一種3水平血栓彈力圖質(zhì)控品及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及凝血檢驗項目質(zhì)量控制領(lǐng)域，特別涉及一種用于血栓彈力圖儀或血栓 彈力圖檢測試劑盒的3水平血栓彈力圖質(zhì)控品及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手術(shù)期血液制品輸注是保障外科手術(shù)患者圍手術(shù)期安全的重要方法之一。隨著 我國醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展，手術(shù)量不斷提升，圍手術(shù)期血制品需求量也隨之不斷增加，血液制品 資源稀缺的問題日益凸顯。目前世界范圍內(nèi)對于紅細(xì)胞輸注的指征已有較客觀的標(biāo)準(zhǔn)，然 而糾正凝血功能相關(guān)的血液制品如新鮮冰凍血裝、冷沉淀及血小板的輸注指征則不然。傳 統(tǒng)凝血功能檢測（conventional coagulation tests, CCT)指標(biāo)，主要包括凝血酶原時間 (prothrombin time，PT)，活化的部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT)，國際正?；戎担╥nternational normalized ratio，INR),纖維蛋白原 (fibrinogen, FBG)以及血小板計數(shù)（platelet count, PLT)目前廣泛應(yīng)用于臨床，為糾正 凝血功能相關(guān)血液制品輸注提供參考依據(jù)。然而，CCT項目獲得檢測結(jié)果所需時間較長，無 法實現(xiàn)即時監(jiān)測，且每項指標(biāo)僅反映患者凝血功能的一部分，無法幫助臨床醫(yī)生了解患者 的整體凝血功能狀況，因此，糾正凝血功能相關(guān)血液制品的輸注指征一直缺乏統(tǒng)一的客觀 標(biāo)準(zhǔn)，仍多以臨床醫(yī)生的經(jīng)驗判斷為主要指導(dǎo)依據(jù)（Transfusion P B. 105 :1，2006)。為了 更合理的應(yīng)用有限的血液制品資源，找到更快速、準(zhǔn)確、全面監(jiān)測凝血功能指標(biāo)的方法，來 指導(dǎo)糾正凝血功能相關(guān)血液制品的使用是十分必要的。
[0003] 血檢彈力圖（thrombelastography，TEG)主要在臨床用于全血樣本的凝血功能檢 測。血栓彈力圖樣本為患者的全血標(biāo)本，檢測時患者的全血標(biāo)本置于樣品杯中，將連接運(yùn)動 感應(yīng)及傳導(dǎo)系統(tǒng)的檢測桿插入樣本杯，使樣本在37°C的恒溫下由高嶺土激活后進(jìn)行檢測。 樣品杯以4度45分的角速度勻速轉(zhuǎn)動，檢測桿則感應(yīng)樣本運(yùn)動的阻力并進(jìn)行記錄產(chǎn)生描記 圖及參數(shù)（Reikvam H，Steien E，Hauge B等，40:2,2009)。描記圖大致分為兩個部分，凝 血階段與纖溶階段。在凝血階段中，R時間為檢測起始至曲線振幅上升至2mm所需時間，對 應(yīng)多種凝血因子逐步激活導(dǎo)致纖維蛋白開始形成的過程。K時間為曲線振幅由2mm上升至 20mm所需時間，對應(yīng)纖維蛋白交聯(lián)及其與血小板的相互作用。A角為描記圖最大曲線弧度 的切線與水平線的夾角，與K時間共同反映纖維蛋白與血小板的相互作用，在患者嚴(yán)重低 凝K值無法測出的時候成為重要的替代指標(biāo)。最大振幅（maximum amplitude,MA)為描記圖 最高振幅，對應(yīng)血塊最大強(qiáng)度，與血小板濃度、血小板功能以及血小板-纖維蛋白相互作用 有關(guān)。血塊達(dá)到最大強(qiáng)度后便進(jìn)入纖溶階段，其中較常用的指標(biāo)為Ly30及Ly60,分別代表 描記圖達(dá)到MA后30分鐘和60分鐘時血栓纖溶的百分比，由減小的曲線下面積計算得出， 反應(yīng)纖維蛋白溶酶溶解血栓的程度。TEG檢測輸出示意圖如圖1所示。已有研究用電鏡觀 察TEG描記圖不同時間點(diǎn)對應(yīng)的凝血塊形態(tài)學(xué)變化,證明了以上指標(biāo)的意義（Kawasaki J, Katori N，Kodaka M，99:5, 2004)。若在TEG樣品杯中加入適量組織因子促進(jìn)凝血過程啟 動，則可進(jìn)一步節(jié)省時間。
