Uhplc-ms/ms同時(shí)測(cè)定防己黃芪湯煎劑中10種化學(xué)成分含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用UHPLC-MS/MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定防己黃芪湯煎劑中10種化學(xué)成 分含量的方法，屬于中藥成分分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 防己黃芪湯是目前臨床常用且療效顯著的中藥處方，主要應(yīng)用于治療慢性腎炎蛋 白尿、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎等，該方由粉防己、黃芪、白術(shù)及炙甘草組成。雖然防己黃芪 湯在臨床應(yīng)用方面有顯著的療效，但由于其化學(xué)成分復(fù)雜，以至于目前關(guān)于防己黃芪湯化 學(xué)成分的研究甚少。防己黃芪湯的主要成分包括生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、皂苷類(lèi)等，傳統(tǒng) 的檢測(cè)技術(shù)HPLC-DAD由于檢測(cè)器的局限性，無(wú)法同時(shí)對(duì)防己黃芪湯中多種類(lèi)別化學(xué)結(jié)構(gòu) 的多個(gè)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用UHPLC-MS/MS技術(shù)，建立了一種針對(duì)防己黃芪湯 中10種不同類(lèi)別化學(xué)結(jié)構(gòu)成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定的方法，這10種成分在結(jié)構(gòu)上涵蓋了生 物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)和皂苷類(lèi)，這使得所建立的含量測(cè)定方法能夠深入和全面地控制防 己黃芪湯的質(zhì)量。
[0004] 發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] L防己黃芪湯供試品溶液的制備：
[0006] 按照防己黃苗湯的處方比例，分別精密稱(chēng)取粉防己12g，黃苗15g，白術(shù)9g，炙甘 草6g，于煎藥鍋中，先加420mL的水，浸泡lh，武火煮沸后，文火保持微沸狀態(tài)煎煮30min， 以四層紗布濾出藥液，藥渣再加336mL水武火煮沸后，文火保持微沸狀態(tài)煎煮30min，四層 紗布濾出藥液，合并兩次煎液，加適量水定容到lOOOmL，精密移取藥液2mL置50mL量瓶中， 加60%甲醇溶液15mL，超聲15min，放冷，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，12000r/min離心 lOmin，吸取上清液作為供試品溶液；
[0007] 2.混合對(duì)照品溶液的配制：分別精密稱(chēng)取粉防己堿，防己諾林堿，白術(shù)內(nèi)酯I， 白術(shù)內(nèi)酯III，毛蕊異黃酮葡萄糖苷，甘草酸，甘草苷，異甘草苷，甘草素，異甘草素對(duì)照 品適量，加甲醇溶解稀釋?zhuān)瑩u勻，得到濃度分別為104. 16,117. 54, 23. 55, 35. 63,635. 92， 2009. 56, 7920. 00,1944. 03,135. 55, 39. Olng · mL 1 的混合對(duì)照品溶液；
[0008] 3.測(cè)定法：采用UHPLC-MS/MS法分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，注 入分析儀器，測(cè)定，即得。
[0009] 色譜條件：C18Agilent 色譜柱（2. ImmX IOOmrn, 3. 5 μπι);流速：0· 4mL · min S 柱 溫：30°C ;進(jìn)樣量：10 μ L ;梯度洗脫條件：流動(dòng)相為0. 1%甲酸水溶液與乙腈的混合物，0~ 0. 8min，乙腈的體積分?jǐn)?shù)從5%線(xiàn)性增加至50%，0. 1%甲酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)從95%線(xiàn)性 減少至50 %，0. 8~3. Omin，乙腈的體積分?jǐn)?shù)線(xiàn)性增加至90 %，0. 1 %甲酸水溶液的體積分 數(shù)線(xiàn)性減少至10%，3. O~3. lmin，乙腈的體積分?jǐn)?shù)線(xiàn)性減少至5%，0.1 %甲酸水溶液的體 積分?jǐn)?shù)線(xiàn)性增加至95%。
[0010] 質(zhì)譜參數(shù)條件：
