大腸癌唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質譜應用技術領域，具體地說，設及一種大腸癌唾液蛋白指紋圖 譜分子診斷模型建立方法。
【背景技術】
[0002] 結直腸癌(CRC)是世界范圍內男性和女性第Ξ個常見的癌癥，是胃腸道常見的惡 性腫瘤，W41-65歲發(fā)病率最高。腸癌如果早期發(fā)現5年生存率可達90%，而有轉移的進展期 大腸癌其5年生存率低于10%。
[0003] 內窺鏡檢查仍然是大腸癌診斷的金標準，雖然內鏡設備得到了一次次升級變革， 從傳統(tǒng)的全結腸電子內鏡到放大內鏡及染色內鏡、窄帶內鏡(NBI)、自發(fā)巧光內鏡(AFE)、共 聚焦激光顯微內鏡(CEM)、超聲內鏡化US)、結腸膠囊內鏡(CCE)等各項先進技術在內鏡中的 應用，提高了分辨率，但仍然價格昂貴而又對人體傷害較大，運嚴重限制了大腸癌的早期診 斷。而新近發(fā)展起來的大腸癌腫瘤標志物檢測，單項指標檢測準確率低，多項指標聯合檢驗 雖可一定程度上提高檢測的準確性，但結果的準確性（<70% )仍不能滿足臨床診斷腸癌需 要，且血液檢測亦為有創(chuàng)檢測。目前為止還沒有一個快速、準確而又適合于大規(guī)模篩查的大 腸癌早期診斷方法，因此，尋求一個簡便、快速、準確率高的無創(chuàng)傷檢查新方法勢在必行。
[0004] 隨著質譜儀的發(fā)展和蛋白質組學研究的而深入，產生了蛋白質指紋圖譜的診斷新 技術，該技術是通過質譜分析不同疾病血清中有許多潛在的生物標志物，通過質譜定量和 定性分析運些生物標志物可用于疾病的診斷。該方法已經成功的用于研究SARS、癌癥等診 斷標志物。
[0005] 目前蛋白指紋圖譜技術在腸癌的研究主要有:大腸癌(CRC)與正常人的鑒別診斷、 大腸癌無轉移(CRC)與大腸癌肝轉移（同時性肝轉移(SLM)/異時性肝轉移(MLM))的鑒別、大 腸良性病變與大腸癌鑒別，W及大腸癌預后模型等。采用蛋白質組學技術進行大腸癌研究， 各研究者均得到敏感性、特異性、準確性較高的分子診斷模型，然而，各研究者所篩選得到 的差異蛋白質峰差異很大^3(：與正常對照組的差異蛋白對比研究，柳俊剛等發(fā)現1/^2為 3223.43、7971.57、11493.00;崔丹瑜等發(fā)現1/2為5909、5：341、2685、2811、3928、6635、8933; 林建軍等發(fā)現 M/Z 為 2870.7、3084.0、9180.5、13748.8;張巍等發(fā)現為 2974、3282、5948、 2957、2982、5920、6647、6661;Liao CC等發(fā)現 1800-16000Da范圍內的73個峰;Xu W發(fā)現 15個 差異蛋白（2900-9000Da);周智勇等發(fā)現26個下調蛋白、52個上調蛋白，范圍在40000曰- 11100曰?！??(：無轉移與〔1?(：肝轉移的差異蛋白對比研究，柳俊剛等發(fā)現1/2為3223.43、 3511.88、8894.49;崔丹瑜等發(fā)現在肝轉移組1/2為7570、7795、7939、8137、8925、9196、 11814、7837低表達，而M/Z為5813蛋白點高表達。腸良性病變與CRC差異蛋白對比研究，Xu W 等發(fā)現M/Z為3570、3101、4869在腺瘤組高表達，在CRC組低表達；張巍等發(fā)現M/Z為3016、 66172個蛋白點在兩組比較中差異顯著。李小瓊等對正常組、良性病變組W及CRC(術前)組 Ξ者的差異蛋白研究發(fā)現7個差異點，M/Z分別為4955、5325、5890、6615、7739、8109、8575, 于新哲等發(fā)現，結直腸癌無轉移(CRC)對比結直腸癌異時性肝轉移組(MLM)，得到0個差異蛋 白峰，無統(tǒng)計學差異(P〉〇.〇5);MLM對比SLM，得到1個差異蛋白峰，M/Z = 4355.26(P<0.05); 由此可見，實驗可重復性不足，可能與實驗中樣品的預處理方法（忍片的種類、廠家、批號 等）、試驗操作者技能水平、研究者所采取的質譜方法(MALDI、SELDI或其他）、數據分析方法 (SVM、留一法等)等不一致有關。
[0006] 現有研究多針對腸癌患者血液標本或者組織標本的有創(chuàng)檢測，受試者依從性差， 不利于反復采樣、實時動態(tài)監(jiān)測W及人群盲篩推廣，具有一定的限制性，不能廣泛應用。
[0007] 因此，提供一種診斷模型簡便、快速、標本用量少，靈敏度高，特異性好的大腸癌唾 液蛋白指紋圖譜分子診斷模型的建立方法，就成為該技術領域急需解決的技術難題。

【發(fā)明內容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明要解決現有腸癌檢測技術對受試者依從性差，檢查方法復雜，靈 敏度低的問題，提供了一種大腸癌唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法。
