1&881(3爪^超純水器(英國(guó)￡11^)。
[0021]鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)171241 -201007);乙腈(色譜 純，德國(guó)Merck公司），其余試劑均為分析純；
[0022] 2實(shí)驗(yàn)部分
[0023] 2.1樣品來源
[0024] 通宣理肺丸（大蜜丸，由廣西梧州三鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)140201、140803、 140850、150901、150702)。
[0025] 2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
[0026] 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精密稱定鹽酸麻黃堿對(duì)照品19.77mg，用鹽酸甲醇溶液（1 - 1000)定 容至50mL容量瓶中，制成0.3942g ? L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。
[0027] 2.3色譜條件
[0028] 分析柱ACE Excel 2C18-PFP(2.1mmX75mm，2wii)，流速0.5ml ? min-S柱溫35°C，檢 測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量為1此。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1 %磷酸溶液;梯度洗脫程序:0~ 3.51^11，2%厶、98%8;3.5~4111111，2%~90%厶、98%~10%8;4~7111111，90%厶、10%8 ;在2% A、98%B 下平衡 2min。
[0029] 2.4實(shí)驗(yàn)方法
[0030] ASE法:準(zhǔn)確稱取樣品lg置于10mL萃取池中，用正己烷對(duì)樣品進(jìn)行除酯（提取溫度 為80°C，靜態(tài)提取時(shí)間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100%)后以甲醇為提取溶劑，提取 溫度為80°C，靜態(tài)提取時(shí)間為8min，提取次數(shù)為3次。提取完成后將提取液定容至25mL，吸取 1.5mL于裝有300mg PSA的2mL離心管中，漩禍2min，15000r/min離心3min，取上清液進(jìn)行超 高效液相分析。
[0031] 3結(jié)果與討論
[0032] 3.1液相色譜條件的選擇
[0033]《中國(guó)藥典》一部中使用0.02mol ? L-1磷酸二氫鉀(含0.2%三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)PH至 2.7)作為水相流動(dòng)相，考慮到使用緩沖鹽以及調(diào)節(jié)流動(dòng)相酸度的不便，嘗試用0.1 %磷酸作 為水相流動(dòng)相，分別米用Phenomenex synergi Polar-RP 80A(4.6mmX 250mm，4iim)、 Agilent ZORBAX SB C18(4.6mmX250mm，5iim)、The;rmo Accucore C18(2.1mmX50mm，2.6ii m)、ACE Excel 2C18-PFP(2.1mmX75mm，2wii)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ACE Excel 2C18-PFP(2.1mmX 75_，2_)分離效果最好、色譜峰形理想，故選用ACE Excel 2C18-PFP(2.1_X75mm，2iim) 為分析柱，結(jié)果見圖1。
[0034] 3.2單因素考察
[0035]取批號(hào)為150702作為考察樣品，影響ASE效率的因素有提取溶劑、提取溫度、提取 時(shí)間、提取次數(shù)等。本實(shí)驗(yàn)考察了這些因素對(duì)通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿提取效率的影響，并 采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)考察某個(gè)單因素時(shí)，只改變?cè)撘蛩氐臈l件，其他條件 不變。提取參數(shù)的考察均以鹽酸麻黃堿HPLC測(cè)定含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。
[0036] 3.2.1提取溶劑和取樣量的選擇:準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸樣品2g，分別用正丁醇、乙 酸乙酯、氨水-正丁醇、氨水-乙酸乙酯、氨水-乙醇-乙酸乙酯（3:10:90)、1.44%磷酸、堿性 甲醇(pH8~9)、甲醇作為提取溶劑，在100°C下萃取5min，萃取3次，考察不同提取溶劑對(duì)鹽 酸麻黃堿提取效果的影響。
[0037]磷酸或堿性甲醇提取效率較高，但基質(zhì)影響較大;氨水-乙醇-乙酸乙酯(3:10:90) 條件下提取效率較高且基質(zhì)影響較小，但考慮酸、堿溶劑對(duì)ASE儀器的影響，故選擇甲醇作 為提取溶劑。
[0038]由于實(shí)驗(yàn)使用的10mL萃取池溶劑沖洗體積有限，對(duì)于2g樣品提取會(huì)不充分，因此 選擇取樣量為lg。
[0039] 3.2.2提取溫度的選擇:準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸樣品lg，用甲醇作為提取溶劑，在80 °C、100°C、120°C下分別提取3次，每次8min，考察不同提取溫度對(duì)鹽酸麻黃堿提取效果的影 響。結(jié)果80 °C、100 °C、120 °C下ASE方法所得到的提取率較藥典提取方法偏低，可能鹽酸麻黃 堿受熱易降解，考慮降低溫度以提高提取效率。
