用于治療和/或限制糖尿病發(fā)展的方法
【專利說明】用于治療和/或限制糖尿病發(fā)展的方法
[0001] 交叉引用
[0002] 本申請要求2012年12月18日提交的美國臨時專利申請系列No. 61/738835的優(yōu) 先權(quán)，該申請的全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0003] 介紹
[0004] 電壓門控的鈣（Cav)通道在β細(xì)胞的生理學(xué)和病理生理學(xué)中是重要的。它們不僅 在胰島素分泌的調(diào)節(jié)中處于中心階段，而且還通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的磷酸化、基因表達(dá)和細(xì)胞 周期而涉及β細(xì)胞的發(fā)育、生存和生長。β細(xì)胞〇^通道的功能和密度受到多種機制的調(diào) 節(jié)，這些機制是與其他類型的細(xì)胞所共有的，或者是β細(xì)胞所特有的，例如通道磷酸化、與 其他分子的相互作用以及葡萄糖代謝衍生的信號傳遞。功能失調(diào)的〇^通道導(dǎo)致β細(xì)胞 失效并且甚至死亡，這在大部分普通的代謝紊亂糖尿病中可證明。實際上，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo) 的自體免疫攻擊在1型糖尿病的β細(xì)胞死亡中起到關(guān)鍵作用。此外，1型糖尿病血清中的 因子迫使非生理學(xué)量的Ca2+通過β細(xì)胞Cav通道的過度活化而進入胰腺β細(xì)胞，導(dǎo)致β 細(xì)胞凋亡。毋庸置疑，該過程在自體免疫攻擊之上加重了疾病的發(fā)展。此外，此類因子還可 見于在2型糖尿病的血清中，其中它們以與1型糖尿病血清中相同的方式起作用。事實上， 在2型糖尿病狀況（例如在Goto-Kakizaki大鼠中的那些）中，出現(xiàn)β細(xì)胞質(zhì)量的降低和 β細(xì)胞Cav通道的過度活化。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 在一個方面中，本發(fā)明提供了用于識別限制糖尿病發(fā)展和/或治療糖尿病的候選 化合物的方法，其包含：
[0007] (a)在一種或多種測試化合物存在下，將胰島素分泌細(xì)胞的第一群體與有效增加 Cav通道的密度和/或傳導(dǎo)性的量的載脂蛋白CIII (Ap0CIII)相接觸；
[0008] (b)在一種或多種測試化合物存在下，將胰島素分泌細(xì)胞的第二群體與有效增加 Cav通道的密度和/或傳導(dǎo)性的量的Ap0CIII相接觸，并且進一步將胰島素分泌細(xì)胞的第二 群體與抑制B族I型清道夫受體（SRBI)的表達(dá)或活性的分子相接觸；以及
[0009] (c)識別陽性測試化合物作為用于限制糖尿病的發(fā)展和/或治療糖尿病的候選化 合物，其中所述的化合物在胰島素分泌細(xì)胞的第一群體中比在胰島素分泌細(xì)胞的第二群體 中更高程度地抑制了 Cav通道的密度和/或傳導(dǎo)性的、Ap0CIII誘導(dǎo)的增加。
[0010] 在一個實施方案中，所述的方法進一步包含在一種或多種候選化合物存在下，將 胰島素分泌細(xì)胞的第三群體與有效增加 CavI通道的密度和/或傳導(dǎo)性的量的Ap0CIII相 接觸，以及進一步將胰島素分泌細(xì)胞的第三群體與Cav2和/或Cav3通道阻斷劑相接觸，其 中所述的候選物為用于限制糖尿病的發(fā)展和/或治療糖尿病的優(yōu)選候選化合物，其中所述 的候選物在胰島素分泌細(xì)胞的第三群體中比在胰島素分泌細(xì)胞的第一群體中更高程度地 抑制了密度和/或傳導(dǎo)性的、Ap0CIII誘導(dǎo)的增加。
[0011] 在可以與本發(fā)明的任意一個實施方案結(jié)合的其他實施方案中，所述的方法進一步 包含在一種或多種候選化合物存在下，將胰島素分泌細(xì)胞的第四群體與有效增加 CavI通道 的密度和/或傳導(dǎo)性的量的Ap0CIII相接觸，以及進一步將胰島素分泌細(xì)胞的第四群體與 Src激酶抑制劑和/或蛋白質(zhì)激酶A抑制劑（PKA)相接觸，其中所述的這些候選化合物是用 于限制糖尿病發(fā)展和/或治療糖尿病的優(yōu)選候選化合物，其中所述的候選化合物在胰島素 分泌細(xì)胞的第一群體中比在胰島素分泌細(xì)胞的第四群體中更高程度地抑制了 CavI通道的 密度和/或傳導(dǎo)性的、Ap0CIII誘導(dǎo)的增加。
