膠乳增強免疫比濁法檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒，含有試劑R1和試劑R2，其中試劑R1中含有Tris緩沖液，聚乙二醇對異辛基苯基醚，pH為7.0?8.0，試劑R2中含有鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子，Tris緩沖液，牛血清白蛋白；烷基糖苷APG0810，甘露醇，聚乙二醇對異辛基苯基醚，pH值為7.0?8.0。本申請的試劑盒中嚴(yán)格限定了不同粒徑的乳膠顆粒所占的比例，提高了檢測的靈敏度和特異性；得到適合于此體系的表面活性劑和穩(wěn)定劑的組合，從而在測定快速靈敏、特異性高的前提下，整個體系穩(wěn)定性好，操作簡便，可適于臨床全自動或半自動生化分析儀配套使用。
【專利說明】
膠乳増強免疫比濁法檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒， 還涉及所述心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心型脂肪酸結(jié)合蛋白（hFABP)是心臟中富含的一種新型小胞質(zhì)蛋白。它具有高度 心臟特異性(也就是主要在心臟組織中表達），但在心臟以外的組織中也有低濃度表達。心 肌缺血性損傷出現(xiàn)后，hFABP可以早在胸痛發(fā)作后1-3小時在血液中被發(fā)現(xiàn)，6-8小時達到峰 值而且水平在24-30小時內(nèi)恢復(fù)正常。心臟脂肪酸結(jié)合胞質(zhì)蛋白由132個氨基酸組成，分子 量為15kDa。
[0003] hFABP在血清中的正常范圍根據(jù)試驗和方法而定。1991年，Tanaka等人報告正常范 圍為0.0-2.8即/1^ ;1991年，了811」1等人報告正常范圍為0.0-0.6即/1^，而1997年，1〇(^18等 人認為正常范圍是0.3-5ng/mL。1995年，Ohkaru等人報告100位健康受試者的男女平均血清 hFABP水平分別為3.60± 1.73和3.73± 1.92ng/mL。在近期Hasegawa等人的報告中，兒童的 基線血清hFABP水平與以前報道的成人基線血清hFABP水平一致(平均值=3.8，范圍=1.9_ 5.5ng/mL)。在不同研究中臨界濃度不同，從6.2ng/mL到19ng/mL。生理血清hFABP濃度很可 能由損壞的骨骼肌細胞不斷釋放這種蛋白質(zhì)引起。
[0004] 用兩種hFABP特異性單克隆抗體通過夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定血清hFABP濃度?？?以用全血樣本進行一步免疫色譜分析法來快速測量hFABP;獲得血清hFABP水平定性數(shù)據(jù)需 要15分鐘。利用面板試驗，初步結(jié)果顯示對AMI檢測的靈敏度高（93 %)但是特異性低 (43%)。現(xiàn)有技術(shù)中還有免疫比濁測定、免疫傳感器法等測定方，這些方法具有操作繁瑣、 耗時長、過度浪費資源的缺點，不適于常規(guī)檢驗。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中，還有一種膠乳增強免疫比濁法，是公認的特異性和靈敏度較高的檢 測方法。如公開號為CN 102788880 A的中國發(fā)明專利申請，公開了一種心型脂肪酸結(jié)合蛋 白檢測試劑盒，其組成為試劑R1、試劑R2,其中試劑R1包括:200-220mmol/L Tris緩沖液、5-10mmol/L聚乙二醇、l_5mmol/L疊氮鈉、l_5mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋 白；b、試劑R2:200-220mm 〇l/L Tris緩沖液、結(jié)合有心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的乳膠 粒子、l_5mmol/L 吐溫 _20、0.5_3mmol/L 疊氮鈉、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L 牛血 清白蛋白。試劑R2中的心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子中的乳膠顆粒直徑50-100nm。但此專利申請中并沒有公開其檢測靈敏度、特異性等性能，使本領(lǐng)域技術(shù)人員無法 預(yù)測其檢測效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測中存在的操作繁瑣、耗 時長、過度浪費資源、檢測靈敏度特異性不理想的問題，本申請?zhí)峁┝艘环N檢測方便易操 作、時間短、靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強的心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒。
