高分辨率振幅反差成像的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及目標(biāo)成像領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及一種利用電子顯微術(shù)對(duì)諸如生 物體之類的柔軟物質(zhì)目標(biāo)生物體成像的方法和系統(tǒng)。 技術(shù)背景
[0002] 在追求對(duì)細(xì)胞級(jí)的生命過(guò)程的全面理解時(shí)，高分辨率生物成像起著重要的作用。 許多蛋白質(zhì)被看作在不同復(fù)合物的形成中多次被使用的模塊。對(duì)于大多數(shù)復(fù)合物來(lái)說(shuō)，其 功能還是未知的。然而，人們認(rèn)為它們參與了活細(xì)胞中的關(guān)鍵過(guò)程，并且對(duì)組成蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)及其動(dòng)力學(xué)的理解對(duì)于在細(xì)胞級(jí)全面理解生命過(guò)程是一個(gè)必須步驟。形成在多個(gè)聯(lián)合體 中的復(fù)合物的大尺寸以及它們?cè)诠δ芊矫娴目赡艿膭?dòng)力學(xué)可變性使得大多數(shù)所述復(fù)合物 無(wú)法采用X射線晶體學(xué)來(lái)進(jìn)行研究，從而導(dǎo)致低溫電子顯微術(shù)成為結(jié)構(gòu)研究的少數(shù)技術(shù)之 一。單粒子技術(shù)尤其是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兡芟拗品肿拥南嗷プ饔谩?br>[0003] 在單粒子低溫電子顯微術(shù)的世界中，信條是：生物體是相位目標(biāo)，其只能利用相襯 顯微術(shù)來(lái)研究。在電子顯微術(shù)中獲得相襯的通常方法是利用負(fù)散焦（Scherzer聚焦）來(lái)補(bǔ) 償球面像差Cs從而產(chǎn)生空間頻率的通帶，其相移約等于90°。然而，在這種通帶中，在低空 間頻率的相位傳遞非常少，這對(duì)于關(guān)于形狀的信息在此范圍內(nèi)的生物體來(lái)說(shuō)是一個(gè)問(wèn)題。
[0004] 一個(gè)可能的解決方法是開(kāi)發(fā)一種能夠?qū)⒅行氖南辔幌鄬?duì)于衍射束轉(zhuǎn)換90°以 上的相位板。然而，盡管全力投入了相位板的開(kāi)發(fā)，迄今為止仍然不能利用相位板來(lái)展示清 晰的高分辨率成像。
[0005] -個(gè)在低空間頻率范圍內(nèi)獲得更大相襯的更實(shí)用的方法是通過(guò)使用超大散焦 (2微米級(jí)別）和通過(guò)合并幾個(gè)散焦值并假設(shè)成像是線性的來(lái)補(bǔ)償缺失的間隔（missing gap)。但是強(qiáng)散焦的缺點(diǎn)是，在大散焦的情況下，顯微鏡的空間非相干性將分辨率強(qiáng)力地限 制到4埃的級(jí)別。因此，通常認(rèn)為使用Cs校正器對(duì)于單粒子低溫電子顯微術(shù)來(lái)說(shuō)價(jià)值有限， 盡管其在無(wú)機(jī)材料的HREM中非常成功。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種適合于柔軟物質(zhì)（例如生物體）的良好成像技術(shù)和 系統(tǒng)。
[0007] 本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是意識(shí)到球面像差（Cs)校正的高分辨率電子顯微術(shù) 可以用于柔軟物質(zhì)（例如生物材料）的成像。
[0008] 我們吃驚地發(fā)現(xiàn)可以使用柔軟物質(zhì)（諸如生物體）的熱漫散射（TDS)電子。我們 發(fā)現(xiàn)柔軟物質(zhì)的TDS電子的信號(hào)可以很大，因?yàn)槠洳粌H是原子的原子數(shù)的函數(shù)，還是均方 位移（MSD)的函數(shù)，其取決于結(jié)合能。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)是提供了方法和系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行適合于柔軟物質(zhì)（例如 生物體）的高分辨率電子顯微成像，其使用了例如主要包括熱漫散射（TDS)電子的大角散 射電子。
[0010] 本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是TDS散射是非相干的，因此不會(huì)與中心束干涉。 因此產(chǎn)生振幅反差，其可以以最高分辨率成像，例如利用平坦傳遞函數(shù)（flat transfer function)(相移是0)，所述平坦傳遞函數(shù)可以利用球面像差（Cs)校正器例如利用極小欠 聚焦來(lái)達(dá)到。