[0012] 在可以與本發(fā)明的任意一個實施方案結(jié)合的另一個實施方案中，所述的方法進一 步包含在一種或多種候選化合物存在下，將胰島素分泌細(xì)胞的第五群體與有效增加 CavI通 道的密度和/或傳導(dǎo)性的量的Ap0CIII相接觸，以及進一步將胰島素分泌細(xì)胞的第五群體 與抑制β 1整聯(lián)蛋白表達(dá)或活性的分子相接觸，其中那些候選化合物是用于限制糖尿病發(fā) 展和/或治療糖尿病的優(yōu)選候選化合物，其中所述的那些候選化合物在胰島素分泌細(xì)胞的 第一群體中比在胰島素分泌細(xì)胞的第五群體中更高程度地抑制了 CavI通道的密度和/或 傳導(dǎo)性的、ApoCIII誘導(dǎo)的增加。
[0013] 在第二個方面中，本發(fā)明提供了用于識別限制糖尿病發(fā)展和/或治療糖尿病的候 選化合物的方法，其包含：
[0014] a)在一種或多種測試化合物存在下，將胰島素分泌細(xì)胞的第一群體與有效增加 CavI通道的密度和/或傳導(dǎo)性的量的ApoCIII相接觸；以及
[0015] b)識別那些陽性測試化合物，與對照相比，該化合物在胰島素分泌細(xì)胞的第一群 體中抑制了 SRBI的表達(dá)或活性，其中所述的陽性測試化合物為用于限制糖尿病發(fā)展和/或 治療糖尿病的候選化合物。
[0016] 在一個實施方案中，所述的對照包含在一種或多種測試化合物缺乏下，將胰島素 分泌細(xì)胞的第二群體與有效增加 CavI通道的密度和/或傳導(dǎo)性的量的ApoCIII相接觸。該 實施方案可以包含例如將細(xì)胞的第二群體與配制物（例如緩沖劑）相接觸，其中所述的配 制物與溶解有測試化合物的配制物相似或一致。
[0017] 在本發(fā)明這些方面的任意一個方面的多種實施方案中（除非上下文另外作出明 確說明，否則所述的這些實施方案可以結(jié)合），所述的方法包含將所述的細(xì)胞與ApoCIII接 觸至少6個小時；所述的候選化合物為用于抑制I型糖尿病的發(fā)展和/或治療I型糖尿病 的候選化合物；和/或其中所述的候選化合物為用于抑制2型糖尿病的發(fā)展和/或治療2 型糖尿病的候選化合物。
[0018] 在第三個方面中，本發(fā)明提供了用于治療或限制糖尿病的發(fā)展的方法，其包含向 有需要的受試對象給藥有效量的SRBI表達(dá)和/或活性的抑制劑。在多種實施方案中，所述 的抑制劑選自抗SRBI抗體，抗SRBI適體，SRBI siRNA，SRBI shRNA，SRBI反義寡核苷酸， 和抑制SRBI表達(dá)和/或活性的小分子。
【附圖說明】
[0019] 圖1.載脂蛋白CIII溫育會增加 β細(xì)胞中CavI通道的密度和傳導(dǎo)性。（a)在與 媒介物溶液（作為對照）或載脂蛋白CIII (ApoCIII)溫育的小鼠小島β細(xì)胞的質(zhì)膜片中 檢測到的單位CavI通道電流的實例。（b)在質(zhì)膜片中測量的單位CavI通道的平均數(shù)量、開 放幾率、平均關(guān)閉時間和平均開放時間，其中所述的質(zhì)膜片附著在暴露于對照媒介物（η = 33)或ApoCIII (η = 32)的小鼠小島β細(xì)胞上。（c)在質(zhì)膜片中記錄的單位CavI通道電 流的實例，其中所述的質(zhì)膜片附著于對照RINm5F細(xì)胞或使用ApoCIII處理的細(xì)胞上。（d) 在對照RINm5F細(xì)胞（η = 34)或與Ap0CIII溫育的細(xì)胞（η = 35)的質(zhì)膜片上檢測的單位 CavI通道的平均數(shù)量、開放幾率、平均關(guān)閉時間和平均開放時間。與對照比，*P〈0. 05并且 **P〈0. 01。