[0040]由于甲醇的沸點(diǎn)約為64°C，結(jié)合ASE的高壓穿透性，故選擇70°C、80°C和90°C對(duì)提 取方法進(jìn)行摸索，考察提取溫度對(duì)通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的提取效率影響。準(zhǔn)確稱取通 宣理肺丸lg，用甲醇作為提取溶劑，在70°C、80 °C和90 °C下分別提取3次，每次8min，考察不 同提取溫度對(duì)鹽酸麻黃堿提取效果的影響。結(jié)果見表1。
[0041 ]表1不同提取溫度對(duì)鹽酸麻黃堿的提取效果
[0043]由以上數(shù)據(jù)可見，溫度對(duì)提取效率的影響較大，在考慮鹽酸麻黃堿的提取效率時(shí)， 應(yīng)充分考慮其高溫降解的影響及其所使用溶劑的熔沸點(diǎn)。時(shí)間對(duì)提取效率也有一定的影 響，時(shí)間過短則提取不完全，時(shí)間過長(zhǎng)則耗時(shí)，不利于提高效率。綜上，根據(jù)選擇的提取溶劑 甲醇可確定溫度在80°C左右，進(jìn)一步優(yōu)化提取溫度與提取時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、雜質(zhì)凈化等因 素，尋求最佳方案。
[0044] 3.3ASE提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果:根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定甲醇為提取溶劑，采 用L9(34)正交試驗(yàn)，以提取溫度/°C(A)、提取時(shí)間/min(B)和提取次數(shù)/次(C)這3個(gè)因素對(duì)通 宣理肺丸中鹽酸麻黃堿提取含量的影響，每個(gè)因素三個(gè)水平，進(jìn)行ASE法提取通宣理肺丸中 鹽酸麻黃堿的條件優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。
[0045] 表2Lg(34)正交試驗(yàn)表及結(jié)果分析
[0047]表3方差分析表
[0049] 由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，影響通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿ASE提取效果的各因素主次 順序?yàn)?C(提取次數(shù))>B(提取時(shí)間）>A(提取溫度），得到最佳提取條件為:A 2B2C2，即稱樣量 為lg，甲醇作為提取溶劑，提取溫度為80°C，提取時(shí)間為8min，提取次數(shù)3次。
[0050] 3.4雜質(zhì)凈化方法：由于樣品通宣理肺丸為大蜜丸，以甲醇作為提取溶劑，處方中 極性小的酯類成分以及丸劑中糖類雜質(zhì)溶出較多，基質(zhì)對(duì)鹽酸麻黃堿液相分析干擾較大， 需要前處理去掉相應(yīng)的雜質(zhì)干擾。
[0051 ] 3.4.1小極性雜質(zhì)凈化方法考察:在《中國(guó)藥典》中鹽酸麻黃堿使用了乙醚進(jìn)行脂 溶性成分的去除，由于乙醚不能適用于ASE法，嘗試用正己烷對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取溫度 為80°C，靜態(tài)提取時(shí)間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分小極性脂類 物質(zhì)被去除，且鹽酸麻黃堿在此條件下沒有損失。
[0052] 3.4.2糖類雜質(zhì)凈化方法考察：嘗試在萃取池底部填充一定量的凈化材料，如硅 膠、中性氧化鋁、堿性氧化鋁、C18、PSA(N-丙基乙二胺)等，在提取的過程中直接凈化樣品。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)硅膠、C18凈化效果較差，中性氧化鋁、堿性氧化鋁的凈化效果較好，隨著氧化鋁的 增加，凈化效果越好，但中性氧化鋁和堿性氧化鋁對(duì)目標(biāo)化合物對(duì)鹽酸麻黃堿有一定吸附 作用，損失率約為15 %~18 %。PSA(N-丙基乙二胺)吸附糖類物質(zhì)效果較好，且基本沒有損 失，但考慮到在萃取池中直接加 PSA的量較大，成本較高，故改用Quechers凈化方法。即對(duì) ASE萃取液定容至25mL后，吸取1.5mL于裝有一定量PSA的2mL離心管中，漩渦2min，15000r/ min離心3min，取上清液進(jìn)行超高效液相分析。
[0053] 3.4.3凈化量考察：分別吸取1.5mLASE萃取液置于裝有50，100，200，300，400， 500mgPSA的2mL凈化管中，漩禍2min，15000r/min離心3min后取上清液進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 300mgPSA凈化效果最好，故確定PSA的凈化量為300mg。
[0054] 3.5方法學(xué)考察