[0007] 血清中的心型脂肪酸結(jié)合蛋白與試劑中的膠乳包被的特異性抗體相結(jié)合，形成抗 原抗體復(fù)合物產(chǎn)生混濁，在一定的抗體濃度范圍內(nèi)，其濁度高低與血清心型脂肪酸結(jié)合蛋 白含量成正比。通過測定在700nm波長的吸光度值，根據(jù)多點定標(biāo)曲線即可求出血清中心型 脂肪酸結(jié)合蛋白的含量。
[0008] 本申請還提供了所述心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑盒的制備方法。
[0009] 本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的：
[0010] 一種膠乳增強免疫比濁法檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白的試劑盒，含有試劑R1和試劑 R2,其中
[0011]試劑R1中含有以下組分：
[0012] Tris 緩沖液 120mmol/L，
[0013] 聚乙二醇對異辛基苯基醚 20mmol/L，
[0014] pH為 7.0-8.0，
[0015] 試劑R2中含有以下組分：
[0016]鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子4.5g/L， Tris 緩沖液 120mmol/L,. 牛血清白蛋白 3mmol/L ;
[0017] 烷基糖苷 APG0810 1. 5g/L, 甘露醇 0.5g/L， 聚乙二醇對異辛基苯基藤 lOmmol/Lj
[0018] pH 值為 7.0-8.0，
[0019] 所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中乳膠顆粒中，直徑10-30nm的乳膠顆粒占總體積的10-30%，30-60nm的乳膠顆粒占總體積的40-60%，60-100nm的 乳膠顆粒占總體積的20-30 %，
[0020] 試劑R1與試劑R2體積比為4:1。
[0021]所述的試劑盒，優(yōu)選所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中乳膠 顆粒中，直徑10-30nm的乳膠顆粒占總體積的10%，30-60nm的乳膠顆粒占總體積的60%， 60-1 OOnm的乳膠顆粒占總體積的30 %。
[0022] 所述的試劑盒，優(yōu)選所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中的乳 膠顆粒中，直徑l〇_3〇nm的乳膠顆粒占總體積的30%，30-60nm的乳膠顆粒占總體積的40%， 60-1 OOnm的乳膠顆粒占總體積的30 %。
[0023] 所述的試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
[0024] (1)制備試劑R1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；
[0025] (2)制備試劑R2:將試劑R2中的Tri s緩沖液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘 露醇、聚乙二醇對異辛基苯基醚溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，后向溶液中加入鼠抗 人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子，充分?jǐn)嚢?，混合均勻，定容?br>[0026]本發(fā)明的有益效果：
[0027] 1、心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP)檢測試劑(膠乳增強免疫比濁法）用于體外定量 測定人體血清中心型脂肪酸結(jié)合蛋白的含量，本申請的試劑盒中使用的鼠抗人心型脂肪酸 結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中的乳膠顆粒中，嚴(yán)格限定了不同粒徑的乳膠顆粒所占的比 例，提高了檢測的靈敏度和特異性；
[0028] 2、由于選用乳膠顆粒的粒徑相差大，所以整個體系的穩(wěn)定性是需要著重解決的問 題，所以在表面活性劑和穩(wěn)定劑的選擇上，發(fā)明人進行了很多嘗試，最終得到適合于此體系 的表面活性劑和穩(wěn)定劑的組合，從而在測定快速靈敏、特異性高的前提下，整個體系穩(wěn)定性 好(可穩(wěn)定12個月），操作簡便，可適于臨床全自動或半自動生化分析儀配套使用。