[0020] 圖2.載脂蛋白CIII溫育會增加全細(xì)胞Ca2+電流，并且在RINm5F細(xì)胞中，與Ca vI 通道阻斷劑尼莫地平共溫育會廢除載脂蛋白CIII溫育的作用。（a)由與媒介物溶液（作 為對照）溫育的細(xì)胞（細(xì)胞電容：10.1 pF)和載脂蛋白CIII (Ap0CIII)處理的細(xì)胞（細(xì)胞 電容：11. IpF)得到的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（b)在對照細(xì)胞（空心圈，η = 26)和使 用Ap0CIII處理的細(xì)胞（實心圈，η = 26)中平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。與對照比， *Ρ〈0· 05并且**Ρ〈0· 01。（c)由尼莫地平（Nim)溫育的細(xì)胞（細(xì)胞電容：IOpF)以及一起暴 露于Nim和ApoCIII(Nim/ApoCIII)的細(xì)胞（細(xì)胞電容：11.9pF)得到的樣品全細(xì)胞Ca2+電 流追蹤。（d)在Nim處理的細(xì)胞（空心圈，η = 20)以及與Nim/ApoCIII溫育的細(xì)胞（空心 圈，η = 21)中，平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。與單獨的Nim比，*P〈0. 05和#P〈0. 01。
[0021] 圖3.在RINm5F細(xì)胞中，PKA或Src激酶抑制少量地降低了全細(xì)胞Ca2+電流的、載 脂蛋白CIII誘導(dǎo)的增強，但是PKC抑制不影響該增強。（a)由與媒介物溶液（作為對照） 溫育的細(xì)胞（細(xì)胞電容：8. 5pF)、載脂蛋白CIII (Ap0CIII)處理的細(xì)胞（細(xì)胞電容：8. 2pF) 和暴露于ApoCIII加 PKA抑制劑H-89的細(xì)胞（ApoCIII/H-89,細(xì)胞電容：8. 4pF)得到的樣 品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（b)在對照細(xì)胞（空心圈，η = 37)和使用Ap0CIII處理的細(xì)胞 (實心圈，η = 36)或使用ApoCIII/H-89處理的細(xì)胞（實心三角形，η = 36)中平均Ca2+電 流密度-電壓的關(guān)系。與對照比，*Ρ〈〇. 05并且**Ρ〈0. 01。（c)由對照細(xì)胞（細(xì)胞電容： 12. 5pF)、ApoCIII溫育的細(xì)胞（細(xì)胞電容：12. OpF)和經(jīng)過ApoCIII和PKC抑制劑卡弗他 ?。╟alphostin)C共處理的細(xì)胞（ApoCIII/CalpC，細(xì)胞電容：12. IpF)中登記的樣品全細(xì)胞 Ca2+電流追蹤。（d)在對照細(xì)胞（空心圈，η = 33)、ApoCIII處理的細(xì)胞（實心圈，η = 33) 和暴露于ApoCIII/CalpC的細(xì)胞（實心三角形，η = 33)中平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān) 系。ApoCIII 與對照比，*Ρ〈(λ 05 并且#Ρ〈(λ 01。ApoCIII/CalpC 與對照比，*Ρ〈(λ 05 并且 **Ρ〈0· 01。（e)由對照細(xì)胞（細(xì)胞電容：9. 5pF)、ApoCIII溫育的細(xì)胞（細(xì)胞電容：9. 2pF) 以及一起暴露于ApoCIII和Src激酶抑制劑PP2的細(xì)胞（ApoCIII/PP2,細(xì)胞電容：10.0 pF) 中獲得的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（f)在對照細(xì)胞（空心圈，η = 40)和使用ApoCIII 溫育的細(xì)胞（實心圈，η = 40)或使用Ap〇CIII/PP2溫育的細(xì)胞（實心三角形，η = 40)中 平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。ApoCIII與對照比，**Ρ〈0. 01。ApoCIIΙ/ΡΡ2與對照比，+Ρ〈0. 05。