[0004] 由于TEG相比CCT存在諸多優(yōu)勢，主要包括：（1)可以反映樣本血液從凝血塊形成 直到纖維溶解的全過程，比CCT更加全面；（2)其檢測指標(biāo)可以反凝血因子、纖維蛋白原及 血小板之間的相互作用，能更全面的表現(xiàn)臨床中患者的整體凝血狀況；（3)已有試驗證明 TEG的早期指標(biāo)如R、K與PT、APTT顯著相關(guān)，晚期指標(biāo)如A角、MA與PT、APTT及PLT顯著 相關(guān)，但TEG試驗結(jié)果產(chǎn)生速度顯著快于CCT，能夠即時反映患者凝血功能（Cotton BA, Faz G，Hatch QM，71 :2, 2011)，更好的用于快速指導(dǎo)臨床治療決策；（4)檢測可以在床旁進(jìn)行， 檢測結(jié)果可以同步顯示于臨床醫(yī)生及實驗技術(shù)員面前，提高工作效率。因此，TEG已經(jīng)越來 越多的應(yīng)用于臨床，尤其在心臟手術(shù)（Plotkin AJ，Wade CE, Jenkins DH，64 :2,2008)、肝 移植（Gurusamy KS，12 :1,2011)、急診嚴(yán)重創(chuàng)傷（Schochl H，Nienaber U，Maegele M，15 : R83, 2011)等可能出現(xiàn)嚴(yán)重凝血功能障礙的疾病中，TEG指導(dǎo)臨床決策對減少成分輸血量、 提高患者預(yù)后、減少出血量等方面的研究均已取得一定成果。術(shù)中出血是影響患者凝血功 能的重要因素，手術(shù)患者的凝血功能則是圍手術(shù)期重要的參考指標(biāo)，與患者術(shù)中出血及預(yù) 后有密切關(guān)系。CCT由于上述限制，未能廣泛應(yīng)用于術(shù)中患者凝血功能的監(jiān)測。TEG彌補(bǔ) 了 CCT的諸多不足，未來可能是手術(shù)患者圍手術(shù)期凝血功能監(jiān)測的很好選擇。早在1987年 Anesthesia and Analgesia雜志就已發(fā)表文章說明出血對凝血功能的影響可以通過TEG指 標(biāo)變化得到反映 （Tuman KJ，66:9,1987)。2012年Madsen等人在對正頌手術(shù)病人的研究 中更是提出TEG指標(biāo)可以用來預(yù)測手術(shù)出血量，為TEG在圍手術(shù)期的應(yīng)用提供了新的方向 (Madsen DE，70:10,2012)。由此可見，TEG未來很可能成為糾正凝血功能相關(guān)血液制品輸 注指征的重要參考依據(jù)。
[0005] 因此，血栓彈力圖儀的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性就顯得極為重要。檢測血栓彈力圖儀穩(wěn)定 性的質(zhì)控品也就成為了血栓彈力圖在臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。本發(fā)明者們致力于探尋一種能夠快 速有效檢測血栓彈力圖儀準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的質(zhì)控品，來校準(zhǔn)和調(diào)試血栓彈力圖儀， 以期獲得質(zhì)量更優(yōu)，檢測效果更佳的血栓彈力圖儀。從而為醫(yī)院臨床和患者提供更有保障 的服務(wù)和治療。
[0006] 然而，目前還沒有關(guān)于采用單一動物血漿豬血漿制備3水平血栓彈力圖質(zhì)控品的 報道，因此，本發(fā)明第一次公開通過豬血中加入不同濃度枸櫞酸抗凝劑制備3水平血栓彈 力圖質(zhì)控品的方法和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的是提供一種3水平血栓彈力圖質(zhì)控品，能夠快 速有效檢測血栓彈力圖儀準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的質(zhì)控品。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種3水平血栓彈力圖質(zhì)控品由豬血分別與3種不 同濃度的枸櫞酸鈉混合，離心，取血漿，向3份血漿中分別加入凝血激活劑和組織因子凍干 制得粉末狀質(zhì)控品I，加入凝血激活劑凍干制得粉末狀質(zhì)控品II，加入凝血激活劑和凍干 血小板凍干制得粉末狀質(zhì)控品III。3水平質(zhì)控品能同時從凝血時間（R)和血塊強(qiáng)度（MA)兩 個方面實現(xiàn)對血栓彈力圖儀及其檢測試劑盒進(jìn)行質(zhì)量控制，相比于2水平質(zhì)控品更具有實 用價值和有效性。
[0009] 優(yōu)選的，所述離心為低速離心，以4000r/min離心5分鐘最佳，低速離心的目的是 防止血漿中的凝血酶、凝血因子等蛋白被離心出來，從而影響質(zhì)控品的使用。
[0010] 優(yōu)選的,所述豬血與所述枸櫞酸鈉混合的質(zhì)量比為I :9,該比例是抗凝劑與血液 的最佳比例，采用該比例的抗凝的血液或者血漿在加入鈣離子后能實現(xiàn)復(fù)凝。
