時(shí)，去除培養(yǎng)基并用PBS溶液洗3次，然后立即將細(xì) 胞與 500μLAg/Au-GOxNSs(0· 74X10nparticlesmL\inPBS)共同孵育 20min，40min和 60min，在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)至不同時(shí)間后將細(xì)胞取出在暗視野顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞圖 像米集。
[0062] 4、暗場(chǎng)成像
[0063] 暗場(chǎng)散射圖像是通過(guò)配有暗場(chǎng)聚光器（Leica0. 90S1)的LeicaDMI6000B顯微 鏡（德國(guó)）成像，只收集來(lái)自樣品的散射光而成像，圖像由LeicaDFC450C數(shù)碼照相機(jī)采 集。通過(guò)上述設(shè)備分別采集Ag/Au-GOxNSs探針與細(xì)胞或H202共同孵育前后的暗場(chǎng)圖像，由 于金納米粒子增強(qiáng)的吸收和散射（1〇 5倍），因此來(lái)自于細(xì)胞本身的光散射可以忽略不計(jì)。在 相同條件下，對(duì)照Ag/Au-GOxNSs分別與非腫瘤細(xì)胞L929和腫瘤細(xì)胞A549共同孵育15~ 20min后顯微鏡暗場(chǎng)圖像。在實(shí)驗(yàn)條件下，隨著探針中酶能完全快速的與腫瘤細(xì)胞表面葡萄 糖反應(yīng)的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞表面的納米探針變成了橙色或紅色，正常細(xì)胞的顯示黃綠色或綠 色，如圖5所示。
[0064] 5、細(xì)胞活力測(cè)定
[0065] 細(xì)胞活力測(cè)定采用MTT分析法，將不同的細(xì)胞接種到96孔板中（5000細(xì)胞/孔）， 每個(gè)細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)各設(shè)置一空白對(duì)照孔和調(diào)零孔；每種細(xì)胞MTT分析均進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，然后取平均值。Ag/Au-G0xNSs的濃度大約是~0.74X10nparticlesmL1，將Ag/ Au-G0xNSs各10μL分別加入細(xì)胞中放入37°C，5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;24h后用NIR 激光照射5min，同時(shí)設(shè)對(duì)照孔；然后向每孔中加入10μLMTT試劑，充分混勻，4h后向每孔 中加入100μL甲瓚溶液，低速振蕩30min后用測(cè)量490nm吸光度值，根據(jù)每孔的吸光度值 計(jì)算出細(xì)胞活力，將未用納米粒子處理的細(xì)胞的活力值視為100%。如圖6所示，圖6為 L929，HeLa，!fepG2和A549細(xì)胞分別與Ag/Au-G0xNSs孵育、激光照射后的MTT細(xì)胞活力分 析柱狀圖。
[0066] 6、Ag/Au-G0xNSs用于葡萄糖檢測(cè)
[0067] 將等分的lmLAg/Au-GOxNSs溶液與不同濃度的20μL葡萄糖溶液混合后，在室 溫下（25 - 30°C)靜置一定時(shí)間，以使酶催化反應(yīng)進(jìn)行，并通過(guò)紫外-可見(jiàn)（UV-vis)吸收光 譜隨時(shí)記錄反應(yīng)溶液的光譜變化。
[0068] 檢測(cè)實(shí)際樣品中葡萄糖濃度時(shí)，血清由吉林大學(xué)第二醫(yī)院提供。在測(cè)試前將血清 先進(jìn)行離心處理（10OOOrprn，離心10min)。檢測(cè)時(shí)，將經(jīng)過(guò)處理的血清稀釋用PBS緩沖溶 液（10mM，pH7. 4)稀釋10倍，取20μL加入lmLAg/Au-G0xNSs溶液中混合，并在室溫靜置 30分鐘后，測(cè)試其紫外-可見(jiàn)（UV-vis)吸收光譜。
[0069]當(dāng)葡萄糖氧化酶被固定于Ag/Au雙金屬納米殼表面后，該體系具有很好的酶催化 活性。如圖7所示，圖7為Ag/Au-GOxNSs與濃度為2mM的葡萄糖反應(yīng)30min前（·曲線） 后（▲曲線）歸一化的UV-Vis光譜圖。從圖7中可以明顯看出，Ag/Au-G0xNSs與2mM的 葡萄糖溶液混合后，由于酶催化反應(yīng)及產(chǎn)物H202的刻蝕作用，使其UV-Vis光譜峰位置明顯 移向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向（即從580nm移至682nm)。而表面未固定GOx的Ag/AuNSs與葡萄糖混 合靜置12h以上，其UV-Vis光譜吸收峰位置則基本沒(méi)有變化，如圖8所示，圖8為Ag/Au NSs(表面未修飾葡萄糖氧化酶）與濃度為2mM的葡萄糖反應(yīng)12小時(shí)前（魯曲線）后（△ 曲線）歸一化的UV-Vis光譜圖。
[0070] 6、Ag/Au-GOxNSs的光熱效應(yīng)檢測(cè)
[0071] 首先用激光器照射lOmin確定Ag/AuNSs和Ag/Au-GOxNSs納米粒子溶液的光熱 效應(yīng)，并用溫度計(jì)（Traceable14_648_44type)記錄不同時(shí)間點(diǎn)（0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、 3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5和1〇11^11)的溫度值。如圖9所示，圖9中曲 線a為前體Au/AgNSs納米粒子溶液經(jīng)NIR激光照射后溶液溫度變化曲線，曲線b為Ag/ Au-GOxNSs溶液經(jīng)H202刻蝕前進(jìn)行激光照射后溶液溫度變化曲線，曲線c為Ag/Au-GOxNSs 溶液經(jīng)H202刻蝕后進(jìn)行激光照射后溶液溫度變化曲線。
