一種快速檢測(cè)海洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于類胡蘿卜素含量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)海洋雙殼類生 物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 類胡蘿卜素(Carotenoids，CAR)作為一種多烯類物質(zhì)因其含有多不飽和雙鍵而具 有一定的抗氧化能力，同時(shí)還具有其他多種生物學(xué)功能。有研究表明貝類體內(nèi)的類胡蘿卜素 含量與貝類的生長(zhǎng)生活以及性腺發(fā)育均表現(xiàn)出一定的關(guān)聯(lián)性。如對(duì)蝦夷扇貝 (Patinopecten yessoensis)的研究表明在性腺發(fā)育時(shí)期閉殼肌類胡蘿卜素的含量達(dá)到最 高值，生殖期過(guò)后類胡蘿卜素的含量隨之降低；同時(shí)富含類胡蘿卜素的個(gè)體在苗期、分籠養(yǎng)殖 過(guò)程及產(chǎn)卵后的成活率均高于對(duì)照組，具有顯著較高的抗逆性；而對(duì)華貴櫛孔扇貝 (Chlamys nobilis Reeve)的研究則發(fā)現(xiàn)富含類胡蘿卜素的個(gè)體具有較高的總抗氧化能力， 以及類胡蘿卜素含量與該物種性別、殼色和組織間存在顯著相關(guān)性。此外還有研究發(fā)現(xiàn)三角 帆蟲豐(Hyriopsis cumingii)體內(nèi)的類胡蘿卜素含量與其珍珠層的色澤之間存在一定的關(guān) 聯(lián)，因此類胡蘿卜素含量同樣也關(guān)乎珍珠貝的育珠質(zhì)量。綜上，鑒于類胡蘿卜素對(duì)雙殼類生物 多種生長(zhǎng)及生理活動(dòng)的影響，深入探討CAR在雙殼類生物群體內(nèi)的含量水平和分布狀況是 非常必要的。
[0003] 類胡蘿卜素作為一種廣受關(guān)注的天然色素廣泛存在于各類軟體動(dòng)物中，如各類扇 貝、珍珠貝、烏賊、螺等，其組織分布包括軟體部及殼等部位。然而，迄今為止，對(duì)這些物種體 內(nèi)的CAR含量的大批量、群體水平的快速檢測(cè)方法鮮有研究?，F(xiàn)有的測(cè)定方法是采用干燥、 提取和分光光度檢測(cè)的流程和方法來(lái)進(jìn)行的，而這種常規(guī)的方法卻存在著若干缺點(diǎn)，比如： 1、耗時(shí)長(zhǎng)。樣品的冷凍干燥處理一般需要2~3天才能完成且每次處理的樣品數(shù)量有限，樣 品的研磨、稱量、提取和檢測(cè)同樣費(fèi)工費(fèi)時(shí)，工作強(qiáng)度較大;2、用樣量多。出于保證精確度的 考慮，每次需要用的干燥樣品量為0.1~〇.2g，較大地消耗了實(shí)驗(yàn)樣品；3、涉及揮發(fā)性藥品。 樣品在提取過(guò)程中需要用到丙酮，該藥品在室溫下易揮發(fā)，且屬于易燃物品，故對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán) 境及安全存在一定影響;4、實(shí)用性弱。每次只能夠測(cè)定少量樣品，不能夠批量測(cè)定，實(shí)用性 弱。這種常規(guī)測(cè)定總類胡蘿卜素含量(Total carotenoids contents，TCC)的方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不 能適用于大批量、多批次的雙殼貝類科學(xué)研究的需要，因此，必須建立一種快速、高效并且 可靠的測(cè)定TCC的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速檢測(cè)海洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素 含量的方法，該方法重復(fù)性好、實(shí)用性強(qiáng)、快速高效，并且除了建立回歸曲線需要少量樣品 之外不再消耗樣品。
[0005] 本發(fā)明方法通過(guò)使用色差儀對(duì)部分海洋雙殼類生物體閉殼肌組織切片進(jìn)行色差 檢測(cè)，獲取相對(duì)紅度參數(shù)（A a)，然后將其與TCC相關(guān)聯(lián)并建立△ a-TCC的線性回歸方程，從 而實(shí)現(xiàn)由相關(guān)的色差參數(shù)對(duì)個(gè)體類胡蘿卜素含量的評(píng)估。