[0011] 本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提供了方法和系統(tǒng)，其在1/埃左右的空間頻率提 供最優(yōu)檢測(cè)，這是可以利用球面像差（Cs)校正器可以在其中實(shí)現(xiàn)平坦通帶的精確范圍。
[0012] 本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是TDS信號(hào)容易理解并且與"質(zhì)量-厚度"成線性，因 此非常適合于斷層掃描成像。
[0013] 本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是尤其針對(duì)該成像技術(shù)優(yōu)化的環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔徑可 以用于選擇熱漫散射電子。在某種意義上，該方法可以與HAADF STEM相比，而具有HREM的 所有優(yōu)點(diǎn)。
[0014] 上述目標(biāo)通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的一種方法和設(shè)備來(lái)完成。
[0015] 本發(fā)明涉及一種用于進(jìn)行目標(biāo)的高分辨率電子顯微術(shù)的方法，所述方法包括利用 具有球面像差校正的電子顯微鏡照射目標(biāo)，在以原子水平分辨率在目標(biāo)上散射的熱漫散射 電子的頻帶內(nèi)，所述球面像差校正具有基本上恒定的傳遞函數(shù)，其特征在于所述方法包括 檢測(cè)在所述目標(biāo)上散射的熱漫散射電子，然后基于所檢測(cè)的熱漫散射電子獲得柔軟物質(zhì)目 標(biāo)的圖像。
[0016] 在本發(fā)明的實(shí)施例中引用基本上恒定的傳遞函數(shù)時(shí)，在平均值的像差為微米或更 低級(jí)別的情況下引用。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所研究的目標(biāo)可以是柔軟物質(zhì)目標(biāo)，盡管實(shí)施例并不限于 此。本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是利用所公開(kāi)的方法可以研究蛋白質(zhì)質(zhì)。因此一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是 熱漫散射在1埃左右，這在Cs校正電子顯微鏡可以達(dá)到的范圍內(nèi)。所述方法還可以有利地 用于研究聚合物。然而，所述方法還可以適用于無(wú)機(jī)材料。
[0018] 本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以利用在目標(biāo)上散射的熱漫散射電子來(lái)是所述 目標(biāo)成像。所述目標(biāo)可以是柔軟物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，它可以是蛋白質(zhì)質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)施 例利用了這樣一個(gè)事實(shí)，即發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在原子水平分辨率對(duì)柔軟物質(zhì)例如生物體成像時(shí)， 熱漫散射是有用的。
[0019] 在柔軟物質(zhì)目標(biāo)上散射的熱漫散射電子的頻帶可以包括0.5 A-1到1.0 A·1的范 圍。所述照射因此可以利用一個(gè)小散焦來(lái)進(jìn)行。所述照射可以利用一個(gè)小欠聚焦來(lái)進(jìn)行。
[0020] 像差校正Cs可以是幾微米的級(jí)別，而對(duì)應(yīng)的散焦D可以是幾納米的級(jí)別。像差 校正和散焦的值可以如下選擇。對(duì)于想要達(dá)到的分辨率R，可以確定像差校正為（1.6R)4/ ((L) 3)，其中L為波長(zhǎng)。對(duì)應(yīng)的散焦D可以確定為Cs. L的1、2次平方根。
[0021] 所述照射可以利用環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔徑來(lái)進(jìn)行。利用環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔徑來(lái)成像可以 包括利用具有基本上環(huán)孔形狀的環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔徑來(lái)成像，其中所述環(huán)孔形狀具有內(nèi)徑和 外徑，所述內(nèi)徑和外徑對(duì)應(yīng)于在生物體上散射的熱漫散射電子的頻帶來(lái)選擇。