[0022] 圖4.在RINm5F細(xì)胞中，PKA、PKC和Src激酶的結(jié)合抑制會抵消全細(xì)胞Ca2+電流 的、載脂蛋白CIII誘導(dǎo)的增益，并且PKA和Src激酶的共抑制足以獲得這種抵消。（a)由 媒介物溫育的細(xì)胞（對照，細(xì)胞電容：7. 9pF)、在載脂蛋白（ApoCIII)處理后的細(xì)胞（細(xì)胞 電容：7. OpF)以及在H-89,卡弗他丁 C和PP2的蛋白質(zhì)激酶抑制劑混合物存在下暴露于 ApoCIII的細(xì)胞（ApoCIII/H-89/CalpC/PP2,細(xì)胞電容：7. 2pF)中登記的樣品全細(xì)胞Ca2+電 流追蹤。（b)在對照細(xì)胞（η = 35)和暴露于ApoCIII的細(xì)胞（η = 34)或暴露于ApoCIII/ H-89/CalpC/PP2的細(xì)胞（η = 35)中平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。與對照和apoCIII/ H-89/CalpC/PP2比，*Ρ〈0· 05。（c)由對照細(xì)胞（細(xì)胞電容：8. 5pF)、ApoCIII處理后的細(xì) 胞（細(xì)胞電容：8. 2pF)和在蛋白質(zhì)激酶抑制劑H-89和PP2存在下暴露于ApoCIII的細(xì)胞 (Ap〇CIII/H-89/PP2,細(xì)胞電容：8. 7pF)中得到的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（d)在對照細(xì) 胞（η = 26)和經(jīng)歷 ApoCIII 的細(xì)胞（η = 26)或經(jīng)歷 ApoCIII/H-89/PP2 的細(xì)胞（η = 27) 中平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。與對照比，*Ρ〈0. 05和#P〈0. 01 ;與ApoCIII/H-89/ PP2 比，+Ρ〈0· 05〇
[0023] 圖5.載脂蛋白CIII溫育不能改變β細(xì)胞CavI通道的表達(dá)。（a) RINm5F細(xì)胞細(xì)胞 勻漿的代表性印跡，其中所述的勻漿經(jīng)過與媒介物（作為對照）或載脂蛋白CIII (ApoCIII) 溫育，在分別使用抗CavL 2,抗CavL 3和抗GAPDH抗體探測。（b)在RINm5F細(xì)胞勻漿中， 與對照相比（空心柱，η = 6)，CavL 2 (條紋柱，η = 6)和CavL 3亞單元（實心柱，η = 6) 的相對豐度的免疫印跡定量，其中所述的勻漿經(jīng)過ApoCIII溫育。在對照細(xì)胞和與ApoCIII 溫育的細(xì)胞之間，總的CavL 2和CavL 3亞單元的相對豐度不具有顯著的差異（P>0. 05)。
[0024] 圖6.在RINm5F細(xì)胞中，敲除β 1整聯(lián)蛋白會廢除全細(xì)胞Ca2+電流的、載脂蛋白 CIII誘導(dǎo)的擴大。（a)在β 1整聯(lián)蛋白siRNA#l-、陰性對照siRNA(NC siRNA)-和β 1整聯(lián) 蛋白siRNA#2-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，β 1整聯(lián)蛋白-和GAPDH-免疫反應(yīng)條帶的代表性印跡。（b) 在NC siRNA-(空心柱，η = 6)，β 1整聯(lián)蛋白siRNA#l-(條紋柱，η = 6)和β 1整聯(lián)蛋白 siRNA#2-轉(zhuǎn)染的RINm5F細(xì)胞中，β 1整聯(lián)蛋白的免疫印跡定量。（c)分別在模擬轉(zhuǎn)染和與 對照媒介物溫育（無 siRNA/對照，細(xì)胞電容：12. IpF)、NC siRNA轉(zhuǎn)染和對照媒介物處理 (NC siRNA/對照，細(xì)胞電容：11. 4pF)、NC siRNA轉(zhuǎn)染和載脂蛋白Cin(ApoCIII)溫育（NC siRNA/ApoCIII，細(xì)胞電容：12. lpF)、β 1整聯(lián)蛋白siRNA轉(zhuǎn)染和暴露于媒介物溶液（β 1 整聯(lián)蛋白siRNA/對照，細(xì)胞電容：11. 9pF)、以及β 1整聯(lián)蛋白siRNA轉(zhuǎn)染和ApoCIII暴露 (β 1整聯(lián)蛋白siRNA/ApoCIII，細(xì)胞電容：12. 4pF)后，在單個細(xì)胞中登記的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（d)在經(jīng)歷無 siRNA/對照（實心圈，η = 29)、NC siRNA/對照（空心圈，η = 28)、NC siRNA/apoCIII (實心三角形，η = 28)、β 1整聯(lián)蛋白siRNA/對照（空心三角形，η =29)和β 1整聯(lián)蛋白siRNA/ApoCIII (實心方形，η = 29)的細(xì)胞中，Ca2+電流密度-電 壓的關(guān)系。與無 siRNA/對照，NC siRNA/對照和β 1整聯(lián)蛋白siRNA/對照比，*Ρ〈0. 05和 **Ρ〈0· 01。與 β 1 整聯(lián)蛋白 siRNA/ApoCIII 比，+Ρ〈0· 05。