[0011] 優(yōu)選的，所述質(zhì)控品I中枸櫞酸鈉的濃度為2%，所述質(zhì)控品II中枸櫞酸鈉的濃度 為3%，所述質(zhì)控品III中枸櫞酸鈉的濃度為4%，3水平的質(zhì)控品中枸櫞酸鈉的濃度分別為 2%、3%和4%相對于其他濃度，其R值和MA值能得到更好的分離。
[0012] 優(yōu)選的，所述凝血激活劑的加入量為所述血漿質(zhì)量的2%，所述組織因子的加入量 為所述血漿質(zhì)量的2%，所述凍干血小板的加入量為所述血漿質(zhì)量的3%。
[0013] 優(yōu)選的，所述組織因子的純度大于90%。
[0014] 優(yōu)選的，所述凝血激活劑為高嶺土。
[0015] 優(yōu)選的，所述血漿由新鮮采集的豬血制備獲得，新鮮豬血里面的纖維蛋白原是活 性最好的，而且利于保藏。且來源廣泛，價格低廉，而且危險性和傳染病源小，制作成的質(zhì)控 品性質(zhì)穩(wěn)定。
[0016] 優(yōu)選的，所述質(zhì)控品I、所述質(zhì)控品II、所述質(zhì)控品III進(jìn)一步分別按ImL/瓶分裝 于西林瓶中。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述質(zhì)控品在檢測血栓彈力圖儀準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性中的應(yīng)用。
[0018] 優(yōu)選的，所述3水平血栓彈力圖質(zhì)控品在應(yīng)用中加入氯化鈣試劑補(bǔ)充枸櫞酸絡(luò)合 的鈣離子后，證實3水平血栓彈力圖質(zhì)控品的R，K，Angel，MA參數(shù)均穩(wěn)定，R值和MA值具有 較好的分離度，能有效反應(yīng)血栓彈力圖儀系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述質(zhì)控品在檢測血栓彈力圖檢測試劑盒準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性中的 應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用單一動物的血漿作為質(zhì)控品，不僅降低了產(chǎn)品的 成本，而且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；通過在豬血中加入不同濃度的枸櫞酸抗凝，制備的 3水平的血栓彈力圖質(zhì)控品，呈凍干粉末狀，相比于目前國內(nèi)外市場上的2水平血栓彈力圖 質(zhì)控品，3水平的血栓彈力圖質(zhì)控品可以同時對R和MA值進(jìn)行監(jiān)測，更好的用于血栓彈力圖 儀和血栓彈力圖檢測試劑盒的質(zhì)量控制，檢測快速，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡便，而2水平的血栓 彈力圖質(zhì)控品只有R值有區(qū)分度，無法從M值檢測血栓彈力圖儀的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
【附圖說明】
[0021] 圖1血栓彈力圖檢測輸出示意圖；
[0022] 圖2組織因子純度檢測圖；
[0023] 圖3血栓彈力圖質(zhì)控品I血栓彈力圖；
[0024] 圖4血栓彈力圖質(zhì)控品II血栓彈力圖；
[0025] 圖5血栓彈力圖質(zhì)控品III血栓彈力圖；
[0026] 圖6血栓彈力圖質(zhì)控品I、質(zhì)控品II、質(zhì)控品III的復(fù)合圖譜。
【具體實施方式】
[0027] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0028] R :檢測起始至曲線振幅上升至2mm所需時間，對應(yīng)多種凝血因子逐步激活導(dǎo)致纖 維蛋白開始形成的過程。
[0029] K :曲線振幅由2mm上升至20mm所需時間，對應(yīng)纖維蛋白交聯(lián)及其與血小板的相互 作用。
[0030] Angel :描記圖最大曲線弧度的切線與水平線的夾角，與K時間共同反映纖維蛋白 與血小板的相互作用，在患者嚴(yán)重低凝K值無法測出的時候成為重要的替代指標(biāo)。
[0031] MA :最大振幅為描記圖最1?振幅，對應(yīng)血塊最大強(qiáng)度，與血小板濃度、血小板功能 以及血小板-纖維蛋白相互作用有關(guān)。
[0032] 由于觀察質(zhì)控品凝血過程以及凝血的4個主要參數(shù)R，K，A，MA值，就可以對血栓 彈力圖儀和血栓彈力圖檢測試劑盒進(jìn)行質(zhì)量控制，因此以下實施例中當(dāng)MA值達(dá)到穩(wěn)定，即 凝血過程完成后，就可以停止軟件運(yùn)行，不需要觀察纖溶過程。
[0033] 實施例1
[0034] 1、豬血漿的制備
[0035] 用電子天平分別稱取2. 0g、3. 0g、4. Og枸櫞酸鈉（AR)，分裝于3個1000 mL燒杯中。 各加入IOOm