【具體實施方式】
[0029] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例來進一步說明。
[0030] 實施例1:
[0031] -種膠乳增強免疫比濁法檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白的試劑盒，含有試劑R1和試劑 R2，其中試劑R1中含有以下組分：
[0032] Tris 緩沖液 120mmol/L，
[0033] 聚乙二醇對異辛基苯基醚 20mmol/L，
[0034] pH為 7.0-8.0，
[0035] 試劑R2中含有以下組分：
[0036]鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子4.5g/L，
[0037] Tris 緩沖液 120腿ol/L， 牛血清白蛋白 3mmol/L ； 烷基糖苷 APGQSlfl 1. 5g/L,
[0038] 甘露醇 0.5g/L， 聚乙二醇對異辛基苯基醚 1 Qramo 1./L
[0039] pH 值為 7.0-8.0，
[0040] 所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中乳膠顆粒中，直徑10-30nm的乳膠顆粒占總體積的10 %，30-60nm的乳膠顆粒占總體積的60 %，60-100nm的乳膠顆 粒占總體積的30 %，
[0041 ] 試劑R1與試劑R2體積比為4:1。
[0042] (1)制備試劑R1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；
[0043] (2)制備試劑R2:將試劑R2中的Tri s緩沖液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘 露醇、聚乙二醇對異辛基苯基醚溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，后向溶液中加入鼠抗 人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子，充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆颍ㄈ荨?br>[0044] 實施例2:
[0045] -種膠乳增強免疫比濁法檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白的試劑盒，含有試劑R1和試劑 R2，其中試劑R1中含有以下組分：
[0046] Tris 緩沖液 120mmol/L，
[0047] 聚乙二醇對異辛基苯基醚 20mmol/L，
[0048] pH為7.0-8.0，
[0049] 試劑R2中含有以下組分：
[0050] 鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子4.5g/L， Tris 緩沖液 l:20mmol/L,. 牛血清白蛋白 3mmol/L ;
[0051] 烷基糖苷 APGO810 1.5g/L， 甘露醇 0.5g/L, 聚乙二醇對異辛基苯基醚
[0052] pH 值為 7.0-8.0，
[0053]所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中乳膠顆粒中，直徑10-30nm的乳膠顆粒占總體積的30 %，30-60nm的乳膠顆粒占總體積的40 %，60-1 OOnm的乳膠顆 粒占總體積的30 %，
[0054] 試劑R1與試劑R2體積比為4:1。
[0055] (1)制備試劑R1:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容；
[0056] (2)制備試劑R2:將試劑R2中的Tri s緩沖液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘 露醇、聚乙二醇對異辛基苯基醚溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，后向溶液中加入鼠抗 人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子，充分?jǐn)嚢?，混合均勻，定容?br>[0057] 對比例1:
[0058] 同實施例1相比，鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中乳膠顆粒中， 100 %為30-60nm的乳膠顆粒，其余同實施例1完全相同。
[0059] 對比例2:
[0060] 同實施例1相比，鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中乳膠顆粒中， 100%為60_10011111的乳膠顆粒，其余同實施例1完全相同。