[0072] 將不同的細(xì)胞接種于96孔板中（5000細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24h(密度80 %~90% ) 后，去除原培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS(10mM:Na2HP04 · 12H20和ΚΗ2Ρ04)洗3次，隨后將500μLAg/ Au-G0xNSs(0. 74X10nparticlesmL1)探針與細(xì)胞共同孵育不同的時(shí)間后，將細(xì)胞用PBS 清洗3次，去除多余的未結(jié)合的納米粒子，重新加入500μLPBS，然后用NIR激光器照射 5min，激光照射面積是0. 2cm2,功率從70mW~200mW。照射后細(xì)胞用胎盤蘭（0. 04% )染色， 光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞死亡情況，判斷納米粒子的光熱效應(yīng)，每種細(xì)胞重復(fù)3次實(shí) 驗(yàn)。如圖10所示，圖10為Ag/Au-G0xNSs與對(duì)照細(xì)胞L929、癌細(xì)胞（HeLa，!fepG2和A549) 共同孵育前后分別用激光器照射5min，功率為170mW(0. 85Wcm2)，然后用胎盤蘭染色后的 顯微鏡圖像。
[0073] 7、應(yīng)用納米探針清除癌細(xì)胞
[0074] 采用激光器進(jìn)行細(xì)胞照射時(shí)功率和照射時(shí)間的優(yōu)化。在本研究中，我們采用808nm 連續(xù)波NIR激光器（CWlaser)進(jìn)行選擇性光熱清除癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。當(dāng)納米探針Ag/Au-GOxNSs 與細(xì)胞共同孵育20min后，分別用CWNIRlaser的不同功率（70、100、150、170和200mW) 照射L929和HeLa細(xì)胞各5min。然后，用胎盤蘭染色，顯微鏡觀察。如圖11所示，當(dāng)激 光功率很小時(shí)70mW，0. 35Wcm2時(shí)，腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均無(wú)明顯死亡現(xiàn)象；當(dāng)激光功率在 170mW(0. 85Wcm2)時(shí)HeLa細(xì)胞死亡較明顯，而L929幾乎沒(méi)有死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，當(dāng)功率達(dá)到 200mW(lWcm2)以上時(shí)，兩種細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的死亡現(xiàn)象，因此我們選擇170mW(0. 85Wcm2) 進(jìn)tx后續(xù)的光熱清除實(shí)驗(yàn)。
[0075] 以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì) 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0076] 對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施例的上述說(shuō)明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開(kāi)的原理和新穎特點(diǎn)相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種納米粒子的制備方法，包括： 將Ag/Au雙金屬納米粒子、緩沖溶液、帶正電荷的聚合物與葡萄糖氧化酶溶液混合，靜 置，得到納米粒子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述混合的過(guò)程具體為： 將Ag/Au雙金屬納米粒子分散于緩沖溶液中，調(diào)節(jié)溶液的pH至6~7,再將帶正電荷的 聚合物加入到得到的溶液中，靜置后再加入葡萄糖氧化酶溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述緩沖溶液為磷酸鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述帶正電荷的聚合物為 聚組氨酸。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述靜置之后還包括： 將靜置后的納米粒子分散于緩沖溶液中。6. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)制備的納米粒子用于葡萄糖的檢測(cè)。7. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的納米粒子在制備癌癥早期診斷和/或治療制劑中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種納米粒子的制備方法，包括：將Ag/Au雙金屬納米粒子、緩沖溶液、帶正電荷的聚合物與葡萄糖氧化酶溶液混合，靜置，得到納米粒子。本申請(qǐng)通過(guò)靜電吸附作用將葡萄糖氧化酶固定于Ag/Au雙金屬納米粒子表面，而得到了葡萄糖氧化酶和金屬等離子激元雜化的納米粒子。本申請(qǐng)制備的納米粒子可用于葡萄糖的檢測(cè)，亦可用于制備早期癌癥診斷和/或治療制劑中的應(yīng)用。
【IPC分類】G01N21/552
【公開(kāi)號(hào)】CN105372211
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510688453
【發(fā)明人】金永東, 陳立梅, 賀海麗
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年10月21日