一種等溫滴定量熱法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法
【專利說(shuō)明】一種等溫滴定量熱法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種等溫滴定量熱法測(cè) 定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)在研究酶促反應(yīng)中起著非常重要的作用。Km是酶的特征常 數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)而與酶的濃度無(wú)關(guān)。且K m可以反應(yīng)酶同底物的親和力，Km越小，酶同底 物的親和力越大。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)測(cè)定K m，可以鑒別不同來(lái)源或相同來(lái)源但在不 同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶;也是通過(guò)1的不同，找 出酶的最適底物和底物的最適反應(yīng)濃度;還可以判斷反應(yīng)方向或趨勢(shì)、不同抑制劑對(duì)酶的 抑制類型等等。
[0003] 根據(jù)米氏方程，測(cè)定米氏常數(shù)心和最大酶促反應(yīng)速率vmax，需要測(cè)定不同濃度的酶 催化反應(yīng)速率，反應(yīng)速率為底物濃度不足以產(chǎn)生最大速率時(shí)的反應(yīng)初速率。在測(cè)定中，需要 定義反應(yīng)多久測(cè)出的速率才是初速率，反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，終止反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的誤差越大;反應(yīng)時(shí) 間過(guò)長(zhǎng)，終止反應(yīng)后所得偏小；且在終止反應(yīng)速率操作中，人為誤差難以避免，因此造成米 氏常數(shù)的測(cè)定存在較大偏差。在酶促反應(yīng)之后，還需分析手段對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定，最后才 能確定反應(yīng)速率的大小。該類方法較為繁瑣且有一定的局限性，比如在蛋白濃度較高時(shí)光 譜測(cè)定往往非常不準(zhǔn)確，某些酶轉(zhuǎn)化率非常低產(chǎn)物較難用直接的方法測(cè)定其含量。
[0004] 等溫滴定量熱法（ITC)是用于量化研究各種生物分子相互作用的一種技術(shù)，它可 實(shí)時(shí)直接測(cè)量生物分子結(jié)合過(guò)程中釋放或吸收的熱量。通過(guò)測(cè)量結(jié)合過(guò)程中的熱流變化， 就能夠準(zhǔn)確地確定酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)Km和最大酶促反應(yīng)速率 Vmax。等溫滴定量熱法(ITC ) 具有快速、微量、靈敏、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，且需藥品更少，準(zhǔn)確，做到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可克服傳統(tǒng)方 法的缺陷，解決酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定的繁瑣和準(zhǔn)確性的難題。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明提供一種等溫滴定量熱法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，以解決酶促反 應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定的繁瑣和準(zhǔn)確性等問(wèn)題。本發(fā)明的方法具有快速、微量、靈敏、操作簡(jiǎn)單 的特點(diǎn)，可有效降低酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定中對(duì)酶和底物的消耗，簡(jiǎn)化測(cè)定酶促反應(yīng)過(guò)程，提 高結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0006] 為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種等溫滴定量熱法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，是通過(guò)將底物滴加到含酶 的溶液中，檢測(cè)出每次滴加后底物與酶反應(yīng)的熱功率，設(shè)定滴加底物的間隔時(shí)間，計(jì)算出不 同底物濃度時(shí)熱功率的變化，測(cè)定得到酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)K m和最大酶促反應(yīng)速率vmax。
[0008] 進(jìn)一步地，所述的等溫滴定量熱法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，包括以下步 驟：
[0009] S1:配制0.1mol/L的緩沖液；
[0010] S2:用步驟S1配制好的緩沖液配制0.5ymol/L的酶溶液和10-15mmol/L底物溶液；
[0011] S 3 :將步驟S 2配制好的酶溶液、底物溶液分別注入量熱池和注射器中，在轉(zhuǎn)速 300r/min下攪拌酶溶液，待量熱儀達(dá)到溫度為298.15-313.15K并基線穩(wěn)定平衡后自動(dòng)開始 滴加底物溶液至酶溶液中，計(jì)算出不同底物濃度時(shí)熱功率的變化，測(cè)定得到各個(gè)溫度的米 氏常數(shù)K m和最大酶促反應(yīng)速率vmax。
[0012] 更進(jìn)一步地，步驟S1中所述緩沖液為硼酸溶液。
[0013] 更進(jìn)一步地，步驟S1中所述緩沖液的pH值為8.3。
[0014]更進(jìn)一步地，步驟S1中所述緩沖液含0.3mol/L的氯化鈉溶液。
[0015] 更進(jìn)一步地，步驟S1中所述緩沖液經(jīng)孔徑為0.22μπι過(guò)濾膜過(guò)濾所得。
[0016] 更進(jìn)一步地，步驟S2中所述酶為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，所述底物為馬尿酸-組氨酸-亮氨酸。
[0017] 更進(jìn)一步地，步驟S3中將酶溶液注入量熱池中的體積為164yL。