[0011] 質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM)。使用下列參數(shù)：離子源溫度：500°C ; Ql/Q3(m/z) ：623. 2/381. 3 ；609. 3/367. I ；233. 1/187. 2 ；249. 1/231. 0 ；447. 2/285. I ； 821. 3/351. 2 ;417. 1/255. I ;417. 1/255. I ;256. 2/135. 0 ;256. 2/135. 0 ;去簇電壓（DP): 39. 86 ;27. 13 ;63. 96 ;54. 8 ;57 ;-14. 67 ;-17. 32 ;-17. 32 ;-65. 84 ;-65. 84V ;碰撞能量 (CE) :53. 9 ;49· 43 ;22· 61 ;14· 42 ;16· 11 ;-52· 15 ;-23· 39 ;-23· 39 ;-21· 65 ;-21. 65V ;入口 電壓（EP) :3. 93 ;4· 29 ;6· 81 ;3· 14 ;6· 38 ;-13· 72 ;-10· 15 ;-10· 15 ;-9· 14 ;-9· 14V ;碰撞 室出 口電壓（CXP) :10. 83 ;27· 3 ;14 ;14 ;14 ;-22· 52 ;-21· 88 ;-21· 88 ;-17 ;-17V ;霧化氣： 55psi ;輔助加熱氣：55psi ;氣簾氣：35psi ;氮?dú)庾鳛閲婌F輔助氣體。
[0012] 上述步驟3測(cè)定法中包括線(xiàn)性關(guān)系的測(cè)定；精密吸取混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)?得稀釋倍數(shù)為1，2,4,8,16, 32,64的系列濃度溶液。
[0013] 上述步驟3測(cè)定法中包括精密度的測(cè)定；即精密吸取混合對(duì)照品溶液：粉防己 堿，防己諾林堿，白術(shù)內(nèi)酯I，白術(shù)內(nèi)酯III，毛蕊異黃酮葡萄糖苷，甘草酸，甘草苷，異甘草 苷，甘草素，異甘草素濃度分別為 52. 08, 58. 77,11. 77,17. 82, 317. 96,1004. 78, 3960. 00， 972. 02,67. 78,19. 51ng · mL 1的混合溶液，在測(cè)試條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各峰面積。
[0014] 上述步驟3測(cè)定法中包括重復(fù)性的測(cè)定；即取同一批防己黃芪湯煎劑，平行制得 防己黃芪湯供試品6份，在質(zhì)譜條件下分別測(cè)定6次，計(jì)算每種對(duì)照品的色譜峰面積。
[0015] 上述步驟3測(cè)定法中包括穩(wěn)定性的測(cè)定；即取防己黃芪湯供試品溶液，室溫放置， 于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，在測(cè)試條件下分析，記錄各峰面積。
[0016] 上述步驟3測(cè)定法中包括回收率試驗(yàn)；精密吸取已知含量的防己黃芪湯煎劑 1.0 mL，平行6份，置于50mL容量瓶中，分別精密加入一定濃度的混合對(duì)照品溶液（粉防己 堿，防己諾林堿，白術(shù)內(nèi)酯I，白術(shù)內(nèi)酯III，毛蕊異黃酮葡萄糖苷，甘草酸，甘草苷，異甘草 苷，甘草素，異甘草素的濃度分別為 1306. 00,1389. 50, 290. 00, 538. 50, 3621. 00,41969. 00， 82592. 50,17393. 00,1113. 00, 78. 50) L OmL，加 60 % 甲醇溶液 14mL，超聲 15min，放冷，用 60%甲醇溶液稀釋至刻度，12000r/min離心10min，吸取上清液，在測(cè)試條件下進(jìn)樣分析， 記錄各峰面積，并計(jì)算方法的加樣回收率。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，防己黃芪湯中所測(cè)10種化學(xué)成分在乙 腈-0. 1 %甲酸水系統(tǒng)梯度洗脫條件下，在短短的3. Imin內(nèi)即達(dá)到有效分離，方法的分析 周期極短、分離效率極高。2.質(zhì)譜具有高靈敏度和強(qiáng)選擇性，能夠在準(zhǔn)確測(cè)定成分含量的 同時(shí)，精確給出其質(zhì)量數(shù)信息，達(dá)到對(duì)化合物進(jìn)行鑒別的效果。3.本發(fā)明對(duì)防己黃芪湯中 的10種不同類(lèi)型化合物進(jìn)行同時(shí)定量分析，操作快捷、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為防己 黃芪湯煎劑全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是本發(fā)明混合對(duì)照品溶液中10種成分的提取離子流質(zhì)量色譜圖。圖中A-J 分別代表粉防己堿，防己諾林堿，白術(shù)內(nèi)酯I，白術(shù)內(nèi)酯III，毛蕊異黃酮葡萄糖苷，甘草酸， 甘草苷，異甘草苷，甘草素，異甘草素。