[0055] 3.5.1線性關(guān)系精密吸取0.3942g ? I/1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液lmL，用鹽酸甲醇溶液（1 - 1000)定容至25mL容量瓶中，制成0.0158g ? L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)樣量分別為0.2，0.4，0.6， 0.8，1，1.2此，平行測(cè)定2次，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度mg(X)進(jìn)行線性回歸，在0.00315~ 0.0189g ? L-1線性范圍內(nèi)，線性方程為:Y = 4184.2X+0.3465，線性相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9998。 [0056] 3.5.2方法重復(fù)性和回收率考察:準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸(批號(hào)：150702) lg共6份，再 準(zhǔn)確稱取通宣理肺丸(批號(hào)：150702)0.5g共6份，精確加入鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3mL(含鹽 酸麻黃堿〇. 11826mg)，按2.5.1方法進(jìn)行提取及檢測(cè)。結(jié)果如表4，重復(fù)性RSD為3.0%，加標(biāo) 回收率范圍為92%~102%，由于加標(biāo)方式為將對(duì)照液加入裝有樣品的小燒杯中，混勻并且 硅藻土充分分散后再裝入萃取池中，整個(gè)轉(zhuǎn)移過程可能對(duì)加入量有一定的損失。
[0057] 表4重復(fù)性和回收率測(cè)定
[0059] 3.6用2臺(tái)相同的ASE儀器進(jìn)行儀器對(duì)提取方法的重復(fù)性考察以及ASE法與藥典方 法的比較:分別取通宣理肺丸5個(gè)批次樣品，每個(gè)批次分別取3份，按2.5.1ASE方法進(jìn)行儀器 1和儀器2的處理;取通宣理肺丸5個(gè)批次樣品，每個(gè)批次分別取2份，按2.5.2藥典方法處理， 分別進(jìn)液相進(jìn)行分析。結(jié)果如表5。
[0060] 表5不同儀器驗(yàn)證及ASE法與藥典方法比較

[0063] 兩臺(tái)ASE儀器得到的通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿含量RSD均少于5%，儀器的重現(xiàn)性 好。由以上5批樣的結(jié)果分析可見，藥典方法由于受到環(huán)境溫度，回流速率、時(shí)間，加液體積， 包裝緊密等多種因素的影響，同批樣品同一時(shí)間提取，差異性較大，重現(xiàn)性較差。采用優(yōu)化 后的ASE法提取通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿，結(jié)果的重現(xiàn)性較好，提取較完全并且藥典法的相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5 %以內(nèi)，可控性強(qiáng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，其特征在于，依次包括下述步 驟： 1) 準(zhǔn)確稱取樣品Ig置于IOmL萃取池中，用正己烷對(duì)樣品進(jìn)行除酯提取，所述的提取溫 度為80°C，靜態(tài)提取時(shí)間為5min，提取次數(shù)為1次，沖洗體積100%，再以甲醇為提取溶劑，提 取溫度為80°C，靜態(tài)提取時(shí)間為Smin，提取次數(shù)為3次;提取完成后將提取液定容至25mL，吸 取1.5mL于裝有300mg PSA的2mL離心管中，漩渦2min，15000r/min離心3min，取上清液進(jìn)行 超高效液相分析； 2) 精密吸取0.3942g · IZ1的ImL，采用體積比1:1000的鹽酸和甲醇溶液定容至25mL容量 瓶中，制成0.0158g · I/1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量分別為0.2，0.4，0.6，0.8，I，1.2yL，平行測(cè)定2 次，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度mg進(jìn)行線性回歸，在0.00315~0.0189g · I/1線性范圍內(nèi)，線性方程 為:Y = 4184.2X+0.3465，線性相關(guān)系數(shù) R2 = O. 9998。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，其特征在于， 所述的萃取儀為ASE350。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，其特征在于， 所述的超高效液相色譜儀為Agilent 1290超高效液相色譜儀。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，其特征在于， 所述的分析柱ACE Excel 2C18-PFP，流速0.5ml ·π?η-S柱溫35°C，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量 為IyL;流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1 %磷酸溶液;梯度洗脫程序:0~3.5min，2 % A、98 % B; 3.5~411^11，2%~90%厶、98%~10%8;4~711^11，90%厶、10%8 ;在2%厶、98%8下平衡211^11。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ASE-UPLC測(cè)定通宣理肺丸中鹽酸麻黃堿的方法，其特征在于， 所述的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備方法是精密稱定鹽酸麻黃堿對(duì)照品19.77mg，用體積比1:1000的 鹽酸和甲醇溶液定容至50mL容量瓶中，制成0.3942g · IZ1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105929053SQ201610248239
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】陳學(xué)松, 劉慧妍, 陳翠玲
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗(yàn)所