[0061 ] 對比例3:
[0062]同實施例1相比，試劑R2中，將甘露醇替換為烷基糖苷APG0810，其余同實施例1完 全相同。
[0063]性能檢測試驗
[0064] 1、空白吸光度評價(37°(：、70011111、光徑1.0〇11)，見表1〇
[0065]表1空白吸光度
[0067] 2、準(zhǔn)確度
[0068] 在檢測濃度范圍內(nèi)不同濃度的樣品，以市面上公認測試結(jié)果最準(zhǔn)備的試劑作為參 比試劑的測定值為X，本公司試劑的測定值為Y，均為6次測定結(jié)果的平均值，計算a、b，得到 回歸方程Y = aX+b，每份樣品按待測試劑操作方法及比對方法分別檢測。用線性回歸方法計 算每個濃度點的偏差，結(jié)果如下表2。
[0069]表2準(zhǔn)確度的測定
[0071 ]從以上實施例1、2及對比實施例1、2、3的測試結(jié)果相對偏差值可以看出，實施例1、 2的相對偏差數(shù)值比對比實施例1、2、3的相對偏差數(shù)值小，測試結(jié)果更準(zhǔn)確。
[0072] 3、靈敏度
[0073]用已知濃度的樣本測試試劑(盒），記錄在試劑(盒)規(guī)定參數(shù)下產(chǎn)生的吸光度改變 即為吸光度差值(AA)，換算為濃度5ng/mL的吸光度差值，結(jié)果如下表3:
[0074]表3靈敏度的測定
[0076]從表3內(nèi)容可以看出，實施例1、2和對比實施例3靈敏度較好，對比實施例1、2靈敏 度較差，說明乳膠顆粒的粒徑分布，對靈敏度影響較大，而實施例1、2和對比實施例3中選擇 的乳膠顆粒的粒徑分布，使試劑盒具有更高的靈敏度。
[0077] 4、精密度評價
[0078] 重復(fù)性CV值的測定:在重復(fù)性條件下，用控制物質(zhì)（朗道質(zhì)控品，祀值:31.3ng/mL) 測試試劑(盒），重復(fù)測試10次，分別計算測量值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)，結(jié)果如下表4。
[0079] 表4重復(fù)性CV值的測定
[0081]上述結(jié)果表明，本發(fā)明試劑的重復(fù)性均符合規(guī)定的要求(變異系數(shù)CVS5.0%)。 [0082] 5、線性評價
[0083]用接近線性范圍上限的高濃度樣品和接近線性范圍下限的低濃度樣品，混合成6 個稀釋濃度（Xl)。分別測試試劑（盒），每個稀釋濃度測試3次，分別求出檢測結(jié)果的均值 (yi)。以稀釋濃度( Xl)為自變量，以檢測結(jié)果均值(yi)為因變量求出線性回歸方程。計算線 性回歸的相關(guān)系數(shù)(r)，結(jié)果如下表5、6、7。
[0084]表5實施例1試劑盒線性試驗
[0086]表6對比實施例1試劑盒線性試驗
[0088]表7對比實施例2試劑盒線性試驗
[0090] 以上結(jié)果表明實施例1、對比實施例1、2試劑在線性范圍內(nèi)均相關(guān)性良好。
[0091] 6、常規(guī)儲存穩(wěn)定性研究
[0092] 6.1實驗基本情況
[0093] 6.1.1實驗起止時間：
[0094] 2014 年 5 月到2015年6 月。
[0095] 6.1.2實驗批號：
[0096] 對實施例1、對比實施例1、2、3的試劑盒進行實驗。
[0097] 6.1.3產(chǎn)品儲存條件：
[0098] 2~8 °C避光冷藏儲存。
[0099] 6.1.4實驗過程
[0100] 2014年5月到2015年6月，經(jīng)過13個月的嚴(yán)格檢驗，并如實記錄時間數(shù)據(jù)，見下表8、 9、10、11〇
[0101] 6.2實驗結(jié)果匯總
[0102]表8實施例1的實驗結(jié)果：
[0105]表9對比實施例1的實驗結(jié)果：
[0107]表10對比實施例2的實驗結(jié)果：
[0109]表11對比實施例3的實驗結(jié)果：
[0112] 從試驗結(jié)果來看，實施例1試劑的外觀、試劑空白吸光度、分析靈敏度、準(zhǔn)確度均是 最好的，對比實施例1、2隨著時間延長，試劑空白吸光度上升明顯、分析靈敏度、準(zhǔn)確度下降 明顯，對比實施例3試劑初始空白吸光度、分析靈敏度、準(zhǔn)確度好，但隨著時間的延長，由于 穩(wěn)定劑的原因，空白吸光度升高，分析靈敏度、準(zhǔn)確度下降。所以本申請技術(shù)方案中粒徑范 圍同穩(wěn)定劑的組合，是相輔相成、缺一不可的。
[0113] 7、抗干擾性
