一種煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性n-亞硝胺的gc-ms/ms分析測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的分析技術領域，具體涉 及一種煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS分析測定方法，是使用氣相 色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS )分析煙草及無煙氣煙草制品中N-亞硝基二甲胺（NDMA)、 N-亞硝基吡咯（NPYR)、N-亞硝基哌啶（NPIP)、N-亞硝基甲基乙基胺（NMEA)、N-亞硝基二乙 胺（NDEA)、N-亞硝基甲基丁基胺（NMBA)、N-亞硝基二丙胺（NDPA)、N-亞硝基嗎啉（NM0R)、 N-亞硝基二丁胺（NDBA)等9種主要揮發(fā)性N-亞硝胺，利用該方法可定量分析煙草及無煙 氣煙草制品中9種揮發(fā)性N-亞硝胺的含量。
【背景技術】
[0002] 揮發(fā)性N-亞硝胺是一類受到廣泛關注的致癌類物質(zhì)，是Hoffmann "43種有害成 分"清單和2012年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA) "煙草制品及煙氣中有害及潛在有害物 質(zhì)名單"中的重要物質(zhì)，是國際癌癥研究機構（IARC) "無煙氣煙草制品中28種有害物質(zhì)" 名單中的重要成分。
[0003] 關于煙草及無煙氣煙草制品樣品前處理，目前主要參考1977年Brunnemann的方 法進行，即采用緩沖溶液進行提取，然后經(jīng)過液液反萃取和固相萃取進行分離凈化，使得樣 品前處理操作繁瑣，不利于大批量樣品的分析測定。而針對煙草中揮發(fā)性N-亞硝胺的檢 測，主要采用氣相色譜-熱能分析聯(lián)用法（GC-TEA)，其是一種對亞硝胺和亞硝酸酯響應的 專一型檢測器，具有靈敏度高等優(yōu)點，GC-TEA是揮發(fā)性N-亞硝胺分析的主流方法，但是，該 分析方法存在分析時間長、檢測效率低及出現(xiàn)假陽性等缺點。隨著高選擇性、高靈敏度的串 級質(zhì)譜聯(lián)用技術的發(fā)展，GC-MS/MS由于檢測靈敏度高，通過基質(zhì)配標消除基質(zhì)效應，已被廣 泛用于食品、化妝品中揮發(fā)性N-亞硝胺的分析，但在煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞 硝胺的分析尚未有相關研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術狀況而提供一種分離分析煙草及無煙氣煙 草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的新方法，解決了現(xiàn)有技術中前處理所存在的不足，為準確評估 煙草及無煙氣煙草煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的安全風險提供技術支撐。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的： 本發(fā)明的煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS分析方法是將煙葉樣 品磨碎成粉末狀后(無煙氣煙草制品直接稱量)，準確稱取，加入堿性二氯甲烷和內(nèi)標溶液， 于振蕩器上振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩，然后加入N-丙基乙二胺（PSA)和石墨碳，再 次手持振蕩混合均勻；然后振蕩、離心，取上清液氮吹濃縮，最后用GC-MS/MS進行測定。具 體步驟如下： (1)樣品萃取：將準確稱取的4 g樣品放于50 mL離心管中，加入4 mL氫氧化鈉溶液 (0. 1 mol/L)手持振蕩15 S，然后加入30 mL二氯甲烷和20 μL內(nèi)標工作溶液，于振蕩器中 振蕩 20 min。所述內(nèi)標(為混合內(nèi)標）為 NDMA-D6、NMEA-D3、NDEA-D10、NDPA-D14、NM0R-D8、 NPYR-D8、NPIP-D8、NDBA-D8 的二氯甲烷溶液，濃度均為 20 ng/mL。其中 NDPA-D14 為 NMBA 和NDPA的內(nèi)標。
[0006] (2)樣品溶液凈化：加入4 g無水硫酸鎂除去水分，再加入1 g PSA和0. 5 g石墨 碳，進行樣品溶液凈化處理。
[0007] (3)振蕩和離心：樣品在振蕩器上以280 rpm的速度振蕩2 min，在高速離心機上 以10000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min。
[0008] (4)濃縮：離心后取上清液在45°C恒溫水浴中氮吹濃縮至1 mL左右，將其轉(zhuǎn)移至 2 mL色譜小瓶中，以備檢測。
[0009] (5)GC-MS/MS測定：將標準溶液和樣品溶液按照表1中GC-MS/MS儀器工作參數(shù)進 行測定，按照表2列出的定性離子進行物質(zhì)確認和定量分析，依據(jù)濃度和峰面積進行校正 計算樣品中亞硝胺殘留量。
[0010] 所述標準溶液(為混合標準工作溶液）以二氯甲烷為溶劑，濃度為2 ng/mL、5 ng/ mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和 200 ng/mL 的 VNAs 系列標準溶液，分別加 入內(nèi)標，使各內(nèi)標物的濃度均為20 ng/mL。
[0011] 表1 GC-MS/MS儀器工作參數(shù)