[0006] 由于色差指標(biāo)在檢測(cè)過(guò)程中可直接施用新鮮組織樣品，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行干燥、研 磨和萃取等操作，因此具有快速、高效的優(yōu)勢(shì)，尤其是面對(duì)大量待測(cè)樣品時(shí)次優(yōu)勢(shì)尤為明 顯，實(shí)用性極強(qiáng)。并且，在后續(xù)檢測(cè)過(guò)程中基本沒(méi)有樣品消耗，檢測(cè)后的樣品可繼續(xù)用于其 他多種生理生化指標(biāo)的檢測(cè)，因此極大提高了單個(gè)樣品的利用率。此外，檢測(cè)過(guò)程中避免了 傳統(tǒng)的TCC檢測(cè)所需要的有機(jī)溶劑和多種大型設(shè)備，因此又具有安全、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種快速檢測(cè)海 洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)組織取樣和預(yù)處理:選取海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品若干，取樣并充分冷凍 后橫向切片處理，獲得組織切片；
[0009] (2)組織切片色差檢測(cè):將組織切片采用色差儀進(jìn)行檢測(cè)，色差檢測(cè)結(jié)果即相對(duì)紅 度A a;
[0010] (3)總類胡蘿卜素含量TCC檢測(cè):采用傳統(tǒng)方法檢測(cè)步驟(2)中進(jìn)行過(guò)色差檢測(cè)的組 織切片的總類胡蘿卜素含量TCC;
[0011] (4)建立相對(duì)紅度Δ a-TCC回歸曲線:將步驟(2)中檢測(cè)的組織切片的相對(duì)紅度Δ a 與步驟(3)中檢測(cè)的組織切片的總類胡蘿卜素含量TCC建立線性回歸方程；
[0012] (5)待測(cè)海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的總類胡蘿卜素含量TCC檢測(cè)：取待測(cè)海洋 雙殼類生物體閉殼肌樣品，測(cè)試其相對(duì)紅度A a，代入步驟(4)中建立的線性回歸方程，即可 獲得該待測(cè)海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的總類胡蘿卜素含量TCC。
[0013] 在上述快速檢測(cè)海洋雙殼類生物體內(nèi)類胡蘿卜素含量的方法中：
[0014] 步驟(1)中所述的海洋雙殼類生物體優(yōu)選為華貴櫛孔扇貝或合浦珠母貝。
[0015] 步驟（1)中獲取的組織切片的厚度優(yōu)選為2~3mm，但以保證同批次樣品切片厚度 均一為宜。
[0016] 步驟(1)中海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的數(shù)量為15個(gè)以上。更佳為30個(gè)以上。
[0017] 步驟(2)中將組織切片采用色差儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將組織切片置于與其大小相適配 的樣品槽中，同時(shí)在樣品上覆蓋一邊緣進(jìn)行過(guò)遮光處理的蓋玻片，將蓋玻片壓緊樣品以確 保樣品的厚度與樣品槽的厚度相同，保證樣品檢測(cè)面平滑且檢測(cè)厚度一致，減小誤差，檢測(cè) 時(shí)將色差儀檢測(cè)口緊貼于蓋玻片上，避免漏光。
[0018] 步驟(4)中優(yōu)選采用SPSS軟件將步驟(2)中檢測(cè)的組織切片的相對(duì)紅度△ a與步驟 (3)中檢測(cè)的組織切片的總類胡蘿卜素含量TCC建立線性回歸方程。
[0019] 本發(fā)明步驟(2)中采用傳統(tǒng)方法檢測(cè)若干海洋雙殼類生物體閉殼肌樣品的總類胡 蘿卜素含量TCC的優(yōu)選方式如下：
[0020] (1)選取色差檢測(cè)后的樣品，置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行充分的冷凍干燥；