[0114] 取健康人的血清樣本，每份標(biāo)本單獨做一種干擾物質(zhì)(血紅蛋白、總膽紅素、甘油 三酯、膽固醇、維生素C、脂濁）的試驗，將每份標(biāo)本再分作十份，分別添加不同濃度(如下表 所示)的干擾成份，然后使用實施例1、對比實施例1、2、3的試劑(盒)在規(guī)定參數(shù)下對含有不 同濃度梯度的常見干擾物質(zhì)的標(biāo)本進行測定，測定結(jié)果與未加干擾物質(zhì)的標(biāo)本比較，干擾 率<±5%則可判斷被評價干擾物對被評價方法無干擾。反之則認為被評價干擾物對被評 價方法有明顯干擾作用。結(jié)果應(yīng)符合本產(chǎn)品技術(shù)要求和說明書的要求。

[0117]
[0118] 干擾率（％)判斷計算公式如下：
[0119] 干擾值=干擾樣品測定值-基礎(chǔ)樣品測定值
[0120] 干擾率（％ )=干擾樣品測定值/基礎(chǔ)樣品測定值X 100
[0121] 由圖表可得出，心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑在總膽紅素>342mi〇1/L、血紅蛋白 >5g/L、維生素C>0.3g/L、甘油三酯>11.3mmol/L、類風(fēng)濕因子>500IU/mL、脂濁>300、膽 固醇> 9ng/mL時，干擾率超過5 %，因此心型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測試劑抗干擾能力可達到： 總膽紅素<342_〇1八、血紅蛋白<5g/L、維生素C<0.3g/L、甘油三酯<11.3mmol/L、類風(fēng) 濕因子彡500IU/mL、脂濁彡300、膽固醇彡9ng/mL。
[0122] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限 制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為 等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種膠乳增強免疫比濁法檢測心型脂肪酸結(jié)合蛋白的試劑盒，其特征在于含有試劑 Rl和試劑R2,其中 試劑Rl中含有以下組分： Tris 緩沖液 120mmol/L， 聚乙二醇對異辛基苯基醚 20mmol/L， pH為 7.0-8.0， 試劑R2中含有以下組分： 鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子4.5g/L， Tris 緩沖液 120mmol/L， 牛血清白蛋白 3mmol/L ; 烷基糖苷 APG0810 1.5g/L， 甘露醇 〇.5g/L， 聚乙二醇對異辛基苯基醚 10mmol/L， pH 值為 7.0-8.0， 所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子中乳膠顆粒中，直徑10_30nm的 乳膠顆粒占總體積的10-30%，30-60nm的乳膠顆粒占總體積的40-60%，60-100nm的乳膠顆粒 占總體積的20 -30%， 試劑Rl與試劑R2體積比為4:1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆 抗體乳膠粒子中的乳膠顆粒中，直徑10_30nm的乳膠顆粒占總體積的10%，30-60nm的乳膠顆 粒占總體積的60%，60-1 OOnm的乳膠顆粒占總體積的30%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述鼠抗人心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克 隆抗體乳膠粒子中的乳膠顆粒中，直徑10_30nm的乳膠顆粒占總體積的30%，30-60nm的乳膠 顆粒占總體積的40%，60-1 OOnm的乳膠顆粒占總體積的30%。4. 一種權(quán)利要求1-3中任一項所述的試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 制備試劑Rl:將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容； (2) 制備試劑R2:將試劑R2中的Tris緩沖液、牛血清白蛋白、烷基糖苷APG0810、甘露 醇、聚乙二醇對異辛基苯基醚溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，后向溶液中加入鼠抗人 心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體乳膠粒子，充分?jǐn)嚢?，混合均勻，定容?br>【文檔編號】G01N33/68GK105911297SQ201610531911
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】王保全, 尚凱, 王霞
【申請人】宏葵生物（中國）有限公司