檢測(cè)阿德呋啉的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)阿德呋啉的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中如雞肉組織、內(nèi)臟中的阿德呋啉含量或殘留量。屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]阿德呋琳屬核苷酸類化合物，英國(guó)科學(xué)家在上個(gè)世紀(jì)七十年代有相關(guān)研究報(bào)道，在我國(guó)是一種正在研發(fā)的新型高效抗球蟲(chóng)藥物。阿德呋啉針對(duì)球蟲(chóng)有良好的治療效果，其抗球蟲(chóng)指數(shù)ACI為183.2。將一定量的阿德呋啉藥物飼養(yǎng)羅曼雄性雛雞，可明顯檢測(cè)到雞肝和雞腎中阿德呋啉以原藥形式存在。以昆明種健康小氣考察阿德呋啉的急性毒性試驗(yàn)，口服給藥，給藥一次或24h內(nèi)多次給藥后，一定時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡過(guò)程得出阿德呋啉LD5。為3443.5 mg.Kg 1.bw 1最高劑量給藥后，小鼠精神沉郁、呼吸急促。剖檢部分死亡小鼠發(fā)現(xiàn)腹腔液較多，藥物吸收不完全，脾臟腫大。目前在家禽等動(dòng)物中都沒(méi)有阿德呋琳的相關(guān)研究報(bào)道，為了完成新獸藥申報(bào)，建立阿德呋啉藥物的安全評(píng)價(jià)，保障食品安全，所以開(kāi)展阿德呋啉的檢測(cè)研究。
[0003]近年來(lái)，水、食品安全、衛(wèi)生、公共健康和能源等與大眾的生活息息相關(guān)的問(wèn)題，也越來(lái)越受到全球的關(guān)注，見(jiàn)附錄1。世界各國(guó)針對(duì)食品安全問(wèn)都幵展研究解決辦法。歐盟從2006年1月1日起開(kāi)始執(zhí)行新的食品安全法規(guī)，其中特別要求進(jìn)口食品必須符合新法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)，否則歐盟委員會(huì)有權(quán)取消其進(jìn)口資格。隨著獸藥在畜禽詞養(yǎng)過(guò)程中的長(zhǎng)期大量使用，防止濫用藥物具有重要意義。在西方經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國(guó)家，人們十分重視獸藥殘留的監(jiān)控，頒布了一系列畜產(chǎn)品中獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和管理法規(guī)，嚴(yán)格實(shí)施對(duì)畜產(chǎn)品中獸藥殘留的監(jiān)督、監(jiān)控與檢測(cè)，制定了詳盡的獸藥殘留檢測(cè)方法。
[0004]化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的高靈敏性和免疫分析技術(shù)的高特異性。本發(fā)明通過(guò)特有的免疫動(dòng)物制備具有高親和力、高特異性的阿德呋啉抗體，并采用酶標(biāo)記抗體，建立一種可以檢測(cè)阿德呋啉的化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒，將為雞肉產(chǎn)品中阿德呋啉藥物留檢測(cè)提供新方法，對(duì)保證畜產(chǎn)品安全提供重要的理論和實(shí)踐依據(jù)，維護(hù)畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來(lái)實(shí)現(xiàn)的?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高特異性。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，樣品中阿德呋啉含量越高，反應(yīng)體系中發(fā)光強(qiáng)度越弱；反之，樣品中阿德呋啉含量越少，發(fā)光強(qiáng)度越高。
[0006]本發(fā)明是一種檢測(cè)阿德呋啉的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于含有以下成份:
1、包被有阿德呋啉-載體蛋白偶聯(lián)物的不透明白色酶標(biāo)板；所述阿德呋啉-載體蛋白偶聯(lián)物是將阿德呋啉與載體蛋白通過(guò)混合酸酐法或碳二亞胺法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白；
2、阿德呋啉標(biāo)準(zhǔn)品；
3、阿德呋啉-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體:該成分為用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的阿德呋啉抗體，所述阿德呋啉抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；
4、發(fā)光底物液:該發(fā)光底物液是以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液，分為A液和B液保存，在使用前按1:1混合使用；其中A液位發(fā)光增強(qiáng)劑加魯米諾貨發(fā)光增強(qiáng)劑加異魯米諾，B液為過(guò)氧化氣溶液或尿素過(guò)氧化氣溶液；
5、2倍濃縮稀釋液；
6、20倍濃縮洗滌液。
[0007]本發(fā)明中，所述的不透明白色酶標(biāo)板為96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶標(biāo)板。
[0008]本發(fā)明中，所述的阿德呋啉標(biāo)準(zhǔn)品，由一系列不同濃度的阿德呋啉標(biāo)準(zhǔn)品組成，濃度為0.02~5.12 ng/mL的濃度區(qū)間。
[0009]本發(fā)明中，所述的阿德呋啉-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體為用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的阿德呋啉抗體，如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的阿德呋啉抗體。