[0025] 圖7.在RINm5F細(xì)胞中，敲除SRBI會防止全細(xì)胞Ca2+電流的、載脂蛋白CIII誘 導(dǎo)的增強。（a)在SRBI siRNA-和陰性對照siRNA (NC siRNA)-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，GAPDH-和 GAPDH-mRNA條帶的代表性印跡。（b)在NC siRNA-(空心柱，η = 6)和SRBI siRNA-轉(zhuǎn)染 的RINm5F細(xì)胞（實心柱，η = 6)中，SRBI蛋白質(zhì)的定量免疫印跡測量。與NC siRNA比， **Ρ〈0. 01。（c)在 SRBI siRNA-和陰性對照 siRNA (NC siRNA)-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，SRBI-和 GAPDH-免疫反應(yīng)條帶的樣品印跡。（d)在NC siRNA-(空心柱，η = 7)和SRBI siRNA-轉(zhuǎn)染 的 RINm5F 細(xì)胞（實心柱，η = 7)中，SRBI mRNA 的定量。與 NC siRNA 比，**Ρ〈0· 01。（e) 分別在模擬轉(zhuǎn)染和與對照媒介物溫育（無 siRNA/對照，細(xì)胞電容：13. 87pF)、NC siRNA轉(zhuǎn) 染和對照媒介物處理（NC siRNA/對照，細(xì)胞電容：13. 18pF)、NC siRNA轉(zhuǎn)染和載脂蛋白 CIII(ApoCIII)溫育（NC siRNA/ApoCIII，細(xì)胞電容：13.53pF)、SRBI siRNA 轉(zhuǎn)染和暴露于 媒介物溶液（SRBI siRNA/對照，細(xì)胞電容：12. 90pF)、以及SRBI siRNA轉(zhuǎn)染和ApoCIII暴露 (SRBI siRNA/ApoCIII，細(xì)胞電容：13. OlpF)后，由單個細(xì)胞得到的代表性全細(xì)胞Ca2+電流 追蹤。（f)在經(jīng)歷無 siRNA/對照（實心圈，η = 30)、NC siRNA/對照（空心圈，η = 29)、NC siRNA/apoCIII (實心三角形，η = 30)、SRBI siRNA/ 對照（空心三角形，η = 29)和 SRBI 以1^^/^?〇(：111(實心方形，11 = 30)的細(xì)胞中，0&2+電流密度-電壓的關(guān)系。與無以1^^/對 照，從：811?熟/對照和51?1811?熟/對照比，撲〈0.05和*撲〈0.01。與51?1811?熟/^口〇(：111 比，+P〈0. 05。
[0026] 圖8.在基礎(chǔ)條件下，在RINm5F細(xì)胞中，PKA、PKC或Src激酶抑制不會改變?nèi)?xì)胞 Ca2+電流。（a)由媒介物處理的細(xì)胞（作為對照）（細(xì)胞電容：8. 8pF)和暴露于H-89的細(xì) 胞（細(xì)胞電容：8. 5pF)得到的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（b)在對照細(xì)胞（空心圈：η = 20)和與Η-89溫育的細(xì)胞（實心圈，η = 20)中，平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。（c)在 對照細(xì)胞（細(xì)胞電容：10. 4pF)和經(jīng)過卡弗他丁 C溫育的細(xì)胞（CalpC，細(xì)胞電容：11. OpF) 中記錄的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（d)在對照細(xì)胞（空心圈：η = 29)和暴露于CalpC的 細(xì)胞（實心圈，η = 29)中平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。（e)在對照細(xì)胞（細(xì)胞電容： 9. OpF)和PP2-處理的細(xì)胞（細(xì)胞電容：9. IpF)中獲得的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（f) 在對照細(xì)胞（空心圈m = 20)和與PP2溫育的細(xì)胞（實心圈，η = 19)中的平均Ca2+電流 密度-電壓的關(guān)系。