本發(fā)明的優(yōu)點在于：首次將基質(zhì)分散固相萃取方法引入到煙草及無煙氣煙草制品中揮 發(fā)性N-亞硝胺的前處理中，以實現(xiàn)對基質(zhì)的凈化，該前處理方法簡便快速；采用GC-MS/MS 可同時對煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺進行定性和定量分析，樣品分析干擾 少、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為準確評估煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的安全風 險提供技術支撐。
【具體實施方式】
[0012] 本發(fā)明結(jié)合實例作進一步描述，但并不限制本發(fā)明。
[0013] 實例 1 對配制系列標準溶液進行GC-MS/MS測定，得到線性方程和相關系數(shù)。檢出限（LODs)是 由三倍信噪比對應的樣品濃度來確定，定量限（LOQs)是由10倍的信噪比對應的濃度來確 定的。結(jié)果表明方法線性好、檢出限低(結(jié)果見表3 )。
[0014] 表3 9種揮發(fā)性N-亞硝胺的標準曲線、檢出限和定量限
實例2 在樣品處理前加入定量的低、中、高三種標準品溶液，同時做6次測定，得到煙葉中9種 揮發(fā)性N-亞硝胺含量，結(jié)果表明方法精密度均小于16%，準確度在84. 1%-118%之間（結(jié)果見 表4)〇
[0015] 表4方法的回收率和精密度（％)
實例3 按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中步驟測定4種國內(nèi)煙葉中的揮發(fā)性N-亞硝胺含量，結(jié)果見表5。
[0016]實例 4 按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中步驟測定來源于美國、英國和瑞典的無煙氣煙草制品的揮發(fā)性 N-亞硝胺含量，結(jié)果見表6。
【主權項】
1. 一種煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS分析測定方法，包括 N-亞硝基二甲胺（NDMA)、N-亞硝基吡咯（NPYR)、N-亞硝基哌啶（NPIP)、N-亞硝基甲基 乙基胺（NMEA)、N-亞硝基二乙胺（NDEA)、N-亞硝基甲基丁基胺（NMBA)、N-亞硝基二丙胺 (NDPA)、N-亞硝基嗎啉（NMOR)、N-亞硝基二丁胺（NDBA)9種揮發(fā)性N-亞硝胺，其特征在于： 是將煙葉樣品磨碎成粉末狀后或者是無煙氣煙草制品樣品，準確稱取，加入堿性二氯甲烷 和內(nèi)標溶液，于振蕩器上振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩，然后加入N-丙基乙二胺（PSA) 和石墨碳，再次手持振蕩混合均勻；然后振蕩、離心，取上清液氮吹濃縮，最后用GC-MS/MS 進行測定，具體步驟如下： (1) 樣品萃取：將準確稱取的4 g樣品放于50 mL離心管中，加入4 mL濃度0.1 mol/ L氫氧化鈉溶液手持振蕩15 s，然后加入30 mL二氯甲烷和20 PL內(nèi)標工作溶液，于振蕩器 中振蕩20 min ; (2) 樣品溶液凈化：加入4 g無水硫酸鎂除去水分，再加入I g PSA和0. 5 g石墨碳， 進行樣品溶液凈化處理； (3) 振蕩和離心：樣品在振蕩器上以280 rpm的速度振蕩2 min，在高速離心機上以 10000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5 min ; (4) 濃縮：離心后取上清液在45°C恒溫水浴中氮吹濃縮至I mL左右，將其轉(zhuǎn)移至2 mL 色譜小瓶中，作為待測樣品溶液； (5) GC-MS/MS測定：將標準溶液和樣品溶液按照下表中GC-MS/MS儀器工作參數(shù)進行測 定：〇2. 根據(jù)權利要求1所述的GC-MS/MS分析測定方法，其特征在于：所述內(nèi)標為濃度均為 20 ng/mL 的 NDMA-D6、NMEA-D3、NDEA-D10、NDPA-D14、NM0R-D8、NPYR-D8、NPIP-D8、NDBA-D8 的二氯甲烷溶液；其中NDPA-D14為NMBA和NDPA的內(nèi)標。3. 根據(jù)權利要求1所述的GC-MS/MS分析測定方法，其特征在于：所述標準溶液以二氯 甲燒為溶劑，配制揮發(fā)性N-亞硝胺的系列標準溶液：2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/ mL、50 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL;分別加入內(nèi)標，使各內(nèi)標物的濃度均為20 ng/mL。
【專利摘要】一種煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS/MS分析測定方法，其特征在于：是將煙葉樣品磨碎成粉末狀后或者是無煙氣煙草制品樣品，準確稱取，加入堿性二氯甲烷和內(nèi)標溶液，于振蕩器上振蕩，加入無水硫酸鎂，手持振蕩，然后加入N-丙基乙二胺（PSA）和石墨碳，再次手持振蕩混合均勻；然后振蕩、離心，取上清液氮吹濃縮，最后用GC-MS/MS進行測定。本發(fā)明的優(yōu)點在于：首次將基質(zhì)分散固相萃取方法引入到煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的前處理中，以實現(xiàn)對基質(zhì)的凈化，其前處理方法簡便快速，樣品分析干擾少、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為準確評估煙草及無煙氣煙草制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的安全風險提供技術支撐。
【IPC分類】G01N30/88, G01N30/06
【公開號】CN105353068
【申請?zhí)枴緾N201510899119
【發(fā)明人】郭軍偉, 呂芳, 王洪波, 劉紹鋒, 趙樂, 謝復煒, 樊美娟, 潘立寧, 陳黎
【申請人】中國煙草總公司鄭州煙草研究院
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月9日