[0022] 所述頻帶可以在0. 5埃（-1)到1埃（-1)之間。在一個(gè)實(shí)施例中，所述頻帶可選 為0.5/σ到l/σ之間，其中σ為原子的平均熱位移。
[0023] 所述柔軟物質(zhì)目標(biāo)可以為生物體。
[0024] 進(jìn)行高分辨率電子顯微術(shù)可以包括進(jìn)行斷層掃描成像。
[0025] 獲得圖像可以包括將每個(gè)原子的非相干貢獻(xiàn)（incoherent contribution)獨(dú)立地 加入到最終的圖像中。
[0026] 基于所檢測(cè)到的熱漫散射電子獲得柔軟物質(zhì)的圖像包括基于每個(gè)原子的非相干 貢獻(xiàn)獲得獨(dú)立的子圖像。
[0027] 所述方法可以包括三維柔軟物質(zhì)目標(biāo)粒子的斷層掃描成像，其中使用相同的成像 條件在同一成像步驟中使粒子成像，所述粒子相對(duì)于成像系統(tǒng)在目標(biāo)中具有不同的深度位 置從而導(dǎo)致小于預(yù)定值的散焦。
[0028] 所述方法可以包括考慮到不同的散焦值，使用不同的成像條件在不同的成像步驟 中對(duì)粒子成像，所述粒子相對(duì)于成像系統(tǒng)在目標(biāo)中具有不同的深度位置從而導(dǎo)致大于預(yù)定 值的散焦。
[0029] 本發(fā)明還涉及一種在原子水平分辨率進(jìn)行柔軟物質(zhì)目標(biāo)的高分辨率電子顯微術(shù) 的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括球面像差校正器，其在所述系統(tǒng)中在散射在所述柔軟物質(zhì)目標(biāo)上的 熱漫散射電子的頻帶內(nèi)誘導(dǎo)基本上恒定的傳遞函數(shù)，其特征在于所述系統(tǒng)還包括適于檢測(cè) 在柔軟物質(zhì)上散射的熱漫散射電子的檢測(cè)器，和基于所檢測(cè)的熱漫散射電子獲得所述柔軟 物質(zhì)目標(biāo)的圖像的圖像處理器。
[0030] 電子顯微鏡在0.5 A·1到1.0 A·1之間可以具有基本上恒定的傳遞函數(shù)。
[0031] 電子顯微鏡還可以進(jìn)一步包括環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔徑。
[0032] 所述環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔徑可以是具有內(nèi)徑和外徑的環(huán)孔形狀，所述內(nèi)徑和外徑對(duì)應(yīng) 于在柔軟物質(zhì)目標(biāo)上散射的熱漫散射電子的頻帶來(lái)選擇。
[0033] 本發(fā)明還涉及用于電子顯微鏡系統(tǒng)中的環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔徑，所述環(huán)形暗場(chǎng)物鏡孔 徑是具有內(nèi)徑和外徑的環(huán)孔形狀，所述內(nèi)徑和外徑對(duì)應(yīng)于在柔軟物質(zhì)目標(biāo)上散射的熱漫散 射電子的頻帶來(lái)選擇。
[0034] 本發(fā)明還涉及上述系統(tǒng)的使用，用于對(duì)柔軟物質(zhì)目標(biāo)成像。
[0035] 本發(fā)明還涉及用于生物體的上述系統(tǒng)的使用。
[0036] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用上述方法獲得的電子顯微鏡圖像。
[0037] 本發(fā)明特別的和優(yōu)選的方面在所附的獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中提出。從屬權(quán)利要求 中的特征可以恰當(dāng)?shù)嘏c獨(dú)立權(quán)利要求中的特征和其它從屬權(quán)利要求中的特征結(jié)合，而并不 僅如權(quán)利要求中明確提出的那樣。參照后面描述的實(shí)施例，本發(fā)明的這些和其它方面是顯 而易見(jiàn)的并通過(guò)參照后面描述的實(shí)施例來(lái)闡明。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1表示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的一個(gè)用于電子顯微術(shù)的系統(tǒng)。
[0039] 圖2表示在最佳散焦下傳遞函數(shù)的虛部，其表示比較材料可以用于闡明本發(fā)明的 實(shí)施例的特征。
[0040] 圖3表示在強(qiáng)欠聚焦下傳遞函數(shù)的虛部，其表示比較材料可以用于闡明本發(fā)明的 實(shí)施例的特征和優(yōu)點(diǎn)。