[0027] 圖9.在基礎(chǔ)條件下，在RINm5F細(xì)胞中，PKA、PKC和Src激酶的結(jié)合抑制、或者PKA 和Src激酶的共抑制不會影響全細(xì)胞Ca2+電流。（a)由與媒介物溶液溫育的細(xì)胞（對照，細(xì) 胞電容：10. 8pF)中、以及在使用H-89,卡弗他丁 C和PP2的蛋白質(zhì)激酶抑制劑混合物處理 的細(xì)胞（H_89/CalpC/PP2,細(xì)胞電容：9. 7pF)中獲得的樣品全細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（b)在對 照細(xì)胞（空心圈：η = 30)和使用H-89/CalpC/PP2處理的細(xì)胞（實心圈，η = 30)中，平均 Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。（c)在媒介物處理的細(xì)胞（對照，細(xì)胞電容：9. 4pF)中和使用 蛋白質(zhì)激酶抑制劑H-89和PP2處理的細(xì)胞（H-89/PP2,細(xì)胞電容：9. IpF)中獲得的樣品全 細(xì)胞Ca2+電流追蹤。（d)在對照細(xì)胞（空心圈：η = 24)和使用H-89/PP2處理的細(xì)胞（實 心圈，η = 24)中，平均Ca2+電流密度-電壓的關(guān)系。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 所述的所有參考文獻均以引用方式全文并入本文。在本申請中，除非另外說 明，否則所用的技術(shù)可以在多個公知的參考文獻的任意一個中找到，例如：Mo I e c u I ar Cloning:A LaboratoryManual(Sambrook, et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology(Methods in Enzymology, Vol. 185,edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification''in Methods in Enzymology(M. P. Deutshcer, ed. , (1990)Academic Press, Inc.) ；PCR Protocols : A Guide to Methods andApplications(Innis, et al. 1990.Academic Press, San Diego, CA), Culture ofAnimal 細(xì)胞 s: A Manual of Basic Technique, 2ndEd. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc. , Clifton, N. J.),和 theAmbion 1998Catalog(Ambion, Austin, TX)〇
[0030] 除非上下文另外明確要求，否則在整個說明書和權(quán)利要求書中，詞語"comprise"、 "comprising"等解釋成包含一切的含義，這與專用的或詳盡的含義相反，換言之，是"包含 但不限于"的含義。此外，使用單數(shù)或復(fù)數(shù)的詞語分別包含復(fù)數(shù)或單數(shù)的數(shù)量。此外，當(dāng)詞 語"此處"、"上文"和"下文"以及類似意義的詞語用于本申請中時，將是指本申請作為一個 整體，而不是指本申請的任何特定的部分。
[0031] 如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否則單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包含 復(fù)數(shù)指示物。如本文所用，除非另外明確說明，否則"和"與"或"可交換使用。
[0032] 除非上下文另外清楚地指出，否則本發(fā)明的任何方面的所有實施方案都可以結(jié)合 使用。
[0033] 在第一個方面中，本發(fā)明提供