[0019] 圖2是本發(fā)明供試品溶液中10種待測(cè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下通過(guò)實(shí)施例形式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此 理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均 屬于本發(fā)明的范圍。
[0021] 實(shí)施例1 :UHPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定防己黃芪湯煎劑中10種化學(xué)成分含量的方法：
[0022] 1.飲片、儀器與試藥
[0023] 1.1飲片來(lái)源：黃芪和炙甘草購(gòu)自南京海昌中藥集團(tuán)（南京，中國(guó)）；粉防己和白 術(shù)購(gòu)自河北中藥集團(tuán)（河北，中國(guó)）；經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，均為正品。
[0024] 1. 2 儀器
[0025] Shimadzu CBM20Alite 高效液相色譜系統(tǒng)（Shimadzu LC20ADXR 栗，SPD20A UV 檢 測(cè)器，SIL20ACXR自動(dòng)進(jìn)樣器，CT020AC柱溫箱）Jriple Quadrupole 5500質(zhì)譜儀（美國(guó) AB SCIEX公司），ESI離子源；質(zhì)譜工作站：Analyst、. 6 ;超聲波清洗器（KQ-500,昆山市超 聲儀器有限公司）。AG 285電子天平（METTLER T0LED0，d = 0.0 lmg)。純水儀（南京易普 易達(dá)低級(jí)發(fā)展有限公司，型號(hào)：EPED-10TF，編號(hào)：0903090818)。高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心 機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：XZ-6G)。
[0026] 1. 3 試藥
[0027] 粉防己堿（F001130112)(純度> 98% )、防己諾林堿（F006121121)(純度> 98% )、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（130419)(純度> 98% )、甘草酸（G003130405)(純度> 98% )、甘草苷（G009130424)(純度 > 98% )、異甘草苷（Y120130503)(純度 > 98% )、甘 草素（G036130119)(純度> 98% )、異甘草素（Y008130426)(純度> 98% )購(gòu)于成都瑞芬 思生物科技有限公司，白術(shù)內(nèi)酯I (ZL120418HB)(純度> 98% )、白術(shù)內(nèi)酯III (ZL120420HB) (純度> 98% )購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。
[0028] 乙腈為質(zhì)譜純（美國(guó)Merck公司），超純水，無(wú)水甲酸為質(zhì)譜純（Anaqua Chemicals，批號(hào)：FA31120500)。
[0029] 2.方法與結(jié)果
[0030] 2. 1混合對(duì)照品溶液的配制
[0031] 分別精密稱(chēng)取粉防己堿，防己諾林堿，白術(shù)內(nèi)酯I，白術(shù)內(nèi)酯III，毛蕊異黃酮葡 萄糖苷，甘草酸，甘草苷，異甘草苷，甘草素，異甘草素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋?zhuān)瑩u 勻，得到濃度分別為 104. 16,117. 54, 23. 55, 35. 63,635. 92, 2009. 56, 7920. 00,1944. 03， 135. 55, 39. Olng · mL 1的混合對(duì)照品溶液；
[0032] 2. 2供試品溶液的配制
[0033] 按照防己黃芪湯的處方比例，分別精密稱(chēng)取粉防己12g，黃芪15g，白術(shù)9g，炙甘草 6g，于煎藥鍋中，先加420mL水，浸泡lh，武火煮沸后，文火保持微沸狀態(tài)煎煮30min，以四層 紗布濾出藥液，藥渣再加336mL水武火煮沸后，文火保持微沸狀態(tài)煎煮30min，四層紗布濾 出藥液，合并兩次煎液，加適量水定容到lOOOmL，精密移取藥液2mL置50mL量瓶中，加60% 甲醇溶液15mL，超聲15min，放冷，用60%甲醇溶液稀釋至刻度，12000r/min離心10min，吸 取上清液作為供試品溶液；
[0034] 2· 3色譜條件與質(zhì)譜參數(shù)條件
[0035] 色譜條件：C18色譜柱（Agilent, USA, 2. ImmX 100mm, 3· 5 μ m);流速：0· 4mL ?min