[0021] (2)將干燥后的樣品在研缽中充分研磨，然后稱取0.1~0.2g于10mL離心管中，記 錄樣品精確重量W，每個(gè)樣品取兩份；
[0022] (3)往(2)中的離心管加入丙酮(分析純）2mL，密封后充分震蕩，于避光靜置8h或過(guò) 夜；
[0023] (4)以5000r/min對(duì)離心管進(jìn)行離心，lOmin，轉(zhuǎn)移上清液于新的離心管里，并往下 層沉淀中再次加入丙酮2mL，充分震蕩，避光靜置4h后以上述條件再次離心，取上清液并與 第一次離心之上清液合并；
[0024] (5)使用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)對(duì)(4)中最后所得之上清液進(jìn)行480nm處的吸光 值進(jìn)行檢測(cè)，記錄各樣品對(duì)應(yīng)之OD480 ;
[0025] (6)TCC按照公式TCC(yg/g)=OD48〇 · VX104/(E(1%lcm)XW)計(jì)算，公式中OD480為 480nm處吸光值，V為提取液體積(mL)，W為樣品重(g)，Ε(ι%ι?)為在1 cm光程長(zhǎng)的比色杯中1 g/ L濃度溶質(zhì)的理論吸收值，Εα%ι?) = 1900。
[0026] 本發(fā)明利用色差儀作為主要檢測(cè)設(shè)備，并輔以分光光度計(jì)測(cè)定樣品的總類胡蘿卜 素含量，只需用常規(guī)方法對(duì)少量樣品進(jìn)行檢測(cè)并建立起色差-TCC回歸方程，其后大量的待 測(cè)樣品則無(wú)需干燥、研磨和提取等步驟，只需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單切片處理即可用于檢測(cè)，因而能夠在 極短的時(shí)間內(nèi)，對(duì)樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的批量測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程中樣品無(wú)消耗并且檢測(cè)后的樣 品還可繼續(xù)進(jìn)行其他多種指標(biāo)的檢測(cè)，從而為雙殼貝類類胡蘿卜素含量進(jìn)行大批量的檢測(cè) 提供一個(gè)簡(jiǎn)便快速的方法。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] (1)需時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，在建立起回歸方程后，每個(gè)樣品僅需數(shù)秒鐘，極大縮短檢測(cè) 時(shí)間和流程；
[0029] (2)用樣量少，每次需要用的樣品少，只需少量的組織切片；
[0030] (3)重復(fù)性好，樣品重復(fù)測(cè)量值間的變化較小、重復(fù)性好；
[0031] (4)實(shí)用性強(qiáng)，能夠批量地檢測(cè)大量樣品，對(duì)待檢樣品的保存無(wú)嚴(yán)苛要求，并且檢 測(cè)過(guò)程中樣品無(wú)消耗、無(wú)脫水以及無(wú)變質(zhì)，檢測(cè)完成后可繼續(xù)用于多種理化指標(biāo)的檢測(cè)；
[0032] (5)本發(fā)明是一種快速測(cè)定雙殼貝類閉殼肌總類胡蘿素含量的方法，但又不局限 于此一類物種及組織，通過(guò)這種技術(shù)可快速、高效地對(duì)多種雙殼貝類等物種體內(nèi)的類胡蘿卜 素含量進(jìn)行研究，對(duì)研究類胡蘿卜素在生物體內(nèi)的分布、變化等具有重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1是實(shí)施例1中華貴櫛孔扇貝組織切片的色差檢測(cè)結(jié)果-相對(duì)紅度Aa-TCC回歸 曲線；
[0034] 圖2是實(shí)施例2中合浦珠母貝組織切片的色差檢測(cè)結(jié)果-相對(duì)紅度Aa-TCC回歸曲 線。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下實(shí)施例用于闡明與實(shí)施本發(fā)明，屬于