[0018] 更進(jìn)一步地，步驟S3中所述量熱儀為等溫滴定量熱儀。
[0019] 更進(jìn)一步地，步驟S3中所述底物溶液滴加至酶溶液中共20滴，每滴體積為lyL，每 滴時(shí)間間隔為60s，測(cè)定時(shí)間為1200s。
[0020] 本發(fā)明的方法，因?yàn)镵m在一定程度上反應(yīng)了酶與底物的親和力，它是酶反應(yīng)初速 率為Vmax的一半時(shí)底物的濃度，升高溫度有利于增加有效分子碰撞的幾率，所以在較高的溫 度下底物更容易與ACE活性中心結(jié)合，同樣底物濃度的增加也可以使分子有效碰撞的幾率 增加，那么隨著溫度的升高，酶的活性中心被底物占據(jù)一半所需要的底物濃度會(huì)下降，即K m 隨著溫度的增大而減小。
[0021] 本發(fā)明的方法中各個(gè)溫度的米氏常數(shù)1和最大酶促反應(yīng)速率vmax采用公式（1)- (7)計(jì)算得到。
[0022] 量熱實(shí)驗(yàn)直接測(cè)定的是熱功率P，它反映了熱效應(yīng)Q隨時(shí)間t的變化，如公式（1)所 示：
[0023]
(1)
[0024]熱效應(yīng)Q與底物的物質(zhì)的量η及水解焓AHhydr成正比，如公式(2)所示：
[0025] Q = n · Δ Hhydr= [S]0 · V · Δ Hhydr (2)
[0026] 其中，[So]是初始的底物濃度，V是反應(yīng)池的體積，則水解焓AHhydr可由公式⑶計(jì) 算，
[0027]
(3)
[0028] 由公式(1)-(3)得到酶促反應(yīng)速率V，如公式(4)所示：
[0029]
⑷
[0030] 其中，[S]是某時(shí)刻底物的濃度，由熱功率隨時(shí)間的積分可得到底物濃度變化的函 數(shù)關(guān)系，如公式(5)所示：
[0031]
(5)
[0032] Mi chael is一Menten方程式（簡(jiǎn)稱-家方程式）如（6)所不：
[0033]
(6)
[0034] 其中，Km為米氏常數(shù)，vmax為最大酶促反應(yīng)速率，
[0035] 再通過(guò)公式(1)-(6)可以計(jì)算得到米氏常數(shù)1，如公式(7)所示：
[0036] (7)
[0037] 不反明共令以卜令Μ雙米：
[0038] (1)本發(fā)明的方法具有快速、微量、靈敏、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可有效降低酶促動(dòng)力學(xué) 參數(shù)測(cè)定中對(duì)酶和底物的消耗，簡(jiǎn)化測(cè)定酶促反應(yīng)過(guò)程，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性；
[0039] (2)本發(fā)明的方法不需要定量監(jiān)測(cè)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的量，可直接根據(jù)反應(yīng)熱流變化 計(jì)算出動(dòng)力學(xué)參數(shù)K4Pv max，有效降低了繁瑣程度；
[0040] (3)本發(fā)明方法可用于檢測(cè)各種酶與底物之間的催化反應(yīng)，為酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參 數(shù)檢測(cè)提供了一種新的方法。
【附圖說(shuō)明】 圖1為不同溫度下血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)催化馬尿酸-組氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)水解反應(yīng)的等溫滴定量熱曲線； 圖2為不同溫度下血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)催化馬尿酸-組氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu HHL)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。 【【具體實(shí)施方式】】
[0041] 為便于更好地理解本發(fā)明，通過(guò)以下實(shí)例加以說(shuō)明，這些實(shí)例屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍，但不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042] 在實(shí)施例中，等溫滴定量熱法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，包括以下步驟：
[0043] S1:配制O.lmol/L的緩沖液；
[0044] S2:用步驟S1配制好的緩沖液配制0.5ymol/L的酶溶液和10-15mmol/L底物溶液；
[0045] S 3 :將步驟S 2配制好的酶溶液、底物溶液分別注入量熱池和注射器中，在轉(zhuǎn)速 300r/min下攪拌酶溶液，待量熱儀達(dá)到溫度為298.15-313.15K并基線穩(wěn)定平衡后自動(dòng)開始 滴加底物溶液至酶溶液中，計(jì)算出不同底物濃度時(shí)熱功率的變化，測(cè)定得到各個(gè)溫度的米 氏常數(shù)Km和最大酶促反應(yīng)速率v max。
[0046]其中：步驟S1中所述緩沖液為硼酸溶液。
[0047]步驟S1中所述緩沖液的pH值為8.3。
[0048]步驟S1中所述緩沖液含0.3mol/L的氯化鈉溶液。
[0049] 步驟S1中所述緩沖液經(jīng)孔徑為0.22μπι過(guò)濾膜過(guò)濾所得。
[0050] 步驟S2中所述酶為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，所述底物為馬尿酸-組氨酸-亮氨酸。
[0051 ]步驟S3中將酶溶液注入量熱池中的體積為164yL。
[0052]步驟S3中所述量熱儀為等溫滴定量熱儀。
[0053] 步驟S3中所述底物溶液滴加至酶溶液中共20滴，每滴體積為lyL，每滴時(shí)間間隔為 60s，測(cè)定時(shí)間為1200s。
[0054] 以下通過(guò)更具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0055] 實(shí)施例1
[0056] -種等溫滴定量熱法測(cè)定酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，包括以下步驟：
[0057] S1:配制pH值為8.3、濃度為0. lmol/L的硼酸緩沖液，所述緩沖液含0.3mol/L的氯 化鈉溶液，將硼酸緩沖液經(jīng)孔徑為0.22μπι過(guò)濾膜過(guò)濾，以備用；
[0058]