[0010]本發(fā)明中，所述的發(fā)光底物液為商品化的任一種以魯米諾貨異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液。
[0011]本發(fā)明中，所述所述2倍濃縮稀釋液，其成分為0.01mol/L, pH7.4的磷酸緩沖液、甘氨酸-HC1緩沖液或Tris-HCl緩沖液，使用前請(qǐng)按1:1稀釋(1份濃縮樣品稀釋液+1份去離子水)。
[0012]本發(fā)明中，所述20倍濃縮洗滌液，其包含0.05%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間，使用前請(qǐng)按1:19稀釋(1份濃縮稀釋液+19份去離子水)。
[0013]本發(fā)明的阿德呋啉的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于阿德呋啉的檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)步驟為:
(1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，氮?dú)獯蹈刹⑵鋸?fù)溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被阿德呋啉抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品50μ?/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品每個(gè)濃度做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；
(4)加入阿德呋啉抗體工作液，50μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)45 min ；
(5)小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μ?7孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；
(6)加入發(fā)光底物液混合液(Α液與Β液在使用前按1:1混合)100μ?/孔，輕輕振蕩混勻，混合好后在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀內(nèi)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)；
(7)檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算:用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液發(fā)光值與空白溶液的比值進(jìn)行計(jì)算。見(jiàn)下式:
相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=RLU/RULmax 式中:
RLU=標(biāo)準(zhǔn)(或樣品)溶液的發(fā)光強(qiáng)度值；
RLUmax=空白(濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值；
將計(jì)算的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值對(duì)應(yīng)阿德呋啉(Kg/L)的自然對(duì)數(shù)作半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖。各待測(cè)樣品的阿德呋啉濃度根據(jù)其RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出，或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)的方程計(jì)算得出。如樣品處理中有稀釋，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度要再乘以其稀釋倍數(shù)。即為樣本中阿德呋啉的實(shí)際濃度。
[0014]本發(fā)明的試劑盒可用于雞肉組織及內(nèi)臟等樣品中阿德呋啉的殘留量檢測(cè)。與現(xiàn)有的其它檢測(cè)阿德呋啉殘留量的實(shí)驗(yàn)方法比較，本發(fā)明的試劑盒有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比色譜方法(高效液相、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用)、毛細(xì)管電泳方法更為快速簡(jiǎn)便，所需儀器更為簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本更為低廉，同時(shí)具有高通量的特點(diǎn)；
(2)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比ELISA方法更為靈敏，可以檢測(cè)出更低濃度和含量的阿德呋啉殘留，同時(shí)線性范圍更寬；
(3)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，減少了二抗的使用環(huán)節(jié)，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間；不透明白色酶標(biāo)板增加了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀靈敏度。另外，用阿德呋啉-載體蛋白偶聯(lián)物而非阿德呋啉抗體來(lái)包被不透明白色酶標(biāo)板，減少了阿德呋啉抗體的不穩(wěn)定性，保證了試劑盒的長(zhǎng)期有效性。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0016]實(shí)施例
1、試劑盒各組分的制備
(1)阿德呋啉半抗原的制備:將阿德呋啉酸化，在4°c無(wú)光低溫環(huán)境中與亞硝酸鈉作用，生成含重氮基正離子的中間體。重氮化的阿德呋啉作為半抗原，用于后面合成免疫抗原與包被抗原