[0009] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種大腸癌唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模 型建立方法，包括W下步驟：
[0010] (1)樣品收集；
[0011] (2)納米磁珠預處理；
[0012] (3)樣品預處理:取出冷凍保存的唾液樣品，冰上解凍，所有唾液樣品均1次凍融， 取扣1唾液加入10μ1的U9裂解液，混合解育30min后，加入18扣1的Wash Buffer稀釋(唾液最 終上樣量為2.化1);
[0013] (4)唾液樣品洗脫上樣:③向每個裝有納米磁珠的PCR管中分別加入10化1預處理 后的唾液樣品，混勻，置于室溫解育30min，將PCR管置于磁鐵上解育Imin，去除上清液;④每 管加入10化1的Wash Buffer洗脫5min，然后將PCR管置于磁鐵上解育Imin，去除上清液;再 重復步驟④操作一次，妒洗脫更干凈，獲得較純的目的蛋白；⑤在PCR管中加入10μ1的 Elution Buffer洗脫5min，將PCR管置于磁鐵上解育Imin，取化1上清液移至另一個PCR管 中；⑥將裝有扣1上清液的PCR管中加入扣1的CHCA飽和溶液，充分混勻，至樣品顏色發(fā)灰，而 沒有明顯的沉淀時，取化1混合溶液，加樣到Au/Steel忍片上，驚干后放入儀器讀取；
[0014] (5)質譜分析:采用質譜儀讀所述Au/Steel取忍片信息，設置激光強度為190,靈敏 度為5;
[001引（6)數據采集；
[0016] (7)數據分析；
[0017] (8)建立診斷模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹算法計算 出多個變量變化對兩樣本的判別價值，確定最佳的診斷模型。
[0018] 進一步的，所述步驟(1)樣品收集方法為:腸癌組和正常對照組在取材前一天晚上 臨睡前清水漱口，之后不再進食任何食物和藥物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾 液采集方式空腹取材，前5min內的唾液自然吞下后開始收集，收集到的唾液置于冰浴中的 15ml唾液離屯、管內，4°C靜置化后，3000r/min、4°C離屯、lOmin，冰浴上分裝在1ml的EP管中， 每管20化1，于-80°C冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 進一步的，所述步驟(2)納米磁珠預處理方法為:①取WCX納米磁珠50μ1加入到200 μ1的PCR管中，置于磁鐵上解育Imin，去除上清液;②再加入10化1的Wash Buff er洗脫5min， 在磁鐵上解育Imin，去除上清液;再重復步驟②操作一次，運樣洗脫更干凈，質譜檢測受到 干擾的可能性會更少。
[0020] 進一步的，所述步驟（6)數據采集方法為：用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1軟件采集數據，縱坐標為峰強度，橫坐標為蛋白質質荷比，收集數據的質荷比范圍為 2000~25000m/z，信號收集位置40~60,平均每點收集20次，收集總點為100次，已知多膚標 準忍片標準，激光離子流0.5。
[0021] 進一步的，所述步驟（7)數據分析方法為：對位于2000~25000m/z峰值，用 Biomarker Wizard軟件過濾噪音;設置初始的噪音過濾值為5，二次信噪比為2，W10%為最 小闊值進行聚類，經上述數據預處理后，采用t檢驗比較腸癌組和正常對照組唾液蛋白質質 譜數據，找出腸癌組和正常對照組之間具有統(tǒng)計學意義的差異表達蛋白質峰。
[0022] 進一步的，步驟(7)中，設置P<0.05,并選取腸癌組和正常對照組比值比率>3的 差異蛋白，所述腸癌組和正常對照組之間具有統(tǒng)計學意義的差異表達蛋白質峰有37個，其 中有30個差異蛋白質峰表達下調，7個差異蛋白質峰表達上調，所述37個差異表達蛋白質峰 具體如下：
[0023]
[0024]
[0025]
[0026] 進一步的，步驟(6)所述荷質比范圍為2000~15000m/z。
[0027] 與現有技術相比，本發(fā)明可W獲得包括W下技術效果：
[002引1)本發(fā)明將WCX與MALDI-T0F-MS技術相結合，進一步探索腸癌患者唾液差異表達 蛋白，發(fā)現了 312個腸癌差異蛋白質峰(P<0.05)，兩組比值大于3(腸癌/正常對照>3,或者 正常對照/腸癌>3)，其中有37個差異蛋白質峰有統(tǒng)計學意義，其中有7個差異蛋白質峰腸 癌表達上調，28個差異蛋白